利用高内涵显微镜进行细胞氧化还原状态分析

本高内涵显微镜方法的总体目标是同时定量线粒体的形态功能以及细胞内活性氧的水平，从而为经受不同实验扰动的细胞系建立可靠的氧化还原指纹图谱。该方法有助于回答氧化还原生物学中的关键问题，例如致病条件或化合物处理是否引发氧化应激，以及线粒体的结构与功能在多大程度上受到影响。该技术的主要优势在于所有参数均可在同一细胞内同时测量。

开始实验时，在具有薄而连续的聚苯乙烯或玻璃底的黑色96孔板的60个内侧孔中，每孔接种8,000至10,000个人类真皮成纤维细胞。当使用不同条件、处理方式或细胞系时，应将它们的接种位置均匀分布在板上，以尽量减少板间效应。随后，在B01孔中额外接种8,000至10,000个细胞，用于调焦调整。

随后，向空的外围孔中加入培养基，以尽量减少孔与周围环境之间的梯度。在将培养板放回培养箱之前，轻轻敲击培养板三次，以避免细胞成片生长。培养细胞24小时，或直至细胞达到70%融合度。

随后，将实验的处理信息保存到名为 setup 的电子表格中。设置显微镜时，首先使用软件校准 XY 载物台，然后使用采集软件为多孔板创建成像方案。

本方案可实现对96孔板中设定位置和选定孔的自动采集。现在，从软件提供的可用孔板列表中选择正确类型的多孔板。或者，可根据孔板和孔的尺寸定义多孔板格式。

然后，通过定义四个外角孔中的两个角孔来对准孔板。接着，选择需要采集的孔，并设置包含顺序波长采集的采集程序。确保首先设置GFP通道。

然后，定义一个孔板扫描循环，使用已设定的采集方案，在每个选定孔的中心周围获取四个等间距且无重叠的图像。在此步骤中，通过将CM-H2DCFDA和TMRM储备液加入HBSS HEPES缓冲液，为60个孔配制染色溶液。接着，将孔板倒置，以单一流体动作弃去细胞培养基。

用HH缓冲液轻轻洗涤细胞两次。不要忘记对用于焦点调节的A01孔中的细胞进行洗涤。每次洗涤步骤之间弃去HH缓冲液。

然后，通过向每个孔中加入 100 微升染色液，使细胞负载 CM-H2DCFDA 和 TMRM。同样，不要遗漏 A01 孔。将细胞在室温下避光孵育 25 分钟。

25分钟后，用100微升HH缓冲液洗涤细胞两次，并向所有60个内孔中加入100微升HH缓冲液。为进行实际测量，将培养板安装到显微镜上。然后，打开基于硬件的自动对焦系统，并使用B01孔和TMRM通道调节自动对焦偏移，直至获得清晰的图像。

随后，运行成像程序。所得的图像数据集将提供基础活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位以及线粒体形态的信息。接下来，为测量诱导产生的ROS水平，需小心地将96孔板从显微镜上取下。

向每个孔中加入 100 微升浓度为 40 微摩尔的 TBHP 溶液，静置至少 3 分钟，使 TBHP 与 CM-H2DCFDA 完全反应。在此期间，向 A01 孔中加入 100 微升抗体工作液。随后，将培养板重新安装到显微镜上，并使用 B01 孔再次检查焦点。

然后，使用相同的成像方案，对第一轮成像中的相同位置进行成像。所得图像数据集将提供有关诱导产生的活性氧（ROS）水平的信息。接下来，在 A01 孔中采集平场图像。

确保信号处于动态范围之内。通过调整采集参数，随后使用标准化命名方式，将采集的数据集作为单独的 TIFF 文件导出至同一文件夹中。

包括提及培养板、TBHP处理前或处理后、孔、视野和通道，各部分以下划线分隔。同时，使用标准化命名法将平场校正图像以单独的TIFF文件保存在同一文件夹中。在此步骤中，打开图像处理软件并安装氧化还原指标宏集。

然后，单击 S 按钮打开设置界面，以配置分析参数。选择图像类型、通道数量以及用于采集平场图像的孔板。随后，指明哪个通道包含细胞或线粒体。

勾选“背景”和“增强”复选框，分别执行背景减除和对比度受限的自适应直方图均衡化。接下来，为细胞的高斯模糊和线粒体的拉普拉斯增强定义sigma值。选择一种自动阈值算法，并填写尺寸排除限值。

然后，通过打开获取的数据集中的几张选定图像，并点击菜单中的 C 或 M 按钮（分别用于细胞或线粒体分割），来测试分割设置。接着，点击井号按钮，选择包含图像的感兴趣文件夹，对该文件夹进行批量分析。确认设置无误后，点击确定。

批量分析完成后，通过点击 V 按钮并选择包含图像的文件夹，在验证图像栈上目视检查分割效果。浏览整个验证图像栈，确认分割是否成功。提取数据的初步分析将通过一个免费的 Shiny 应用程序自动完成。

这有助于快速解读结果。首先，在 R Studio 中打开应用程序，选择在外部浏览器中运行。

在输入页面中，选择结果文件所在的目录。请确保设置文件也位于该目录中。结果文件和设置信息将被自动导入、整合并可视化。

实验设置页面显示了实验的布局。下一页将分别显示每块培养板的活性氧水平及多个线粒体参数。请使用下拉菜单选择您想要查看的培养板。

数据以多孔板格式显示，同时以箱线图显示，并对异常值标注孔位和图像编号。整个实验结果页面展示了所有板的归一化结果，以及基本的统计分析。如果在输入页面提供了排除文件，则指定的数据点将被排除。

在聚类分析页面，通过主成分分析法对五个参数的数据进行分析，从而构建出敏感的氧化还原谱型。最后，在下载数据页面，可将经过处理和重新排列的数据保存下来以供进一步使用。此处显示的是人皮肤成纤维细胞经HIV蛋白酶抑制剂沙奎那韦处理后的实验结果。

根据所述方案，基础状态和诱导状态的活性氧水平均显著升高。与经DMSO处理的对照细胞相比，沙奎那韦还显著影响了线粒体的形态与功能。

以每个线粒体像素的平均TMRM信号测量的线粒体膜电位显著增加。此外，线粒体呈现出高度碎片化的形态，表现为单个线粒体的圆形度更高、平均尺寸更小，这一变化可通过定量分析明确反映。当通过主成分分析整合上述参数时，对照组与沙奎那韦处理组可通过其氧化还原指纹被清晰区分开来。

在进行该实验操作时，需要牢记光照本身会引起氧化应激。因此，应尽量减少曝光时间，并在整个实验过程中保持一致的曝光条件。一旦熟练掌握，可在一天内完成多达20块96孔板的染色与图像采集。

完成第二次成像后，可对细胞进行固定，并用于后续的免疫荧光染色。这能够增加对完全相同细胞所检测的参数数量，并有助于回答更多科学问题。观看本视频后，您应能够使用高内涵显微镜技术，在贴壁培养细胞中联合检测活性氧（ROS）水平与线粒体形态功能。