Name: 使用高含量显微镜的细胞氧化还原分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学习高含量显微镜技术，同时定量检测活细胞内的活性氧水平和线粒体形态功能，建立细胞氧化还原指纹图谱。该方法使用荧光探针CM-H2DCFDA和TMRM，适用于人皮肤成纤维细胞等贴壁细胞的研究。

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本研究得到了安特卫普大学（TTBOF/29267，TTBOF/30112）、根特大学特别研究基金（项目 BOF/11267/09）、NB-Photonics（项目编号 01-MR0110）以及荷兰科学研究组织（NWO；编号：CSBR09/013V）的系统生物学研究中心（CSBR）计划的支持。本文部分内容经施普林格出版社许可，改编自另一篇已发表的文献1。作者感谢 Geert Meesen 在宽场显微镜使用方面提供的帮助。

以下方案以NHDF细胞和材料文件中指定的多孔板为例进行描述。工作流程的总体概述见图1。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>通过在杜氏必需培养基（DMEM）中添加 10% v/v 胎牛血清（FBS）以及 100 IU/mL 青霉素和 100 IU/mL 链霉素（PS）来制备完全培养基。对于 500 mL 完全培养基，向 445 mL DMEM 中加入 50 mL FBS 和 5 mL PS。</li>
	<li>通过在 Hank's 平衡盐溶液（含镁和钙，不含酚红）中添加 20 mM HEPES 来制备 HBSS-HEPES（HH）成像缓冲液。对于 500 mL HH，向 490 mL HBSS 中加入 10 mL 1 M HEPES 储存液。验证 pH 值，并在必要时调节至 pH 7.2。</li>
	<li>通过将 50 µg CM-H2DCFDA 冻干粉末溶解于 86.5 µL 无水 DMSO 中，制备 1 mM CM-H2DCFDA 储存液。通过涡旋或反复吹打混匀，并分装成每管 20 µL 的等份量至棕色微量离心管中。于 -20 °C 避光保存，并在 1 周内使用。若在 N2 气氛下保存，可延长至至少 1 个月。
	<ol>
		<li>通过将 25 mg TMRM 粉末溶解于 50 mL 无水 DMSO 中，制备 1 mM TMRM 储存液。通过涡旋或反复吹打混匀，并分装成每管 10 µL 的等份量至棕色微量离心管中。于 -20 °C 避光保存。该溶液至少可稳定保存一年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每次实验均需通过直接从 70% 储存液中移取一定体积（每 96 孔板 10 µL）来制备新鲜的 tert-丁基过氧化物（TBHP）储存液（约 7 M）。此分装液在使用前应置于 4 °C 保存。</li>
	<li>通过将两种二抗（Alexa Fluor 488 驴抗兔和 CY3 驴抗兔）用 1× HH 缓冲液稀释 1000 倍，制备抗体工作液（AB）。</li>
</ol>
2. 显微镜及采集程序的设置（约 ± 15 分钟）
注意：图像采集使用配备自动载物台和快门、基于硬件的自动对焦系统、20倍平场消色差物镜（数值孔径 NA = 0.75）以及EM-CCD相机的宽场显微镜进行。首次建立该检测方法时，需使用一块包含按照本方案说明染色的对照细胞的测试板，用于校准XY载物台并优化采集参数。若采集参数已确定，则可使用空板进行校准。
<ol>
	<li>将物镜降至最低位置，并根据软件说明校准 XY 载物台。</li>
	<li>确保已安装正确的滤光片组。为观察 CM-H2DCFDA，使用标准的 GFP 滤光片组，其包含 472/30 nm 激发带通滤光片、495 nm 截止二向色镜和 520/35 nm 带通发射滤光片；对于 TMRM，则使用 TRITC 滤光片组，其包含 540/25 nm 带通激发滤光片、565 nm 截止二向色镜和 605/55 nm 带通发射滤光片。</li>
	<li>使用采集软件创建成像方案。
	<ol>
		<li>从软件提供的可用板型列表中选择正确类型的多孔板（制造商及型号）。或者，根据板和孔的尺寸自定义多孔板格式。</li>
		<li>按照软件说明对齐孔板，例如，通过定义四个外角孔中的两个角孔来完成。此步骤可校正相机方向的偏差。</li>
		<li>选择需要采集的孔。如果软件中无此选项，则使用一组手动定义的 XY 位置，使其对应所选的孔。</li>
		<li>使用测试板分别优化两个通道的采集参数（曝光时间、光源强度、EM 增益）。应尽可能降低曝光时间和光源强度，因为荧光激发光本身会诱导 ROS 产生。但需确保在 TBHP 处理前，基础状态下的 CM-H2DCFDA 信噪比至少为 2，TMRM 至少为 3，并且在 TBHP 处理后无信号饱和。采集参数高度依赖于所用显微镜系统和细胞类型，作为参考，当使用 130 W 金属卤化物灯作为光源，并按照本方案说明对 NHDF 细胞染色时，建议参数如下：CM-H2DCFDA 和 TMRM 的曝光时间均为 200 ms，ND 滤光片为 8，EM 增益分别为 15（13 MHz；14 位）和 4（27 MHz；14 位）。一旦针对特定系统和细胞类型完成优化，后续实验可跳过此步骤。 
