Name: 技术诱导和量化细胞衰老 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学习诱导和量化细胞衰老的技术方法，通过γ射线照射和SA-β-gal染色评估衰老标志物。这些方案适用于多种细胞类型，为衰老生物学研究提供可靠工具。

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本研究由美国国立卫生研究院衰老研究所的院内研究计划资助。作者谨此感谢 Myriam Gorospe 和 Kotb Abdelmohsen 就细胞衰老问题提出的诸多有益讨论，并感谢 Kotb Abdelmohsen 对手稿的审阅。我们同时感谢实验室成员，特别是 Douglas Dluzen 对手稿的审阅。

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<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们描述了利用人二倍体成纤维细胞进行复制性衰老和DNA损伤诱导衰老的方法。此外，还包括多种衰老相关蛋白的蛋白质和mRNA水平的定量技术，以及SA-β-半乳糖苷酶染色和DNA损伤标志物γ-H2AX的免疫染色。这些实验方案可广泛用于评估衰老表型 体外 和 体内，尽管在鉴定衰老特征时存在诸多注意事项 体内20其他细胞可能表达衰老标志物，即使它们并非真正的衰老细胞。例如，破骨细胞和巨噬细胞就具有较高的β-半乳糖苷酶活性32,33此外，许多癌细胞中p16表达上调INK4A 34细胞也可能积累DNA损伤（例如， γ-H2AX 焦点），且不应处于衰老状态。SASP 因子也可能在多种正常的生理或病理条件下被上调，而这些条件可能涉及也可能不涉及衰老细胞。因此，在评估细胞衰老时，应联合使用多种衰老标志物 体内.
尽管在20...

半个多世纪前，Hayflick 及其同事描述了未转化细胞在培养中只能进行有限时间的增殖1。长期培养人成纤维细胞会导致细胞停止增殖，但这些细胞仍具有代谢活性，这种现象被称为细胞衰老。衰老在抑制肿瘤发生方面可能具有有益作用，但也可能带来不利影响，因为它被认为会促进随年龄增长而出现的再生能力下降2,3。研究表明，随着人类年龄增长，衰老细胞会在组织中积累4，并被发现参与多种生物学过程，包括胚胎发育、伤口愈合、组织修复以及与年龄相关的炎症反应2。
细胞在培养过程中持续传代会诱导复制性衰老，这种现象与端粒缩短和基因组不稳定性相关。多种细胞应激因素，包括DNA损伤和癌基因，也可导致细胞衰老3。由端粒缩短以外因素引起的衰老通常被称为应激诱导性衰老或早衰，通常依赖于p16INK4A/Rb信号通路5。尽管增殖中的未转化细胞通常呈梭形，衰老细胞则具有一些特定特征，例如扁平且体积增大的形态，以及升高的衰老相关β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）（图1 &amp;#38; 2）。衰老细胞还会积累DNA损伤标志物，如γ-H2AX（图3）6，以及可能存在的衰老相关异染色质灶（SAHF）（图4）7。衰老细胞中细胞周期调控因子的水平升高，包括p16（p16INK4A）和/或p21及p53（图5）8,9。此外，最新研究表明，衰老细胞可通过分泌多种促炎性细胞因子和趋化因子（称为衰老相关分泌表型，SASP）产生非自主性效应10。尽管这种SASP现象在不同细胞类型之间可能存在差异，但通常表现为白细胞介素-6（IL-6）、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长调节癌基因α（GRO-α）和GRO-β等因子的增加（图6）。诱导衰老的特定应激或损伤类型也可能影响其分泌表型11,12,13。SASP可通过ELISA或细胞因子/蛋白质芯片检测分泌蛋白的水平来评估10,14。尽管转录后机制可调控SASP蛋白水平11,15,16,17，但在许多情况下也可检测到mRNA水平的变化。这些变化通常比蛋白质水平的检测更为敏感且易于定量。其他衰老标志物也可进行评估，包括持续存在的DNA损伤灶，即染色质改变强化衰老的DNA片段（DNA-SCARS）18，以及其他多种标志物3,19,20。
本文介绍了在体外培养细胞中诱导细胞衰老的常用技术，以及检测多种衰老标志物的方法，包括SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）、γ-H2AX、衰老相关异染色质灶（SAHF），以及衰老相关分子的蛋白质和mRNA。

