Name: 研究卡埃纳哈布迪炎细胞结构和细胞形态学的定量方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习使用CellProfiler和Fiji软件对秀丽隐杆线虫C. elegans进行突触大小、肌肉形态和线粒体形状的定量分析。该方法为评估基因突变引起的细胞结构变化提供了客观可靠的图像处理方案。

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我们感谢Neumann实验室成员提供的宝贵讨论和建议。部分菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。作者感谢WormBase提供了关于C. elegans的丰富信息，并感谢莫纳什大学莫纳什显微成像中心提供仪器设备、培训和技术支持。本研究得到了CMTAA研究基金（2015年和2018年）以及授予B.N.的NHMRC项目基金1101974和1099690的支持。

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li>
<li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li>
<li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li>
<li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li>
<li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li>
<li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ilastik%3A+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%222011+IEEE+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%3A+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+image+restoration+and+segmentation%3A+A+generalized+linear+model%2Fbregman+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li>
<li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li>
<li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li>
<li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li>
<li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li>
<li>Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17%2F%CE%B1TAT1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBird%2C+TD+%22Charcot-Marie-Tooth+Neuropathy+Type+2%22">Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2</a>. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).</li>
<li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li>
<li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural%2C+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584(2019).</li>
<li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li>
<li>Zhu, P. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li>
<li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff%2C+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li>
<li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li>
<li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

形态学变异的评估通常通过手动计数明显差异，或使用任意阈值来判断与野生型表型相比的缺陷。然而，近年来，定量方法已被用于形态学的比较研究，以无偏倚地准确测量和描述细胞及亚细胞水平上的变化。识别表型之间细微但具有生物学意义的差异，是理解由环境因素或遗传疾病引起的形态变化背后分子机制的有力手段。计算能力的持续提升和显微成像分辨率的提高，结合秀丽隐杆线虫（C. elegans）遗传学易于培养和多用途的优势，为复杂的免费成像软件与精细的共聚焦图像相结合提供了理想平台。本文中，我们展示了在多种遗传背景下评估和量化突触大小及蛋白质定位、体壁肌面积与肌纤维长度以及线粒体形态的方法。
尽管这些分析方法已展现出量化细微形态学差异的能力，但仍存在一定的局限性。虽然每种分析方法都使用了开源且易于获取的软件，但它们依赖高质量、高清晰度的图像，以准确分辨细胞结构和亚细胞器。这常常成为限制因素，因为需要使用敏感的高端设备（如配备先进探测器的共聚焦显微镜）才能获得满足分辨率要求的图像。这类设备并非所有实验室都能获得，而使用性能不足的技术进行分析可能导致结果不准确且不可重复。此外，尽管每种技术都旨在...

线虫 秀丽隐杆线虫 （秀丽隐杆线虫） 作为一种模式生物系统，其在揭示人类疾病相关的生物学和分子过程中的应用日益广泛。成年线虫体长略超过1毫米，可产生多达300枚卵的大量后代。1孵化后， 秀丽隐杆线虫 仅需 3-4 天即可发育至成虫，寿命约为 2 至 3 周2由于其易于培养， 秀丽隐杆线虫 目前，该动物模型是进行低成本、快速药物筛选以发现人类疾病治疗方法最受追捧的体内模型之一。此外，其基因的高度保守性、明确的行为学范式、通体透明便于荧光或光学显微镜观察，以及易于进行遗传操作等特点，使其成为研究基因突变所导致的细胞与分子效应的理想选择。3。该 秀丽隐杆线虫 基因组与人类基因的直系同源性约为60%至80%，其中约40%的基因已知与疾病相关。部分已在该模型中建立并研究的人类疾病包括 秀丽隐杆线虫 包括神经退行性疾病（阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、腓骨肌萎缩症）、肌肉相关疾病（杜氏肌营养不良症）和代谢性疾病（高血糖）2,4在大多数人类疾病中，会引发细胞和细胞器的定位及形态学改变，这些变化可在线虫模型中 easily 进行评估。
荧光标记已广泛用于在显微镜下对组织和细胞器进行动态可视化标记。然而，在C. elegans中，评估由基因突变引起的形态学异常的传统方法在很大程度上依赖于视觉描述。虽然定性评估能够涵盖更广泛的表型描述（如突触形态、GFP 聚集、特定轴突形状、肌纤维厚度等），并提供形态变化的总体概览，但其在比较不同组别之间细微差异方面效果较差。此外，定性评估基于视觉和主观判断，可能导致对形态异常的过高或过低估计。最后，定性观察在不同个体之间也可能存在显著差异，从而导致数据重复困难。&#160;
近年来，已开发出多种易于使用且 readily available 的计算算法，可对图像进行定量分析。然而，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究中，此类图像分析软件在某些形态学研究中的应用仍相对滞后，尤其是在体壁肌肉和线粒体相关研究方面。为了改进对 C. elegans 中基础结构的分析，本研究尝试使用了一些 readily available 的开源图像分析软件，以定量比较基因突变对肌肉中线粒体、体壁肌肉以及突触形态的影响。这些实验流程详细说明了如何利用这些程序（Fiji、ilastik、CellProfiler、SQUASSH）来评估基因突变导致的突触大小及突触蛋白定位的变化、体壁肌肉面积与肌纤维长度，以及线粒体的大小和圆形度。&#160;