		注意：在整个成像过程中，必须保持采集参数一致。对于大规模、多日实验，应通过定期质量控制确保光源稳定性。</li>
		<li>定义一个包含顺序波长（lambda）采集的成像方案。优先选择先采集 CM-H2DCFDA 通道，以尽量减少测量前的光照暴露。</li>
		<li>定义一个孔板循环，使用 2.3.4 中设定的采集方案，在所选孔的中心周围等间距采集 4 幅互不重叠的图像。采用蛇形图像采集模式，即，从左到右（从孔 B02 到 B11），然后返回从右到左（从孔 C11 到 C02），依此类推（图 2A）。相比单向从左到右采集，该方式可节省时间。若软件不支持此功能，则调整步骤 2.3.3 中创建的自定义 XY 位置集，以实现该成像模式。</li>
		<li>保存成像位置的 XY 坐标（例如，保存为独立的 xml 文件），以便在显微镜重新校准后能快速恢复原位置。若需将本实验的读数与同批细胞的后续免疫荧光（IF）染色结果进行关联分析，此步骤尤为重要。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在96孔板中接种细胞（根据细胞系种类数量，耗时45 - 90分钟）
<ol>
	<li>在2级生物安全柜等无菌环境中操作，并佩戴手套。</li>
	<li>使用70%（v/v）乙醇水溶液对所有表面和材料进行去污染处理。</li>
	<li>从培养箱中取出一个细胞汇合度为90%的细胞培养瓶，放入生物安全柜中。</li>
	<li>用1× PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>加入适量的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液至细胞中，确保完全覆盖整个细胞表面（例如，1 mL 用于 T25 培养瓶），在 37 °C 下孵育 2 分钟 &#176;C 和 5% CO₂2.</li>
	<li>如果所有细胞均已脱落（需用显微镜检查），则加入培养基（DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素）； &#177; 4 mL 加入 T25 培养瓶中以灭活胰蛋白酶-EDTA 溶液。</li>
	<li>在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用培养基重悬细胞沉淀。根据每种细胞类型确定培养基用量，以获得适合细胞计数的细胞浓度。通常，一个90%汇合度的T25培养瓶中的NHDF细胞约含有100–150万个细胞，重悬于3–4 mL培养基中。</li>
	<li>使用细胞计数板或库尔特计数器对细胞进行计数。</li>
	<li>在黑色96孔板的内侧60个孔中，每孔接种8,000–10,000个细胞，该板应具有薄而连续的聚苯乙烯或玻璃底（黑色可避免成像过程中相邻孔之间的光散射和串扰）。当使用不同条件/处理/细胞系时，应将其接种位置在板上均匀分布，以尽量减少板效应图2A). 除 B01 和 A01 孔外，外周孔未被使用，因其更易受边缘效应影响。</li>
	<li>在B01孔中接种8,000-10,000个细胞。该孔将用于图像采集前的调焦。</li>
	<li>用培养基填充空的外周孔，以尽量减少梯度（温度、湿度） 等等。) 在孔板与环境之间。</li>
	<li>轻轻敲击培养板三次，然后再放回培养箱，以避免细胞成片生长。</li>
	<li>将细胞培养 24 小时，或直至汇合度达到约 70%。</li>
	<li>将实验的处理信息保存到名为 &#34;Setup.xlsx&#34;文件应包含四列，用于在数据分析期间将处理条件与孔位及图像信息进行关联。四列为：“Well”（孔）、“Treatmentnumber”（处理编号）、“Treatment”（处理）和“Control”（对照）（每孔对应一行）。每种处理均对应一个唯一的处理编号，该编号在数据可视化过程中用于确定图表X轴上处理条件的排列顺序。Control列指明当前行所对应处理的对照处理。典型的实验布局及相应设置文件的示意图如图所示。 图2.</li>
</ol>
4. 细胞加载 CM-H₂DCFDA2DCFDA 和 TMRM（ &#177; 45 分钟
注意：实验当天对细胞的操作可在无菌环境（生物安全柜）中进行，但非必需，因为细胞在检测后将被直接丢弃或固定。
<ol>
	<li>将HH缓冲液加热至37 °C。</li>
	<li>通过将1 mM储备液用HH缓冲液稀释50倍，制备20 µM TMRM工作液（向10 µL TMRM储备液的1份 aliquot 中加入490 µL HH缓冲液）。</li>
	<li>制备含2 µM CM-H2DCFDA和100 nM TMRM的染色工作液。为此，将1 mM CM-H2DCFDA储备液用HH缓冲液稀释500倍，并将20 µM TMRM工作液用HH缓冲液稀释200倍。
	<ol>
		<li>通常情况下，为60个孔制备7.5 mL染色工作液，方法是向7447.5 µL HH缓冲液中加入15 µL CM-H2DCFDA和37.5 µL TMRM溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养板倒置，单次倾倒动作弃去细胞培养液。</li>
	<li>使用多通道&#160;移液器（每孔100 µL）用HH缓冲液轻柔洗涤细胞两次。每次洗涤之间通过将培养板倒置并单次倾倒动作弃去HH缓冲液。</li>
