使用高含量显微镜的细胞氧化还原分析
May 14th, 2017
本文提出了一种高含量显微镜工作流程，用于同时定量细胞内ROS水平，以及线粒体膜电位和形态 - 共同称为线粒体形态功能 - 使用细胞透过性荧光报告分子5-（和 - 6） - 氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，乙酰酯（CM-H 2 DCFDA）和四甲基罗丹明甲酯（TMRM）。
这种基于高内涵显微镜的方法的总体目标是同时量化活性氧的线粒体形态功能和细胞水平，以便为暴露于不同实验扰动的细胞系建立稳健的氧化还原指纹图谱。这种方法可以帮助回答氧化还原生物学中的关键问题，例如致病条件或化合物处理是否会引起氧化应激，以及线粒体形式和功能受到的影响程度。该技术的主要优点是可以同时在同一单元内测量所有参数。
要开始该程序，将 8 到 10， 000 个人真皮成纤维细胞接种在黑色 96 孔板的 60 个内孔中，该板具有薄的连续聚苯乙烯或玻璃底。当使用不同的条件、处理或细胞系时，将它们的接种位置均匀地分布在板上，以尽量减少板的影响。然后，在 B01 孔中再接种 8 到 10， 000 个细胞，用于焦距调整。
随后，用培养基填充空的外孔，以最小化孔与环境之间的梯度。在将板放回培养箱之前，轻轻敲击板 3 次，以避免细胞成片生长。将细胞培养 24 小时，或直到它们达到 70% 汇合。
然后，将实验的处理信息保存到名为 setup 的电子表格中。要设置显微镜，首先使用软件校准 XY 载物台。接下来，使用采集软件为多孔板创建成像方案。
该方案允许自动采集 96 孔板的设定位置和选定的孔。现在，从软件中提供的可用板列表中选择正确的多孔板类型。或者，使用板和孔尺寸定义多孔板格式。
然后，通过定义四个外角井的两个角来对齐孔板。之后，选择需要采集的孔，并定义由顺序波长采集组成的采集方案。确保首先设置 GFP 通道。
然后，定义一个孔板循环，以使用定义的采集协议采集位于每个选定孔中心周围的四个规则间隔的无重叠图像。在此步骤中，通过将 CM-H2DCFDA 和 TMRM 储备溶液添加到 HBSS HEPES 缓冲液中来制备 60 孔的染色溶液。接下来，以单个流体运动将板倒置，丢弃细胞中的培养基。
用 HH 缓冲液轻轻洗涤细胞两次。不要忘记 A01 和用于焦距调整的单元格。在洗涤步骤之间丢弃 HH 缓冲液。
然后，通过向每个孔中加入 100 μL 染色溶液，用 CM-H2DCFDA 和 TMRM 加载细胞。同样，不要忘记 A01。将细胞在室温下避光孵育 25 分钟。
25 分钟后，用 100 μL HH 缓冲液洗涤细胞两次，并向所有 60 个内孔中加入 100 μL HH 缓冲液。要进行实际测量，请将板安装在显微镜上。然后，打开基于硬件的自动对焦系统，并使用井 B01 和 TMRM 通道调整自动对焦偏移，直到获得清晰的图像。
随后，运行成像协议。生成的图像数据集将提供有关基础 ROS 水平、线粒体膜电位和线粒体形态的信息。接下来，要测量诱导的 ROS 水平，请小心地从显微镜中取出 96 孔板。
向每个孔中加入 100 微升 40 微摩尔的 TBHP 溶液，并等待至少三分钟，以使 TBHP 与 CM-H2DCFDA 完全反应。在此期间，向 A01 孔中加入 100 μL 抗体工作溶液。现在，将板放回显微镜上，并使用 B01 孔再次检查焦点。
然后，使用相同的成像协议获取与第一轮成像相同的位置。生成的图像数据集将提供有关诱导的 ROS 水平的信息。接下来，在 A01 孔中采集平场图像。
确保信号完全在动态范围内。通过调整采集设置。然后，使用标准化命名法将采集的数据集作为单独的 TIFF 文件导出到单个文件夹中。
这包括对板、TBHP 处理前后、井、字段和通道的引用，用下划线分隔。此外，使用标准化命名法将平场图像与单个 TIFF 文件存储在同一文件夹中。在此步骤中，打开图像处理软件并安装 redox metrics 宏集。
然后，通过单击 S 按钮打开设置界面以设置分析设置。选择图像类型、通道数和用于采集平场图像的孔。之后，指示哪个通道包含细胞或线粒体。
选中 background 和 enhance 复选框以分别执行背景减法和对比度限制自适应直方图均衡。接下来，定义细胞的高斯和模糊以及线粒体的 laplacian 增强的 sigma。选择自动阈值算法并填写大小排除限制。
然后，通过打开它们并分别单击菜单中的 C 或 M 按钮进行细胞或线粒体分割，在采集的数据集的几个选定图像上测试分割设置。之后，通过单击哈希按钮并选择包含图像的文件夹，从感兴趣的文件夹的批量分析中。验证设置并按 ok。
批量分析后，单击 V 按钮并选择包含图像的文件夹，直观地验证验证堆栈上的分割性能。浏览验证堆栈以确认分段是否成功。提取数据的初始分析是使用免费的 Shiny 应用程序自动完成的。
这允许快速解释结果。首先，在 R Studio 中打开应用程序。选择在外部浏览器中运行它。
在输入页面上，选择结果文件所在的目录。确保此目录中也存在安装文件。结果文件和设置信息会自动导入、编译和可视化。
实验设置页面显示实验的布局。下一页分别显示每个板的 ROS 水平以及几个线粒体参数。使用下拉菜单选择要可视化的板。
数据以多孔板格式显示，也以箱形图显示，箱形图中的异常值用孔和图像编号标记。结果整个实验页面显示了所有板组合的标准化结果，以及基本的统计分析。如果通过输入页面提供放置文件，则指定的数据点将被排除。
在聚类分析页面上，使用主成分和对来自五个参数的数据的分析组成敏感的氧化还原曲线。最后，下载数据页面允许保存已处理和重新排列的数据以供进一步使用。这里显示的是用 HIV 蛋白酶抑制剂 Saquinavir 处理人真皮成纤维细胞的实验结果。
使用所描述的方案，检测到基础和诱导的 ROS 水平显着增加。与对照细胞相比，用 DMSO 处理。沙奎那韦还显着影响线粒体形态功能。