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Merck</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td>倒置平台</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Zeiss Axio Imager M2</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 #1</td><td>Thermo scientifique</td><td>MENCS22221GP</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 #1.5</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td>由 SCHOTT 生产</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermo scientifique</td><td>MENS41104A/40</td><td></td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>Schott</td><td>KL 300 LED</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨（酪蛋白胨）</td><td>Merck</td><td>107213</td><td>LB 培养基（Lysogeny Broth）成分</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Merck</td><td>103753</td><td>LB 培养基（Lysogeny Broth）成分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>LB 培养基（Lysogeny Broth）成分</td></tr><tr><td>蛋白胨（肉源蛋白胨）</td><td>Merck</td><td>107214</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck</td><td>102382</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Merck</td><td>105101</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>线虫生长培养基（NGM）琼脂成分</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>M9 缓冲液成分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>M9 缓冲液成分</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>M9 缓冲液成分</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>M9 缓冲液成分</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Corning</td><td>CLS7095D5X-200EA</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>CLS430589-500EA</td><td></td></tr><tr><td>铂金丝</td><td>Sigma</td><td>267201-2G</td><td></td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Met-app</td><td>2616</td><td></td></tr><tr><td>盐酸四咪唑</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

明确疾病背后的细胞机制对于开发新型治疗方法至关重要。为揭示这些机制，常用策略是引入候选基因的突变，并对组织和细胞器形态的变化进行定性描述。然而，定性描述可能无法捕捉细微的表型差异，可能误判群体中个体间的表型变异，且通常依赖主观评估。本文介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜结合商用生物图像处理软件，对线虫 Caenorhabditis elegans 的组织和细胞器形态进行定量分析的方法。通过定量分析影响突触完整性（大小和整合荧光强度）、肌肉发育（肌细胞大小和肌球蛋白丝长度）以及线粒体形态（圆形度和大小）的表型，以理解基因突变对这些细胞结构的影响。这些定量方法不仅限于本文所述的应用，还可广泛用于对线虫及其他模式生物中其他组织和细胞器形态的定量评估。

C. elegans 由于其结构简单、细胞谱系明确、通体透明且拥有丰富的研究工具，是研究不同组织和细胞器形态的理想模式生物。本文介绍了利用活体荧光成像和免费生物图像处理软件，对细胞器（例如线粒体）以及突触和肌肉等组织进行定量分析的研究方法。
MEC-17 表达的严格调控对正常突触发育是必需的
为了进一步理解α-微管蛋白乙酰转移酶MEC-1714,15,16在神经系统中的功能，我们研究了在C. elegans中过表达该蛋白的触觉感受神经元中的突触形态17。这些细胞结构对神经元功能至关重要，因为它们能够将信号传递给相邻的神经元。使用激光扫描共聚焦显微镜采集PLM突触的图像，并利用可获取的生物图像处理软件进行定量形态学分析（<...