	<li>使用多通道&#160;移液器向每孔加入100 µL染色工作液，使细胞负载CM-H2DCFDA和TMRM。在室温下避光孵育25分钟。&#160;不要遗漏B01孔。&#160;</li>
	<li>在孵育的25分钟内，制备氧化剂TBHP的工作液，并确保显微镜及相关硬件设备已开启。
	<ol>
		<li>制备工作液I：将7 M储备液用HH缓冲液稀释70倍至100 mM（10 µL储备液加入690 µL HH缓冲液）。</li>
		<li>制备工作液II：将工作液I用HH缓冲液稀释100倍至1 mM（10 µL工作液I加入990 µL HH缓冲液）。</li>
		<li>制备工作液III：将工作液II用HH缓冲液稀释25倍至40 µM（为60个孔，向7200 µL HH缓冲液中加入300 µL工作液II）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>25分钟后，按前述方法再次用100 µL HH缓冲液洗涤细胞两次。</li>
	<li>向所有60个内孔中各加入100 µL HH缓冲液。</li>
</ol>
5. 首次活细胞成像以测定基础 ROS 水平及线粒体形态功能（± 15 分钟）
<ol>
	<li>确保采集软件正常运行，并已加载成像方案。</li>
	<li>将培养板安装到显微镜上，开启基于硬件的自动对焦系统，并使用 B01 孔通过 TMRM 通道调整自动对焦偏移量。由于该操作会引发 CM-H2DCFDA 信号强度的增加，因此该孔将不参与后续的图像分析。</li>
	<li>运行成像方案。</li>
</ol>
6. 添加TBHP后进行第二轮活细胞成像以测定诱导产生的ROS水平（&#177; 20 分钟
<ol>
	<li>小心地将96孔板从显微镜上取下。</li>
	<li>加入100 &#181;L of TBHP WS III (40 &#181;M）加入到每孔中，使用多通道移液器&#160;移液器（这将得到一个20 &#181;M TBHP 浓度置于孔中）。该化合物用作 CM-H2DCFDA 染色（信号应上升）以及用于测量诱导产生的 ROS 水平的方法。 
	注意：H2O2 也可使用 H2O2 替代 TBHP，但该化合物稳定性较差，因此可靠性较低。</li>
	<li>等待至少 3 分钟，以确保 TBHP 与 CM-H 完全反应2DCFDA</li>
	<li>在此期间，加入100 &#181;L 抗体工作液（1/1,000）加入至 A01 孔。</li>
	<li>将培养板重新安装到显微镜上，并使用B01孔再次检查焦距。</li>
	<li>使用相同的成像方案，重新获取第一轮成像时的相同位置。</li>
	<li>将获取的数据集以标准化命名方式导出为单个文件夹中的独立 tiff 文件，命名中包含对培养板、TBHP 处理前或处理后、孔、视野和通道的标识，各部分以下划线分隔。 例如P01_Pre_B02_0001_C1，表示第1块板、TBHP处理前、B02孔、第1视野、第1通道。该信息将在图像分析过程中使用。例如 以选择合适的分割设置），以及在数据分析过程中（将分析数据与正确的处理条件相对应）。</li>
	<li>使用采集方案，在 A01 孔中心周围的四个位置获取两个通道的平场图像。将这些图像作为单独的 tiff 文件保存在与其他图像相同的文件夹中，采用以下标准化命名方式：'P01_FF_A01_0001_C1' 表示 1 号板、1 号视野、1 号通道。确保信号处于动态范围之内；若出现饱和现象，应使用较低浓度的抗体工作液。</li>
	<li>弃去培养板或保存以用于后续处理。 
	注意：可不将培养板从显微镜上取下，而是通过在显微镜载物台上安装自动移液器并将其与成像软件连接，使其在接收到触发信号后自动操作。该方式可在完成第一个视野的采集后立即向每个孔直接加入TBHP溶液，再继续移至下一个孔。如此，在第一轮成像结束后可立即开始第二轮成像，确保所有孔的细胞与TBHP孵育时间完全一致。</li>
</ol>
7. 图像处理与分析（&#177; 每96孔板30分钟
注意：所有图像处理均在 FIJI（http://fiji.sc）中进行，FIJI 是 ImageJ 免费软件的一个集成版本。已编写专用脚本用于自动分析细胞内 ROS 信号和线粒体信号以及形态学参数（RedoxMetrics.ijm，可应要求提供）。其底层算法详见 Sieprath et al.1。
<ol>
	<li>确保已安装并可正常运行 FIJI。</li>
	<li>启动 FIJI 并安装宏集（插件 - &#62; 宏 - &#62; 安装 &#8230;）。这将调用多个新的宏命令以及一组用于优化分析设置的操作工具，如图所示 图3A.</li>
	<li>单击“S”按钮打开设置界面以设定分析参数（图3B).
	<ol>
		<li>选择用于获取平场校正图像的图像类型、通道数量和孔板位置。</li>
		<li>指明哪个通道包含细胞（CM-H2DCFDA 通道）或线粒体（TMRM 通道）并根据图像质量调整每个通道的预处理和分割参数图 3B）勾选“背景”和“对比度”复选框，以执行背景扣除或对比度受限的自适应直方图均衡化16分别定义用于细胞高斯模糊的σ值和线粒体拉普拉斯增强的σ值。选择一种自动阈值算法，并填写尺寸排除限值（以像素为单位）。如果选择固定阈值而非自动阈值算法，请填写上限阈值。</li>