作为每个线粒体像素的平均 TMRM 信号测量的线粒体膜电位显着增加。此外，线粒体获得了高度碎片化的模式，从数量上看，单个线粒体的圆度较高且平均大小较小。当使用主成分分析组合上述参数时，对照和 Saquinavir 条件都可以通过它们的氧化还原指纹图谱清楚地彼此分开。
在尝试此过程时，重要的是要记住照明本身会导致氧化应力。因此，应尽量减少暴露条件并在整个实验过程中保持恒定。掌握后，一天内可对多达 20 块 96 孔板进行染色和采集。
在第二轮成像之后，细胞可以被固定并用于下游免疫荧光染色。这增加了完全相同的单元上的测量参数数量，并允许回答其他问题。观看此视频后，您应该能够使用高内涵显微镜对贴壁细胞培养物中的 ROS 和线粒体形态功能进行联合测量。
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概述
本文介绍了一种高内容显微镜工作流程，用于同时定量测定活体附着细胞内的ROS水平和线粒体形态功能。该方法利用细胞渗透性荧光报告分子来实现这一目标。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 氧化还原生物学
背景
- 活性氧（ROS）在细胞信号传导和稳态中起着关键作用。
- 线粒体功能与氧化应激和细胞健康密切相关。
- 理解线粒体形态功能可以提供对各种病理状态的洞察。
- 高内容显微镜允许对细胞参数进行实时详细分析。
研究目的
- 建立不同实验条件下细胞系的稳健氧化还原指纹。
- 研究病理条件或处理对氧化应激的影响。
- 在同一细胞内同时测量线粒体形态和功能。
所用方法
- 用于定量ROS和线粒体参数的高内容显微镜工作流程。
- 使用荧光报告分子CM-H2DCFDA和TMRM。
- 在96孔板中接种人皮肤成纤维细胞进行分析。
- 使用实验中的另一细胞群体进行焦点调整。
主要结果
- 该方法允许同时测量ROS水平和线粒体功能。
- 它提供了不同处理如何影响细胞氧化应激的洞察。
- 所有参数都可以在同一细胞内评估，提高数据可靠性。
- 为未来的氧化还原生物学研究建立了框架。
结论
- 这种高内容显微镜方法对于研究线粒体形态功能是有效的。
- 它可以帮助阐明氧化应激与线粒体健康之间的关系。
- 这种方法对于在各种背景下研究氧化还原生物学的研究人员来说是有价值的。
常见问题
Executive Industry Relevance
This high-content microscopy method enables simultaneous quantification of intracellular ROS levels and mitochondrial morphofunction, providing a robust redox fingerprint for cellular health assessment. By measuring multiple parameters within the same cell, it enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking during early discovery. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking oxidative stress responses to mitochondrial function in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by establishing redox fingerprints that differentiate cellular states after chemical perturbation.
- Operational Value: Enables functional target validation through correlated ROS and mitochondrial membrane potential measurements in live cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting subpopulation heterogeneity via multivariate analysis of ROS, mitochondrial morphology, and membrane potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows using automated widefield fluorescence microscopy in multi-well plates.
- Quantitative Outputs: Delivers high spatiotemporal resolution data on basal and induced ROS levels, mitochondrial membrane potential, and morphology for compound screening.
- Platform Reuse: Enables scalable, reproducible screening campaigns with standardized image acquisition and analysis protocols across cell lines and treatments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human dermal fibroblasts to model oxidative stress responses, providing a translatable system for preclinical target validation.