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在&#160;C. elegans&#160;中开展的研究，能够对因基因突变所导致的组织和细胞器结构变化程度进行定量比较。

阐明疾病背后所涉及的细胞机制，对于开发新型治疗方法至关重要。一种常用于揭示这些机制的策略是……

量化组织和细胞器形态变化的能力对于理解基因功能以及遗传突变的影响具有重要意义。我们的实验方案详细说明了如何利用免费软件对线虫秀丽隐杆线虫（C.elegans）中突触、肌肉和线粒体的形态进行非主观性评估。以往许多研究依赖于定性方法来比较形态学变化。然而，这些方法可能存在一些问题，因为它们可能无法捕捉细微的表型差异，对变化的估计可能过高或过低，且评估过程具有主观性。我们的定量方法为评估形态学变化提供了更可靠且偏差更小的手段。这些方法可轻松用于研究其他细胞结构或模式生物中的形态学变化，从而定义基因功能以及疾病相关突变所导致的后果。首先准备用于成像的载玻片。将一滴融化的琼脂糖置于显微镜载玻片上，立即用另一张载玻片轻轻按压液滴，使琼脂糖均匀展平。静置干燥一分钟，然后小心分开两张载玻片，将凝固的琼脂糖垫保留在其中一张载玻片上。将载玻片置于显微镜载物台上，并在琼脂糖垫的中央加入5至10毫升麻醉剂液滴。使用经热灭菌的挑针，在溶液干燥前迅速将10至15只动物从保存培养皿转移至麻醉液滴中。然后，将盖玻片置于琼脂糖垫上方，轻轻放下，使其自然覆盖。使用配备488纳米和552纳米光泵浦半导体二极管激光器的线扫描共聚焦显微镜，并结合图像采集软件，对突触区域进行成像。找到线虫后，切换至40倍物镜并加入浸油介质。通过552纳米激光（tagRFP荧光团使用1%功率）和488纳米激光（GFP荧光团使用2%功率）激发荧光团，以观察突触区域。使用混合型光电探测器采集图像，并设置增益以防止荧光染料过曝。根据物镜选择最佳 Z 轴步长，采集覆盖整个突触的 Z 层叠图像。为分析突触区域，首先将图像载入 CellProfiler 3.1.5 软件中。设置 NameAndType 模块，并通过使用来自 UIS-115 转基因表达的弥散性 tagRFP 手动定义突触区域。通过向流程中添加 MeasureObjectSizeShape 和 MeasureObjectIntensity 模块，测量手动定义的突触的大小和荧光强度。然后通过添加 CalculateMath 模块，将 JSIS37 获得的积分荧光强度单位除以 UIS-115 获得的积分荧光强度单位，计算相对积分荧光强度。完成测量后，导出所有测量结果和计算数据。要测量肌细胞面积，请在Fiji软件中打开图像，使用多边形选区仔细勾勒单个斜行肌细胞的轮廓。通过拖动锚点调整多边形线条末端，以优化勾勒效果。转到软件顶部的“Analyze”选项卡，点击“Measure”以计算选定区域。对于发生退化或缺失区域的肌细胞，使用多边形选择工具勾勒缺失区域，然后再次点击“Measure”。如果存在多个缺口，请分别逐一勾勒每个缺口。计算间隙区域面积与整个细胞面积的比值。该比值较高表明肌肉变性程度较高。若无缺失区域，则该比值记为零。打开 Elastic，选择“创建新项目”下的像素分类。然后重命名并保存项目。导航到输入数据选项卡，点击“添加新数据”，然后选择“添加单独图像”。将弹出窗口定位到包含 TIF 文件的文件夹，并选择所需的图像。在“特征选择”选项卡中，单击“选择特征”以选中所有由绿色对勾框标示的像素特征。此步骤中的像素选择将用于在下一步中区分不同类别的像素。使用训练面板区分表达 GFP 的单个肌球蛋白细丝与不需要的背景。单击“添加标签”，涂抹不需要的背景区域以及细丝之间的空白区域，以开始分类器训练。添加第二个标签，将其重命名为“细丝”，并在多个细丝上进行涂抹。单击“实时更新”以确保分类已正确完成。如有必要，添加更多涂鸦以微调训练。完成分类器训练后，转到“预测导出”面板，单击“选择导出图像设置”，并将源设置为“概率”。确保选中裁剪的子区域 x 和 y，而不选中 c。为 c 选择 0 和 1 作为起始值和终止值，并将数据类型转换为无符号 8 位。勾选重新归一化，然后将输出文件视频更改为 png 格式，并根据需要重命名文件和目录。关闭导出设置窗口，并导出刚刚完成分割的图像。然后在 Fiji 软件中打开该 png 文件。使用默认设置调整图像的阈值，并应用骨架化插件，该插件将生成一个独立的结果表格。本方案已用于研究α-微管蛋白乙酰转移酶MEC-17在突触发育中的功能。对后侧微管或PLM突触图像的定量分析表明，MEC-17的过表达会破坏神经元的正常功能。与野生型对照动物相比，MEC-17过表达的动物其突触前区域显著减少，突触完整性下降。这些技术还被用于分析携带与腓骨肌萎缩症2型（CMT2）相关基因突变的秀丽隐杆线虫（C. elegans）模型。对体壁肌肉形态的视觉评估显示，与野生型对照相比，测试动物的缺陷增加了2.5至3.5倍。携带fzo-1和unc-116基因突变的动物出现肌节结构消失、细胞碎片积聚以及肌纤维退化现象。尽管dyn-1基因突变的动物在肌肉形态缺陷方面显著较少，但fzo-1和unc-116突变体与野生型动物相比，其单个细胞间隙面积与总面积之比增加了五到六倍，且平均纤维长度明显更短。为了在样本之间进行有效比较，确定图像采集的最优条件并确保始终一致地使用这些条件至关重要。这些技术将使研究人员能够通过定量方法比较不同遗传背景下形态学的变化。这可以减少主观性，从而有助于提高所生成数据的代表性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