		<li>在获取的数据集的几张选定图像上测试分割设置，通过打开图像并点击菜单中的“C”或“M”按钮分别进行细胞或线粒体分割，必要时调整设置。示例结果如下所示 图3C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单击“#”按钮并选择含有图像的文件夹，对感兴趣的文件夹运行批量分析。每个文件夹将生成一个新的“Output”目录，其中包含每个图像的独立ROI集合（zip文件）和结果文件（.txt）。对于两个通道，结果文件均包含强度和形态学描述符。CM-H2DCFDA 通道（细胞）结果文件包含每个描述符在单张图像内合并的感兴趣区域（ROI）中的平均值。对于 TMRM 通道，结果文件包含每个单独分割的线粒体感兴趣区域（ROI）中各描述符的数值。</li>
	<li>批处理分析后，通过点击“V”按钮，在“验证堆栈”（即所有图像及其对应ROI叠加而成的复合图像）上直观验证分割效果。通过这种方式，可快速发现过分割/欠分割、失焦图像或图像中的灰尘颗粒/纤维等伪影。进一步的数据质量控制可在后续步骤中进行（参见 &#167;8).</li>
</ol>
8. 数据分析、质量控制（QC）和可视化
原始数据的处理与分析使用 R 统计免费软件（http://www.rproject.org – 版本 3.3.2）和 RStudio（http://www.rstudio.com/ – 版本 1.0.44）完成。为快速获取并可视化结果，设计了一个直观的 Shiny 应用程序17（可应要求提供），用于在热图和箱线图中整合和可视化数据，并执行统计分析。总体而言，该工作流程包括两个连续步骤：首先，按每块 96 孔板对数据进行处理和检查，以检测异常数据点；其次，将同一实验中所有板的经筛选数据合并，并采用非参数多元检验18 和主成分分析进行分析。
<ol>
	<li>确保已安装并可正常运行 R 和 RStudio。</li>
	<li>启动 RStudio。</li>
	<li>打开 RedoxMetrics shiny 应用程序并运行该应用（选择在外部浏览器中运行）。</li>
	<li>在“输入”页面，选择 RedoxMetrics.ijm 的结果文件所在的目录。</li>
	<li>确保步骤 3.15 中创建的“Setup.xlsx”文件也位于此目录中。</li>
	<li>结果文件和设置信息将自动导入、重新排列并可视化。
	<ol>
		<li>“实验设置”页面显示了实验的布局，可用于核对验证。</li>
		<li>下一页“每块板的结果”以颜色编码的多孔板布局分别显示每块板的数据，同时以箱线图形式展示，异常值标注了孔名称和图像编号。后者便于快速检查和识别异常数据点（与该特定处理组测得的平均值相比显著偏高或偏低的数值——参见 图4 例如 
		利用这些信息，验证与异常点相对应的图像。如果检测到异常，则必须将其从分析中剔除。大多数异常是由于图像部分失焦导致分割不准确，或高度荧光的尘埃颗粒干扰了正常分割所致。使用验证堆栈工具（步骤 7.5）可快速发现极端情况，但更细微的问题将在本步骤中被识别。当无法找到异常值的明显或技术性原因时，不应将该图像从分析中移除。</li>
		<li>可选：创建一个名为“Drop.xlsx”的新电子表格，仅包含一列，名为“Drop”。在此列中列出文件名（包括 &#34;.tif&#34; 删除所有需从分析中移除的图像（在步骤 7.5 或步骤 8.6.2 中已识别）的扩展名。使用“输入”页面上传此文件。</li>
		<li>“整个实验结果”页面显示所有微孔板合并后的结果。如果上传了删除文件，该文件将用于从分析中移除指定的数据点。 
		对于每个参数，数据均根据各自的对照组按孔板进行归一化处理。随后合并所有孔板的数据，并采用 nparcomp 软件包中的非参数多变量检验进行分析。18若仅比较两种处理，则采用针对非参数Behrens-Fisher问题的两样本检验；对于多于两种处理的情况，使用基于对比的非参数多重比较检验。结果通过箱线图进行可视化。</li>
		<li>“聚类分析”页面展示了主成分分析（PCA - R core 'stats' 包）的结果。数据来自5个参数（基础 &amp;#38; 诱导的活性氧及线粒体膜电位、大小 &amp;#38; 圆形度）相结合，基于敏感的氧化还原谱型来区分不同的处理组。为此，进行主成分分析（PCA）（R 语言 core 'stats' 包），并使用双标图（biplot）对结果进行可视化（ggbiplot 包 - &#160;http://github.com/vqv/ggbiplot</li>
		<li>使用“下载数据”页面下载包含已处理和重新排列数据的后端数据框，以便将其用于更高级的数据可视化或统计分析。 
		注意：典型的陷阱及可能的解决方案列于 表 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction%5BTitle%5D)+AND+%22AAEC%22%5BJournal%5D)">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li>
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作者声明不存在任何竞争性财务利益或其他利益冲突。通讯作者还确保已要求所有作者披露任何及所有利益冲突。

