技术诱导和量化细胞衰老

这些技术的总体目标是提供一个工具箱，用于实现细胞衰老的诱导、监测和定量。这些方法可以帮助回答有关细胞衰老的鉴定和定量以及调节细胞和生物体衰老的生物因素的关键问题。这些技术的主要优点是它们包含多种监测不同模型、组织和细胞类型中细胞衰老的方法。

首先将感兴趣的早期传代增殖细胞以稀疏密度接种在适当的培养皿中进行分析。并在组织培养箱中将细胞培养过夜。当细胞汇合 50-60% 时，吸出生长培养基并用 PBS 洗涤细胞两次。

第二次洗涤后，用一层薄薄的 PBS 覆盖细胞。并将细胞暴露于单次 10 级剂量的 γ 射线照射下。用生长培养基替换 PBS。

并将细胞放回培养箱中。每 48 至 72 小时更换一次培养基，并在光学显微镜下每天监测形态变化。照射后 7 至 10 天，在 37 摄氏度的水浴中解冻市售衰老相关 β-半乳糖苷酶检测试剂盒中的所有试剂。

当所有试剂都达到室温时，根据制造商的说明准备固定剂和染色溶液。并用室温 PBS 轻轻洗涤每个孔。小心冲洗细胞，因为衰老细胞不能很好地粘附，并且在洗涤过程中很容易去除。

在室温下，用每孔 1 mL 固定液固定每个孔中的细胞 10 至 15 分钟。然后用每孔 PBS 洗涤两次 2 mL。接下来，向每个孔中加入 1 毫升 β-半乳糖苷酶染色溶液，并用铝箔覆盖板，在无二氧化碳的 37 摄氏度培养箱中培养 24 至 48 小时。

在 24 小时检查细胞。当细胞充分染色后，用新鲜的 PBS 替换 β-gal 溶液，并在带有 10 倍或更高物镜的光学显微镜上检查培养物。衰老相关的 β-半乳糖苷酶细胞将显示为蓝色。

然后，每孔至少获得五个不重叠的图像。并手动计数衰老相关的 β-半乳糖苷酶阳性细胞的总数和每张图像的细胞总数，以计算每孔衰老相关的 β-半乳糖苷酶细胞的百分比。γ 照射后 10 天，用 PBS 洗涤细胞 3 次。

最后一次洗涤后，用 2.5 毫升无血清培养基替换 PBS，每 6 厘米培养皿补充抗生素，并将细胞放回组织培养箱中过夜。第二天早上，将培养基转移到冰上的锥形管中。并用新鲜的 PBS 洗涤细胞两次。

然后，胰蛋白酶消化并计数细胞。接下来，离心从细胞培养板中收获的上清液。然后通过 0.45 微米注射器过滤器过滤，并在 80 摄氏度下以 500 微升等分试样冷冻培养基，直到通过 ELISA 分析。

衰老增加相关的 β-gal 染色与复制和 DNA 损伤诱导的衰老有关。请注意衰老细胞的扩大扁平形状与增殖成纤维细胞的纺锤形外观相比。在该实验中，按照书面方案中的描述固定增殖的年轻或复制衰老细胞。

并用抗 DNA 双链断裂和 DAPI 生物标志物的抗体染色。随着在衰老细胞中观察到的 DNA 双链断裂 fosi 数量的明显增加。衰老相关分泌表型因子的 RT-qPCR 分析表明，在 γ 辐照诱导的低传代人二倍体成纤维细胞衰老后，至少一些因素在 mRNA 水平上上调。

通过 γ 辐照细胞培养上清液的 ELISA 进一步证实了这一点。一旦掌握，DNA 损伤诱导和 SA β-gal 染色可以在大约 30 分钟的手动作时间内完成。用于定量 SASP 蛋白水平的条件培养基可在约 30 分钟内制备。

在尝试此过程时，重要的是要记住在进行衰老标志物定量之前监测它们在细胞培养物中经历形态变化。开发后，这些技术为衰老和癌症领域的研究人员探索各种组织、细胞培养物和模式生物的衰老铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何诱导、监测和定量细胞衰老有很好的了解。