为什么量化事项:表型的表征在果蝇幼虫神经肌肉接头

该方法的总体目标是展示如何对解剖特征进行定量分析。证明了影响果蝇幼虫横纹肌的细胞核形态、大小和位置的表型的定量。了解控制细胞内细胞器形态、大小和分布的分子机制是现代生物学最重要的问题之一。

过去，实验组之间和实验组内的形态学变化仅进行定性分析。在这里，我们提出在定量分析中，将果蝇遗传学与形态学定量分析相结合，以识别控制肌肉内细胞核大小、形状和分布的基因。帮助演示该程序的是我实验室的研究生 Leire Ledahawski。

按照文本方案解剖和染色幼虫神经肌肉接头后，使用镊子从 1.5 毫升微量离心管中取出样品，并将它们放在处理载玻片上。使用显微解剖剪刀，从鱼片上剪下头部和尾部，并保持其内表面向上。现在，通过将三条纤维素胶带缠绕在相距 1 厘米的干净载玻片上来准备安装载玻片。

将盖玻片放在提供的间隙上，这样它就不会使样品变平。然后，在纤维素带条之间沉积约 20 微升的封固剂，并用干净的镊子将培养基铺开。现在从制备物中取出多余的组织。

将解剖的幼虫从加工载玻片上拖到安装载玻片上并放入安装介质中，保持内表面向上。接下来，轻轻地贴上盖玻片，小心避免滞留空气。然后用透明指甲油密封载玻片，让载玻片干燥至少 10 分钟，然后再成像。

对于此分析，使用共聚焦图像显示用 DeVAP 抗体、核纤层蛋白和核标志物染色的幼虫体壁肌肉。然后将共聚焦 Z 堆栈图像拖放到竞技场中。双击图像以在 Surpass 视图中自动打开它们，该视图可通过工具栏图标访问。

Surpass 视图有三个主要的工作空间面板。View （视图） 区域、Object List （对象列表） 和 Object Properties （对象属性） 区域。接下来，单击 3D 视图图标以创建体积渲染的三通道图像。

然后从 Objects 工具栏中选择 Add New Measurement Points，并按照 Object Properties 区域中的 Creation Wizard 进行作。首先选择 Edit 选项卡，然后从 Specific Channel 中选择核标记或 lamin 通道以突出显示细胞核。接下来，通过按 Escape 选项卡将指针设置为"选择"模式，然后使用鼠标滚轮调整 3D 光标框的大小，以在图像中包含给定的细胞核。

通过按住 Shift 键并左键单击同一 Nucleu 来添加测量点。然后，使用相同的技术在同一肌肉的附近核心上添加第二个点。两点之间将自动画一条线，两个原子核之间的距离将显示并记录为统计变量。

对给定细胞核周围的所有细胞核重复该过程。然后，从 Statistics Detailed Distance Data 下的所有收集的测量点中选择最短距离。在 Object Properties 区域下，选择选项 Export Statistics with Tab Display to File 可用。

这会将数据保存到电子表格中。对于此分析，使用用核纤层蛋白和核标记染色的体壁肌肉的共聚焦图像来可视化细胞核。为了评估肌核的形状，请测量它们的球形度，这将核表面积与具有相同体积的球体的表面积进行比较。

或者，测量椭圆度，以区分长球体、扁球体或椭球体和球体。如前所述打开图像。然后，单击 Objects 工具栏图标 Add New Surfaces。

在 Object Properties （对象属性） 区域中显示的 Creation Wizard （创建向导） 中，选择细胞核标记物染色作为源通道以显示细胞核。将选项 Absolute Intensity （绝对强度） 设置为阈值。通过更改阈值曲线上的值，确保大多数 Nuclei 显示平滑、非过载的渲染。

同时，避免任何细胞核的孔或不完整的掩模的存在。接下来，使用 Filter （过滤器） 工具从表面渲染中去除噪点。在新创建的表面层的 Edit 选项卡下，拆分错误渲染的 Nuclei 表面。

另一种选择是合并渲染不正确的核曲面。表面渲染的原子核的椭圆度和球度值位于 Statistics 选项卡下。导出此数据以进行分析。

对于该方案，使用共聚焦图像报告用核标记物和对 lamin 和 DeVAP 特异性抗体染色的体壁肌肉。从主菜单项中打开感兴趣的图像 编辑 ，然后 裁剪 3D。按照 Surface Creation Wizard 使用层状槽钢，如上一节所述。

创建表面后，单击 Objects Properties 区域中的 Edit，然后选择 Mask All 以隔离原子核内的信号。接下来，选择 DeVAP 信号。从 选择通道 下拉菜单中，单击选项 设置表面外部的体素 并将该值设为零。

这将在 Display Adjustment （显示调整） 窗口中创建一个新的蒙版通道。要可视化原子核内存在的信号，请单击 Objects 工具栏中的 Add New Clipping Plane 图标来创建轮廓平面。然后，以交互方式调整裁剪平面的角度及其位置，以可视化原子核内信号的分布。

人 VAMP 相关蛋白 B 中的错义突变与 ALS 发病机制有关。使用所描述的方法，将表达携带导致突变 V2601 的 ALS 的苍蝇直系同源基因 DeVAP 的横纹肌与表达相当水平的野生型 DeVAP 或更高水平的野生型 DeVAP 的对照进行比较。最近邻分析用于评估细胞核沿肌肉纤维的分布。

与表达突变的 DeVAP 转基因或过度表达野生型蛋白的对照肌肉相比，感兴趣的突变导致细胞核之间的平均最短距离急剧减少。接下来，检查了原子核的球形度。研究发现，减小细胞核间距的转基因也会增大细胞核体积。

细胞核的 3D 重建和体积渲染显示，表达感兴趣突变的肌肉形成位于细胞核中的簇。该方法还可以扩展到与其他细胞器（如线粒体）相关的形态特征的定量分析。核结构、位置和大小的变化与衰老和许多神经退行性疾病有关，例如帕金森病和 ALS。

了解不良行为的分子机制可能有助于确定有效治疗干预的新药理学靶点。