本文描述了一种高内涵显微镜方法，用于同时定量正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）内的细胞内活性氧（ROS）水平和线粒体形态功能。该方法的性能通过一项关于SQV处理的NHDF的案例研究得以验证。结果支持已有文献报道的证据，即在1型HIV蛋白酶抑制剂处理后会出现ROS水平升高或线粒体功能障碍，但此前这些现象均在独立实验中观察得到19,20,21,22,23,24,25。关键区别在于，本研究所描述的检测方法能够在同一活细胞中同时测量这些参数，并结合形态学数据。该方法的主要优势在于能够明确地在时空上同时确定这两个因素，从而精确定位因果关系。通过主成分分析，可生成特定扰动的敏感氧化还原谱型。...

细胞内活性氧（ROS）的浓度通过活性氧生成系统与清除系统之间的动态平衡进行精确调控。二者失衡将引发氧化应激状态。线粒体是活性氧的主要来源之一。1鉴于其在细胞呼吸中的作用，线粒体负责细胞内大部分超氧阴离子（O₂⁻）的生成。2•-）分子2。这主要是由于电子泄漏至O2 在线粒体电子传递链复合体1中，在强烈的负性线粒体内膜电位（Δψ）条件下m), 即，线粒体超极化。另一方面，线粒体去极化也与活性氧（ROS）生成增加相关，提示存在多种作用机制。3,4,5,6,7,8此外，通过裂变-融合机制相关蛋白质的氧化还原修饰，活性氧共同调控线粒体形态9例如，线粒体碎片化与活性氧（ROS）生成增加以及细胞凋亡相关10,11而线粒体呈丝状则与营养缺乏以及抵抗线粒体自噬有关12鉴于细胞内活性氧（ROS）与线粒体形态功能之间复杂的相互关系，理想情况下应在活细胞中同时对二者进行定量分析。为此，本研究开发了一种基于自动宽场显微镜和荧光探针CM-H标记的贴壁细胞培养物图像分析的高内涵成像检测方法。2DCFDA（ROS）和TMRM（线粒体Δψ）m 以及形态学特征）。高内涵成像指的是提取具有丰富时空信息的（即，利用多种互补性标记物和自动图像分析技术，获取关于细胞表型的大量描述性特征信息。当与自动显微镜技术结合时，可实现多个样本的并行筛选（即 高通量），从而提高检测的统计效能。事实上，该方案的一个主要优势在于，能够在大量细胞和多种实验条件下，对同一细胞内的多个参数进行同步定量分析。
该方案分为8个部分（详见下文）：1）在96孔板中接种细胞；2）储备液、工作液和成像缓冲液的配制；3）显微镜的设置；4）细胞加载CM-H2DCFDA 和 TMRM；5）第一次活体成像以测定基础活性氧水平和线粒体形态功能；6）添加后第二次活体成像 叔-丁基过氧化氢（TBHP）以测定诱导产生的活性氧水平；7）自动图像分析；8）数据分析、质量控制与可视化。
该检测方法最初是为正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）开发的。由于这些细胞体积较大且呈扁平状，因此非常适合通过二维宽场成像来评估线粒体形态13,14。然而，经过少量修改后，该方法也可适用于其他贴壁细胞类型。此外，除了CM-H2DCFDA与TMRM的组合外，该实验流程还可兼容多种具有不同分子特异性的荧光染料组合1,15。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA（通用氧化应激指示剂）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96孔玻璃底微孔板 630 &amp;micro;L-黑色 0.17 mm 低荧光玻璃盖板</td><td>Brooks Life Science Systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>无酚红HBSS 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的高糖DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca和Mg的磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-Versene（EDTA）溶液</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段 驴抗兔IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>用于获取平场图像的抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段 驴抗兔IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>用于获取平场图像的抗体</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse 宽场显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>完美对焦系统（PFS）</td><td>Nikon</td><td></td><td>基于硬件的自动对焦系统</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research 4.5 配 JOBS 模块</td><td>Nikon</td><td></td><td>该软件用于控制显微镜并编程/执行自动图像采集协议</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) 版本 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio 版本 1.0.44</td><td>RStudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R 版本 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用高内涵显微镜进行细胞氧化还原状态分析