- Mechanistic De-risking: Links compound-induced ROS elevation to mitochondrial fragmentation and membrane potential changes, clarifying pathophysiological interconnections.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating multivariate redox profiles that correlate with cellular health outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic de-risking before preclinical investment by establishing causal links between redox state and mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how pathogenic conditions or treatments affect oxidative stress and mitochondrial form/function in the same cell.
- Screening: Delivers assay readiness through automated acquisition of ROS and mitochondrial parameters, ensuring reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of conditions via principal component analysis on five parameters, generating sensitive redox profiles for subpopulation discrimination.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by aligning redox fingerprints with mitochondrial morphofunction changes relevant to pathological conditions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for redox profiling across diverse adherent cell types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through simultaneous ROS and mitochondrial measurement.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated microscopy and standardized image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking oxidative stress biomarkers to mitochondrial health, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through multivariate redox profiling that detects treatment-induced cellular state changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content microscopy, fluorescent probe handling, and image-based data analysis.
- Needs widefield fluorescence microscopy with environmental control, autofocus, and multi-well plate compatibility.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, acquisition settings, and analysis macros for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for non-adherent or primary cell types beyond human dermal fibroblasts.
- Includes practical limitations such as phototoxicity from illumination, necessitating minimized and constant exposure conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:38
Conclusion
9:35
Results: Effect of Saquinavir on Primary Human Fibroblasts
0:47
Seeding Cells in a 96-well Plate
1:48
Setting Up the Microscope and Acquisition Protocol
3:10
Loading of the Cells with CM-H2DCFDA and TMRM
4:18
First and Second Live Imaging Rounds
6:22
Image Processing and Analysis