研究卡埃纳哈布迪炎细胞结构和细胞形态学的定量方法

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

基础 Caenorhabditis elegans 实验方法：同步化与观察

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

本文展示了如何追踪和量化 C. elegans...

使用开源工具追踪和量化 C. elegans 的发育过程

本文详细描述了专门用于监测线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

表征线虫胚胎伸长的新指标 秀丽隐杆线虫

我们提出一种用于三维重建的自动化方法 秀丽隐杆线虫 生殖系.

计算分析 秀丽隐杆线虫 生殖系中细胞核、蛋白质及细胞骨架分布的研究

本文介绍了一种组合方法，结合高分辨率显微镜、计算工具以及活体秀丽线虫（C.

亚细胞分辨率下利用各向同性光片显微镜与自动化细胞谱系分析记录秀丽隐杆线虫胚胎发育

本方案描述了检测和定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞以膜结合型胞外小体形式释放的大分子聚集体和/或细胞器外排物（约4...

定量评分方法 体内 大型外吐囊泡中的神经元聚集体和细胞器外排 秀丽隐杆线虫

本研究介绍了两种用于分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）复合体 I 疾病 gas-1(fc21) 蚓体运动活性的半自动化方法，分别为 ZebraLab（中通量检测）和...

动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。...

自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫

本文提供了有效使用SegElegans的详细说明。SegElegans是我们开发的一种深度学习系统，可用于对宽场显微镜图像中的单个线虫进行自动分割，进而用于ImageJ等图像分析软件。我们提供了该系统的在线和离线使用方法。...

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

学习使用CellProfiler和Fiji软件对秀丽隐杆线虫C. elegans进行突触大小、肌肉形态和线粒体形状的定量分析。该方法为评估基因突变引起的细胞结构变化提供了客观可靠的图像处理方案。

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法秀丽隐杆线虫

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用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

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