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

活性氧（ROS）调控包括基因表达、迁移、分化和增殖在内的多种基本细胞过程。然而，过量的ROS水平会引发氧化应激状态，导致DNA、脂质和蛋白质发生不可逆的氧化损伤。因此，ROS的定量可直接反映细胞的健康状况。由于线粒体是细胞内ROS的主要来源和靶标之一，在相同细胞中联合分析线粒体功能与ROS生成对于深入理解病理生理条件下的相互关联至关重要。为此，开发了一种基于高内涵显微镜的技术策略，用于同时定量细胞内ROS水平、线粒体膜电位（ΔΨm）以及线粒体形态。该方法基于在多孔板中培养的活贴壁细胞，利用自动化宽场荧光显微镜结合图像分析技术，并使用细胞通透性荧光探针CM-H2DCFDA（用于检测ROS）和TMRM（用于检测ΔΨm及线粒体形态）进行染色。与荧光光度法或流式细胞术相比，该策略可在实验刺激前后，以高时空分辨率在单细胞水平上实现亚细胞参数的定量。尤为重要的是，该基于图像的方法除了可获取信号强度外，还能提取形态学参数。综合这些特征参数集，可用于探索性分析和统计学多变量数据分析，以检测不同亚群、细胞类型和/或处理之间的差异。本文提供了该检测方法的详细描述，并结合一个示例实验，验证了其在化学扰动后明确区分细胞状态的潜力。

该检测方法已通过多个对照实验进行基准测试，相关结果详见 Sieprath et al.1。简言之，通过量化 CM-H2DCFDA 和 TMRM 分别对细胞内活性氧（ROS）和线粒体膜电位（Δψm）的外源性变化的荧光响应，确定了检测的动态范围。对于 CM-H2DCFDA，当正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）经 10 µM 至 160 µM 浓度梯度的叔丁基过氧化氢（TBHP）处理时，其荧光信号呈线性增强。同样，当 NHDF 细胞经 1 至 10 µg/µL 浓度梯度的寡霉素（oligomycin，可诱导 Δψm 超极化）处理时，TMRM 的线粒体荧光也呈线性增强。相反，实时加入可诱导 Δψm 去极化的抗生素缬氨霉素（valinomycin），会导致 TMRM 荧光逐渐且可量化地下降。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

本文介绍了一种高内涵显微镜工作流程，可同时定量活体贴壁细胞内的活性氧（ROS）水平以及线粒体膜电位和形态——统称为线粒体形态功能——该方法使用细胞通透性荧光报告分子5-(和-6)-氯甲基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰酯（CM-H2DCFDA）和四甲基罗丹明甲酯（TMRM）。

