研究卡埃纳哈布迪炎细胞结构和细胞形态学的定量方法

量化组织和细胞器形态变化的能力对于理解基因功能以及基因突变的影响非常重要。我们的协议解释了如何免费可用的软件可用于非主观地评估线虫（C.elegans）中突触、肌肉和线粒体的形态。许多以前的研究都依靠定性方法比较形态变化。

然而，这些可能是有问题的，因为它们可能无法捕捉到微妙的表型差异，可能超过和低估变化，并主观评估。我们的定量方法为评估形态变化提供了更稳健、更不偏颇的方法。这些方法可以很容易地用于研究其他细胞结构或模型生物体的形态变化，以便定义基因功能和疾病相关突变的后果。

首先准备幻灯片进行成像。将一滴融化的阿加罗斯放在显微镜幻灯片上，然后立即用另一张显微镜幻灯片向下按压液滴，轻轻压平糖。让加糖干燥一分钟，然后小心地将两个幻灯片分开，将凝固垫放在其中一张幻灯片上。

将幻灯片放在显微镜台上，在 agarose 垫的中心添加 5 到 10 毫升的麻醉剂。使用热消毒的采摘，在溶液干干之前，快速将 10 到 15 只动物从库存板转移到麻醉液滴。然后应用盖玻片，将其定位在阿加罗斯垫的正上方，然后轻轻地放下。

使用线扫描共声显微镜与 488 和 552 纳米光学泵送半导体二极管激光器耦合，并配备图像捕获软件，对突触区域进行成像。定位蠕虫后，切换到 40 倍放大倍率并应用浸入介质。通过 552 纳米激光器、1% 的 tagRFP 荧光磷功率和 488 纳米、2% 的 GFP 荧光量，通过刺激荧光的突触区域。

使用混合光电探测器捕获图像，并设置增益，以防止荧光团过度暴露。根据目标，收集 Z 堆栈图像，使用最佳 Z 步法大小覆盖整个突触。要分析突触区域，首先将图像加载到 CellProfiler 3.1.5 软件中。

设置 NameAndType 模块，并使用 UIS-115 转基因表示的漫反射 tagRFP 按手定义确定突触区域。通过将测量对象形状和测量对象突触模块添加到管道中，测量手动定义的突触的大小和荧光。然后通过添加计算Math模块，将从JSIS37中获得的集成强度单位除以从UIS-115获得的集成强度单位来计算相对集成的荧光强度。

完成后导出所有测量和计算。要测量肌肉细胞区域，请打开斐济软件中的图像，并使用多边形选择来仔细跟踪单个倾斜肌肉细胞。通过拖动锚点来调整多边形的末尾的线，以改善跟踪。

导航到软件顶部的”分析”选项卡，然后单击”测量”以计算所选区域。对于具有退化或缺失区域的肌肉细胞，使用多边形选择工具跟踪缺失区域，然后再次单击”测量”。如果有多个间隙，请分别跟踪每个间隙。

计算间隙面积与整个单元格区域的比率。高比率表示肌肉退化的程度较高。如果没有缺失区域，则比率计算为零。

打开弹性并在”创建新项目”下选择”像素分类”。然后重命名并保存项目。导航到输入数据选项卡，然后单击”添加新”，然后添加单独的图像。

使用 TIF 文件将弹出窗口引导到文件夹，然后选择所需的图像。在”要素选择”选项卡中，单击”选择要素”以选择绿色勾选框指示的所有像素要素。此步骤中的像素选择用于区分下一步中不同的像素类别。

使用训练面板来区分单个 GFP 表达肌素丝和不需要的背景。单击”添加标签”，在灯丝之间草草写不需要的背景和空格，开始分类器训练。添加第二个标签，将其重命名为”丝”，并在许多灯丝上乱写。

单击”实时更新”以确保分类已正确完成。如有必要，添加更多草书以微调培训。执行训练分类器后，转到”预测导出”面板，然后单击”选择具有概率的导出图像设置”作为源。

确保已勾选切口子区域 x 和 y，并且 c 已取消勾选。选择零和一作为 c 的开始和停止值，并将数据类型转换为未签名的 8 位。勾选重新规范化，然后将输出文件视频更改为 png，根据需要重命名文件和目录。

关闭”导出设置”窗口并导出刚刚分段的图像。然后在斐济软件中打开 png 文件。使用默认设置调整图像的阈值并应用骨架化插件，这将创建单独的结果表。

该协议已用于探索α-多布林乙酰转移酶 MEC-17在突触开发中的功能。对后/侧微管或PLM突触图像的定量分析表明，MEC-17的超表达会干扰正常的神经元功能。与野生型控制动物过度表达 MEC-17 相比，预突触区域和突触完整性显著降低。

这些技术还用于分析夏科特-玛丽-牙2型或CMT2的C.elegans模型，该模型携带CMT2相关基因的突变。对身体壁肌形态的视觉评估显示，与野生类型控制相比，试验动物的缺陷增加了2.5至3.5倍。在fzo-1和uns-116中发生突变的动物经历了肌肉条纹损失、细胞碎片积累和肌肉纤维退化。

虽然dyn-1突变的动物在肌肉形态方面的缺陷明显减少。fzo-1和uns-116突变体显示，与野生类型动物相比，差距与单个细胞总面积的比例增加了五到六倍，平均纤维长度也明显缩短。要对样本进行比较，必须确定图像采集的最佳条件，并确保这些条件得到一致使用。

这些技术将允许研究人员用定量方法比较不同遗传背景的形态变化。这降低了主观性，因此有助于提高生成数据的可表示性。