为何定量至关重要：在表型水平上的特征描述 果蝇 幼虫神经肌肉接头

本方法学的总体目标是展示如何对解剖学性状进行定量分析。文中演示了对影响果蝇幼虫横纹肌细胞核形态、大小及位置的表型进行量化的方法。理解调控细胞内细胞器形态、大小及分布的分子机制，是现代生物学最重要的科学问题之一。

过去，实验组间及组内的形态学差异仅能进行定性分析。本文中，我们提出一种定量分析方法，将果蝇遗传学与形态测量学定量分析相结合，以鉴定控制肌肉内细胞核大小、形状及分布的基因。本实验操作的演示由本实验室的研究生 Leire Ledahawski 协助完成。

按照文本方案解剖并染色幼虫神经肌肉接头后，使用镊子将样品从1.5毫升微量离心管中取出，放置于处理载玻片上。用显微解剖剪刀剪除肌片的头部和尾部，并使组织内表面朝上。接下来，取一支洁净载玻片，每隔一厘米缠绕三条纤维素胶带，制备成加样载玻片。

将盖玻片置于该间隙上方，以免压平样品。然后，在纤维素胶带条之间滴加约 20 µL 封片介质，并用洁净的镊子将介质铺匀。接着去除制片上多余的组织。

将解剖好的幼虫从处理载玻片转移至封片载玻片，并放入封片介质中，保持其内表面朝上。接着，轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。然后用透明指甲油密封载玻片，并在成像前至少干燥10分钟。

进行此分析时，使用显示经 DeVAP 抗体、lamin 抗体及核标记物染色的幼虫体壁肌肉的共聚焦图像。然后将共聚焦 Z 轴层扫图像拖放到操作区域中。双击图像可自动在“Surpass”视图中打开，该视图可通过工具栏图标访问。

Surpass 视图包含三个主要工作区面板：视图区域、对象列表和对象属性区域。接下来，单击 3D 视图图标以生成三维渲染的三通道图像。

然后从“对象”工具栏中选择“添加新测量点”，并按照“对象属性”区域中的创建向导进行操作。首先选择“编辑”选项卡，然后在“特定通道”中选择核标记或层蛋白通道，以高亮显示细胞核。接下来，按下 Esc 键将指针设置为“选择”模式，再使用鼠标滚轮调整 3D 光标框的大小，使其包含图像中的特定细胞核。

通过按住 Shift 键并在同一细胞核上单击鼠标左键来添加一个测量点。然后，使用相同的技术在同块肌肉的邻近细胞核上添加第二个点。两点之间将自动绘制一条线，并显示且记录两个细胞核之间的距离，作为一项统计变量。

对给定细胞核周围的所有细胞核重复该步骤。然后，在“统计详细距离数据”下的所有采集测量点中，选择最短距离。在“对象属性”区域，选择“导出统计结果至文件（以制表符分隔）”选项。

这会将数据保存到电子表格中。对于本分析，使用经层粘连蛋白（lamin）和核标记物染色的体壁肌肉的共聚焦图像来观察细胞核。为评估肌核的形态，测量其球形度，该参数将细胞核的表面积与相同体积的球体表面积进行比较。

或者，测量能够区分长球体、扁球体、椭球体和球状体的椭圆率。按照之前所述方法打开图像，然后点击对象工具栏图标“添加新表面”。

在“对象属性”区域出现的创建向导中，选择核标记染色作为显示细胞核的源通道。将阈值选项设为“绝对强度”。通过调整阈值曲线上的数值，确保大多数细胞核呈现平滑且未过载的渲染效果。

同时，避免出现任何细胞核的孔洞或不完整掩膜。接下来，使用滤波工具去除表面渲染中的噪声。在新创建的表面层的“编辑”选项卡下，分割错误渲染的细胞核表面。

另一种选择是合并那些渲染错误的细胞核表面。在“统计”选项卡下可以查看表面渲染后细胞核的椭圆度和球形度数值。请导出该数据以供分析。

对于本实验方案，使用报告体壁肌肉的共聚焦图像，这些肌肉经核标记物以及特异性针对lamin和DeVAP的抗体染色。从主菜单的“Edit”项中打开感兴趣的图像，然后进行3D裁剪。按照前一节所述，使用lamin通道运行表面创建向导。

表面创建完成后，点击“对象属性”区域中的“编辑”，然后选择“掩膜全部”以分离细胞核内部的信号。接着，选择DeVAP信号。在“选择通道”下拉菜单中，点击“设置表面外部体素”选项，并将该值设为零。

这将在“显示调整”窗口中创建一个可用的新蒙版通道。为了可视化细胞核内信号的存在情况，可点击“对象”工具栏中的“添加新裁剪平面”图标来创建一个轮廓平面。随后，通过交互方式调整裁剪平面的角度和位置，以观察信号在细胞核内的分布情况。

人类VAMP相关蛋白B的错义突变与肌萎缩侧索硬化症（ALS）的发病机制有关。利用所述方法，将表达携带导致ALS的V260I突变果蝇同源基因DeVAP的横纹肌与对照组进行比较，对照组表达与之相当水平的野生型DeVAP或更高水平的野生型DeVAP。采用最近邻分析法评估肌纤维上细胞核的分布情况。

与表达突变型DeVAP转基因或过表达野生型蛋白的对照肌肉相比，所关注的突变导致细胞核间平均最短距离显著减小。接下来检测了细胞核的球形度，发现那些减小细胞核间距的转基因同时会增大细胞核体积。

对细胞核进行三维重建和体积渲染结果显示，表达目标突变的肌肉细胞在细胞核内形成聚集。该方法还可拓展用于其他细胞器（如线粒体）相关形态特征的定量分析。细胞核结构、位置和大小的改变与衰老以及多种神经退行性疾病（如帕金森病和肌萎缩侧索硬化症）相关。

阐明导致运动障碍的分子机制可能有助于发现新的药物治疗靶点，从而实现有效的治疗干预。