活性氧（ROS）调控多种关键的细胞过程，包括基因表达、迁移、分化和增殖。然而……

本高内涵显微镜方法的总体目标是同时定量线粒体的形态功能以及细胞内活性氧水平，从而为经受不同实验扰动的细胞系建立可靠的氧化还原指纹图谱。该方法有助于回答氧化还原生物学中的关键问题，例如致病条件或化合物处理是否引发氧化应激，以及线粒体形态与功能受影响的程度。该技术的主要优势在于所有参数均可在同一细胞内同时测定。开始实验时，将八千至一万个真皮成纤维细胞接种于黑色96孔板的60个内圈孔中，该板需具有薄而连续的聚苯乙烯或玻璃底。当使用不同条件、处理方式或细胞系时，应将它们的接种位置均匀分布在孔板上，以尽量减少孔板效应。随后，在B01孔中额外接种八千至一万个细胞，用于焦点调节。随后，向空的外周孔中加入培养基，以尽量减少孔与周围环境之间的浓度梯度。将培养板放回培养箱前，轻轻敲击三次，以避免细胞聚集成簇生长。培养细胞24小时，或直至细胞汇合度达到70%。随后，将实验的处理信息保存到名为 setup 的电子表格中。设置显微镜时，首先使用软件校准 XY 载物台，然后使用采集软件为多孔板创建成像方案。本方案可实现对96孔板中设定位置和选定孔的自动采集。现在，从软件提供的可用孔板列表中选择正确的多孔板类型。或者，可根据孔板和孔的尺寸定义多孔板格式。然后，通过定义四个外角孔中的两个角孔来校准孔板。接着，选择需要采集的孔，并设置包含顺序波长采集的采集方案。确保首先设置GFP通道。然后，定义一个孔板扫描循环，使用设定的采集方案，在每个选定孔的中心周围获取四个等间距且无重叠的图像。在此步骤中，通过将CM-H2DCFDA和TMRM储备液加入HBSS HEPES缓冲液，为60个孔配制染色溶液。接下来，将孔板倒置并以单一的液体操作动作弃去细胞培养基。用HH缓冲液轻轻洗涤细胞两次，注意不要遗漏用于调焦的A01孔中的细胞。每次洗涤后弃去HH缓冲液。然后，通过向每个孔中加入 100 微升染色液，对细胞加载 CM-H2DCFDA 和 TMRM。同样，不要忘记 A01 孔。将细胞在室温避光条件下孵育 25 分钟。孵育25分钟后，用100微升HH缓冲液洗涤细胞两次，并向所有60个内圈孔中加入100微升HH缓冲液。进行实际测量时，将培养板安装到显微镜上。然后，打开基于硬件的自动对焦系统，并使用B01孔和TMRM通道调节自动对焦偏移，直至获得清晰的图像。随后，运行成像程序。所得的图像数据集将提供基础活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位以及线粒体形态的信息。接下来，为测量诱导产生的ROS水平，小心地将96孔板从显微镜上取下。向每个孔中加入 100 µL 浓度为 40 µmol/L 的 TBHP 溶液，静置至少 3 分钟，使 TBHP 与 CM-H2DCFDA 完全反应。在此期间，向 A01 孔中加入 100 µL 抗体工作液。随后，将培养板重新放回显微镜上，使用 B01 孔重新检查焦距。然后，使用相同的成像方案，对第一轮成像中的相同位置进行成像。所得图像数据集将提供有关诱导产生的活性氧（ROS）水平的信息。接下来，获取A01孔的平场图像。确保信号处于动态范围之内，通过调整采集参数实现。随后，使用标准化命名方式，将采集的数据集作为单独的TIFF文件导出至同一文件夹中。包括提及培养板、TBHP处理前或处理后、孔、视野和通道，各部分以下划线分隔。同时，使用标准化命名法将平场校正图像保存为单独的TIFF文件，并存放在同一文件夹中。在此步骤中，打开图像处理软件并安装氧化还原指标宏集。然后，点击 S 按钮打开设置界面，以设定分析参数。选择图像类型、通道数量以及用于获取平场图像的孔板位置。随后，指明哪个通道包含细胞或线粒体。勾选背景校正和增强复选框，分别执行背景减除和对比度受限的自适应直方图均衡化。接下来，为细胞的高斯模糊设定 sigma 值，并对线粒体进行拉普拉斯增强。选择一种自动阈值算法，并填写尺寸排除限值。然后，通过打开获取的数据集中的几张选定图像，并分别点击菜单中的 C 或 M 按钮，以测试细胞或线粒体分割的设置。接着，点击井号按钮，选择包含图像的感兴趣文件夹，对该文件夹进行批量分析。确认设置无误后，点击确定。批量分析完成后，通过点击 V 按钮并选择包含图像的文件夹，在验证图像栈上目视检查分割效果。浏览整个验证图像栈，确认分割是否成功。提取数据的初步分析将通过一个配套的 Shiny 应用程序自动完成。这有助于快速解读结果。首先，在 R Studio 中打开应用程序，选择在外部浏览器中运行。在输入页面，选择结果文件所在的目录。请确保设置文件也位于此目录中。结果文件和设置信息将自动导入、整合并可视化。实验设置页面展示了实验的布局。下一页分别显示每块培养板的活性氧水平及多个线粒体参数。请使用下拉菜单选择您要查看的培养板。数据以多孔板格式显示，同时以箱线图形式呈现，并对离群值标注其孔位和图像编号。整个实验结果页面展示了所有板的归一化结果汇总，以及基本的统计分析。如果在输入页面提供了排除文件，则指定的数据点将被排除。在聚类分析页面，通过主成分分析法对五个参数的数据进行处理，构建出敏感的氧化还原谱型。最后，在数据下载页面可保存已处理和重新排列的数据，以供进一步使用。此处展示的是用人源皮肤成纤维细胞经 HIV 蛋白酶抑制剂沙奎那韦处理的实验结果。采用所述方案，检测到基础和诱导的活性氧水平均显著升高。与使用DMSO处理的对照细胞相比，沙奎那韦还显著影响了线粒体的形态与功能。以每个线粒体像素的平均TMRM信号测得的线粒体膜电位显著升高。此外，线粒体呈现出高度碎片化的形态，表现为单个线粒体的圆形度更高、平均尺寸更小，可定量反映该变化。当通过主成分分析整合上述参数时，对照组与沙奎那韦处理组可通过其氧化还原指纹被明确区分开来。在进行该操作时，需注意光照本身会引发氧化应激，因此应尽量减少曝光时间，并在整个实验过程中保持一致的曝光条件。熟练掌握后，可在一天内完成多达20块96孔板的染色与图像采集。完成第二次成像后，可对细胞进行固定，并用于后续的免疫荧光染色。这能够增加在同一细胞上检测的参数数量，从而回答更多科学问题。观看本视频后，您应能够利用高内涵显微镜技术，在贴壁细胞培养物中开展活性氧（ROS）与线粒体形态功能的联合检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用高含量显微镜的细胞氧化还原分析

