诱导与定量细胞衰老的技术

这些技术的总体目标是提供一套工具，用于实现细胞衰老的诱导、监测和定量分析。这些方法有助于回答有关细胞衰老的鉴定与定量，以及调控细胞和有机体衰老的生物学因素等关键问题。这些技术的主要优势在于，它们涵盖了在不同模型、组织和细胞类型中监测细胞衰老的多种方法。

首先，将处于早期传代且具有增殖能力的待研究细胞以较低密度接种于适合分析的培养皿中，并在组织培养孵箱中培养过夜。当细胞融合度达到50–60%时，吸除生长培养基，用PBS洗涤细胞两次。

第二次洗涤后，用一层薄薄的 PBS 覆盖细胞，并对细胞进行一次 10 Gy 剂量的γ射线照射。随后将 PBS 更换为生长培养基。

将细胞放回培养箱中，并每48至72小时更换一次培养基，每天在光学显微镜下监测细胞形态变化。照射后7至10天，在37摄氏度水浴中融化商用衰老相关β-半乳糖苷酶检测试剂盒中的所有试剂。

当所有试剂均达到室温后，根据制造商说明书配制固定剂和染色液。用室温的 PBS 轻柔洗涤每个孔。清洗时需小心冲洗细胞，因为衰老细胞贴壁能力较弱，容易在洗涤过程中被去除。

每孔加入一毫升固定液，在室温下固定10至15分钟。随后每孔用两毫升PBS洗涤两次。接着每孔加入一毫升β-半乳糖苷酶染色液，并用铝箔纸包裹培养板，在37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中培养24至48小时。

在24小时时观察细胞。当细胞染色充分后，用新鲜的PBS替换β-半乳糖苷酶溶液，并使用配备相机的光学显微镜在10倍或更高倍数的物镜下检查培养物。与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞将呈现蓝色。

然后，每孔获取至少五个无重叠的图像。手动计数每张图像中与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的总数以及细胞总数，以计算每孔中与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比。γ射线照射后10天，用PBS洗涤细胞三次。

最后一次洗涤后，将 PBS 替换为 2.5 毫升无血清培养基（每 6 厘米培养皿添加抗生素），并将细胞放回组织培养孵育箱中过夜。次日早晨，将培养基转移至冰上的锥形管中，并用新鲜 PBS 洗涤细胞两次。

然后，用胰蛋白酶消化并计数细胞。接着，离心收集自细胞培养板的上清液。随后通过0.45微米注射器滤器过滤，并将培养基以500微升分装后于-80摄氏度保存，直至用于ELISA分析。

与复制性衰老和DNA损伤诱导的衰老相关的衰老相关β-半乳糖苷酶染色增强。注意衰老细胞相较于增殖性成纤维细胞的纺锤形外观，呈现出增大、扁平的形态。在本实验中，增殖期的年轻细胞或复制性衰老细胞均按照书面实验方案所述步骤进行固定。

并使用针对DNA双链断裂生物标志物的抗体以及DAPI进行染色。在衰老细胞中可观察到DNA双链断裂灶的数量明显增加。对衰老相关分泌表型因子进行RT-qPCR分析，结果显示，在低代次人二倍体成纤维细胞中，经γ射线照射诱导的衰老后，至少部分因子在mRNA水平上表达上调。

这一点通过γ射线照射后细胞培养上清液的ELISA检测得到了进一步证实。一旦掌握，DNA损伤诱导和SA-β-半乳糖苷酶染色可在约30分钟的实验操作时间内完成。用于定量SASP蛋白水平的条件培养基可在约30分钟内制备完成。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，在进入衰老标志物定量分析之前，需先观察细胞培养物中发生的形态学变化。这些技术建立之后，为衰老与癌症领域的研究人员探索多种组织、细胞培养物及模式生物中的细胞衰老现象铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导、监测并定量分析细胞衰老。