技术诱导和量化细胞衰老
May 1st, 2017
细胞衰老，细胞周期停滞的不可逆状态，可通过各种细胞应激来诱导。在这里，我们描述的协议来诱导细胞衰老和方法来评估衰老的标志。
这些技术的总体目标是提供一个工具箱，用于实现细胞衰老的诱导、监测和定量。这些方法可以帮助回答有关细胞衰老的鉴定和定量以及调节细胞和生物体衰老的生物因素的关键问题。这些技术的主要优点是它们包含多种监测不同模型、组织和细胞类型中细胞衰老的方法。
首先将感兴趣的早期传代增殖细胞以稀疏密度接种在适当的培养皿中进行分析。并在组织培养箱中将细胞培养过夜。当细胞汇合 50-60% 时，吸出生长培养基并用 PBS 洗涤细胞两次。
第二次洗涤后，用一层薄薄的 PBS 覆盖细胞。并将细胞暴露于单次 10 级剂量的 γ 射线照射下。用生长培养基替换 PBS。
并将细胞放回培养箱中。每 48 至 72 小时更换一次培养基，并在光学显微镜下每天监测形态变化。照射后 7 至 10 天，在 37 摄氏度的水浴中解冻市售衰老相关 β-半乳糖苷酶检测试剂盒中的所有试剂。
当所有试剂都达到室温时，根据制造商的说明准备固定剂和染色溶液。并用室温 PBS 轻轻洗涤每个孔。小心冲洗细胞，因为衰老细胞不能很好地粘附，并且在洗涤过程中很容易去除。
在室温下，用每孔 1 mL 固定液固定每个孔中的细胞 10 至 15 分钟。然后用每孔 PBS 洗涤两次 2 mL。接下来，向每个孔中加入 1 毫升 β-半乳糖苷酶染色溶液，并用铝箔覆盖板，在无二氧化碳的 37 摄氏度培养箱中培养 24 至 48 小时。
在 24 小时检查细胞。当细胞充分染色后，用新鲜的 PBS 替换 β-gal 溶液，并在带有 10 倍或更高物镜的光学显微镜上检查培养物。衰老相关的 β-半乳糖苷酶细胞将显示为蓝色。
然后，每孔至少获得五个不重叠的图像。并手动计数衰老相关的 β-半乳糖苷酶阳性细胞的总数和每张图像的细胞总数，以计算每孔衰老相关的 β-半乳糖苷酶细胞的百分比。γ 照射后 10 天，用 PBS 洗涤细胞 3 次。
最后一次洗涤后，用 2.5 毫升无血清培养基替换 PBS，每 6 厘米培养皿补充抗生素，并将细胞放回组织培养箱中过夜。第二天早上，将培养基转移到冰上的锥形管中。并用新鲜的 PBS 洗涤细胞两次。
然后，胰蛋白酶消化并计数细胞。接下来，离心从细胞培养板中收获的上清液。然后通过 0.45 微米注射器过滤器过滤，并在 80 摄氏度下以 500 微升等分试样冷冻培养基，直到通过 ELISA 分析。
衰老增加相关的 β-gal 染色与复制和 DNA 损伤诱导的衰老有关。请注意衰老细胞的扩大扁平形状与增殖成纤维细胞的纺锤形外观相比。在该实验中，按照书面方案中的描述固定增殖的年轻或复制衰老细胞。
并用抗 DNA 双链断裂和 DAPI 生物标志物的抗体染色。随着在衰老细胞中观察到的 DNA 双链断裂 fosi 数量的明显增加。衰老相关分泌表型因子的 RT-qPCR 分析表明，在 γ 辐照诱导的低传代人二倍体成纤维细胞衰老后，至少一些因素在 mRNA 水平上上调。
通过 γ 辐照细胞培养上清液的 ELISA 进一步证实了这一点。一旦掌握，DNA 损伤诱导和 SA β-gal 染色可以在大约 30 分钟的手动作时间内完成。用于定量 SASP 蛋白水平的条件培养基可在约 30 分钟内制备。
在尝试此过程时，重要的是要记住在进行衰老标志物定量之前监测它们在细胞培养物中经历形态变化。开发后，这些技术为衰老和癌症领域的研究人员探索各种组织、细胞培养物和模式生物的衰老铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何诱导、监测和定量细胞衰老有很好的了解。
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概览
本文介绍了诱导细胞衰老的协议和评估衰老标记的方法。这些技术旨在促进细胞衰老的监测和量化，为影响衰老的生物因素提供洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 细胞衰老
- 衰老研究
背景
- 细胞衰老是细胞周期停滞的不可逆转状态。
- 它可以由各种细胞应激诱导。
- 理解衰老对于洞察衰老至关重要。
- 这些方法可应用于不同的模型和细胞类型。
研究目的
- 提供诱导细胞衰老的工具箱。
- 实现对衰老标记的监测和量化。
- 探索调节衰老的生物因素。
所用方法
- 在稀密度下铺设早期传代增殖细胞。
- 在组织培养箱中过夜培养细胞。
- 用PBS洗涤细胞以准备分析。
- 通过各种已建立的方法评估细胞衰老。
主要结果
- 在各种模型中成功诱导细胞衰老。
- 用于评估衰老标记的有效监测技术。
- 对调节衰老的生物因素的洞见。
- 展示了适用于不同细胞类型的方法。
结论
- 这些协议提供了研究细胞衰老的全面方法。
- 这些方法可以增强对衰老过程的理解。
- 未来的研究可以在这些技术的基础上进一步探索衰老。
常见问题
Executive Industry Relevance
Robust induction and quantification of cellular senescence is critical for de-risking early discovery programs targeting aging, tissue regeneration, and tumor suppression pathways. These techniques enable precise identification of senescent phenotypes, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Standardized senescence assays facilitate cross-program comparability and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of senescence pathways implicated in disease and aging.
- Supports functional validation of targets regulating cell-cycle arrest and DNA damage response.
- Provides mechanistic de-risking by quantifying hallmark senescence markers.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing true senescence from transient cell-cycle arrest.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cellular systems for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as SA-β-gal positivity and SASP factor levels.
- Enables assay standardization across cell types and experimental models.
- Supports reliable evaluation of candidate modulators of senescence.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro senescence markers with disease-relevant phenotypes in preclinical models.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-senescence strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying translational biomarkers.
- Provides predictive de-risking for aging and cancer research pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
Senescence induction and quantification methods integrate at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on senescence pathways and biological de-risking of candidate targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of SA-β-gal, γ-H2AX, SAHF, and SASP factors for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by aligning senescence markers with disease phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized toolbox adaptable across diverse cell types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible senescence assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of aging and oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, staining, and quantitative image analysis.
- Needs access to irradiation equipment, microscopy, and ELISA platforms.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation.
- Adaptable to various cell types and tissues with protocol optimization.
- Limitations include potential cell loss during washes and variability in marker expression.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
DNA Damage-induced Senescence
1:40
Cell Staining for Senescence-associated (SA) Beta-Galactosidase
3:30
Quantifying SA Secretory Phenotype (SASP) Protein Levels
4:37
Results: Representative SA-beta-Galactosidase Staining and SASP Expression Analyses
5:42
Conclusion