当细胞遇到应激条件时，活性氧水平会升高。本文以Pseudomonas...

使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

来源：Katsalifis, A., 等。利用比率型指示剂对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像。J. Vis. Exp.

利用比率型指示剂对原代神经元中的线粒体氧化还原状态进行成像

本论文描述了在活细胞成像中应用基因编码的荧光生成报告系统，用于检测外源性物质诱导的氧化应激。该实验方法具有无与伦比的空间-时间分辨率、灵敏度和特异性，同时避免了传统毒理学氧化应激检测方法的诸多局限性。...

利用基因编码的荧光传感器成像评估毒理学氧化应激的方法

本文介绍了一种利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪对活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便、高效且成本较低。...

通过2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色法检测贴壁细胞中的总活性氧物种

本方案描述了细胞内亚细胞区室特异性氧化还原状态的评估方法。一种对氧化还原敏感的荧光探针可实现对完整细胞进行便捷的比率分析。...

利用亚细胞区室特异性氧化还原敏感型绿色荧光蛋白评估细胞氧化状态

我们描述了在活细胞中对单个巨胞饮体内的pH值、氧化事件以及蛋白质消化进行测量的实验方案。重点介绍了双荧光探针比率显微成像技术，及其相较于基于群体细胞分析技术所具有的优势。...

利用双荧光探针比率显微镜测量巨胞饮体的pH值、氧化还原化学状态及降解能力

本文介绍了一种利用共聚焦活细胞显微镜检测原代海马神经元和皮层神经元基础氧化还原状态差异以及对急性干扰的氧化还原反应差异的实验方案。该方案经少量修改后也可适用于其他细胞类型和显微镜系统。...

利用比率型探针对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像

本方案描述了内源性代谢辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤（磷酸）二核苷酸（NAD(P)H）以及氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的荧光成像与分析。对NAD(P)H和FAD进行自发荧光成像，可提供一种无需标记、非破坏性的细胞代谢评估方法。...

利用自发荧光成像评估细胞代谢

本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。...

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

本方案描述了一种利用二氢乙啶（DHE）作为荧光染料探针，通过高通量筛选方法定量检测细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案详细介绍了在三种不同的人肝细胞癌细胞系中定量评估细胞内活性氧（ROS）的实验方法。...

使用二氢乙啶（DHE）荧光染料高通量筛选评估活性氧（ROS）的生成

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

学习高含量显微镜技术，同时定量检测活细胞内的活性氧水平和线粒体形态功能，建立细胞氧化还原指纹图谱。该方法使用荧光探针CM-H2DCFDA和TMRM，适用于人皮肤成纤维细胞等贴壁细胞的研究。

利用高内涵显微镜进行细胞氧化还原状态分析

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