<table><tbody><tr><td>16% Tris-甘氨酸凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>酸-苯酚 ChCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300 稀释度</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>康宁公司</td><td>3008</td><td>细胞刮刀</td></tr><tr><td>ECL 抗小鼠 HRP 标记抗体</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus 蛋白质印迹底物</td><td>皮尔斯</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>分子探针</td><td>MP01306</td><td>储存液：5 mg/mL，溶于 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>GAPDH 抗体</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-32233</td><td>1:1,000 - 5,000 稀释度</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>组蛋白H3二甲基化K9单克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 稀释度</td></tr><tr><td>人IL-6 Quantikine ELISA检测</td><td>R&amp;研发系统</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>人IL-8 Quantikine ELISA检测</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>人GROα Quantikine ELISA检测</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-二甲基甲酰胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 单克隆抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 稀释度</td></tr><tr><td>p21 单克隆抗体</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 稀释度</td></tr><tr><td>p53 单克隆抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 稀释，克隆株 DO-1</td></tr><tr><td>磷酸化-H2AX（Ser139）FITC偶联抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9719</td><td>1:2,000 稀释度</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;功率&lt;/em&gt; SYBR Green PCR 主混合液&amp;nbsp;</td><td>应用生物系统公司</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>预染蛋白质分子量标准</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>衰老 &amp;beta;β-半乳糖苷酶染色试剂盒</td><td>细胞信号传导</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

诱导与定量细胞衰老的技术

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

在细胞应激或损伤的条件下，增殖中的细胞可启动一种特定程序，引发长期的细胞周期停滞状态，称为细胞衰老。衰老细胞在机体衰老过程中以及持续培养条件下会逐渐积累。 体外衰老细胞影响多种生物学过程，包括胚胎发育、组织修复与再生、肿瘤抑制以及衰老。衰老细胞的特征包括但不限于衰老相关β-半乳糖苷酶活性升高（SA-β-gal）；p16INK4Ap53 和 p21 水平升高；DNA 损伤水平增加，包括 γ-H2AX；衰老相关异染色质灶（SAHF）的形成；以及获得衰老相关分泌表型（SASP），后者特征为分泌多种促炎性细胞因子和信号分子。本文中，我们描述了在培养细胞中诱导复制性衰老和DNA损伤诱导性衰老的实验方案。此外，我们介绍了利用多种衰老相关标志物监测衰老表型的技术，包括SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、γ-H2AX 和 SAHF 染色，以及细胞周期调控因子和 SASP 因子的蛋白和 mRNA 水平的定量方法。这些方法可应用于不同模型和组织中衰老状态的评估。

图2 - 6 展示SA-的代表性结果&#946;-gal 染色；染色检测 &#947;-γH2AX 和 SAHF；p16 蛋白水平的检测INK4A、p21和p53；以及衰老相关分子的mRNA和蛋白质水平。升高的SA-&#946;-gal染色可检测复制性衰老和DNA损伤诱导的衰老。同时观察衰老过程中出现的形态学变化：与增殖状态下的成纤维细胞呈梭形相比，衰老细胞体积增大、形态变扁平。在本实验范式中，细胞于电离辐射（IR）暴露后7天进行染色，并提取RNA和蛋白质。若在IR暴露后延长等待时间，可能获得更显著的结果即&#160;10天）。每种条件和实验设置均需确定最佳实验条件。这些结果具有代表性，当使用其他方法诱导衰老时，也可检测到这些标志物。
对于图6，所列出的基因名称对应于CXCL1 （GROα）、CXCL2（GRO...

细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由多种细胞应激因素诱导。本文描述了诱导细胞衰老的实验方案以及检测衰老标志物的方法。

在细胞应激或损伤的响应下，增殖细胞可启动一种特定程序，引发长期的细胞周期阻滞状态，称为……

这些技术的总体目标是提供一套工具，用于实现细胞衰老的诱导、监测和定量分析。这些方法有助于回答有关细胞衰老的鉴定与定量，以及调控细胞和有机体衰老的生物学因素等关键问题。这些技术的主要优势在于，它们涵盖了在不同模型、组织和细胞类型中监测细胞衰老的多种方法。首先，将处于早期传代且具有增殖能力的待研究细胞以较低密度接种于适合分析的培养皿中，并在组织培养孵箱中培养过夜。当细胞融合度达到50–60%时，吸除生长培养基，用PBS洗涤细胞两次。第二次洗涤后，用一层薄薄的 PBS 覆盖细胞，并对细胞进行一次 10 Gy 剂量的γ射线照射。随后将 PBS 更换为生长培养基。将细胞放回培养箱中，并每48至72小时更换一次培养基，每天在光学显微镜下监测细胞形态变化。照射后7至10天，在37摄氏度水浴中融化商用衰老相关β-半乳糖苷酶检测试剂盒中的所有试剂。当所有试剂均达到室温后，根据制造商说明书配制固定剂和染色液。用室温的 PBS 轻柔洗涤每个孔。清洗时需小心冲洗细胞，因为衰老细胞贴壁能力较弱，容易在洗涤过程中被去除。每孔加入一毫升固定液，在室温下固定10至15分钟。随后每孔用两毫升PBS洗涤两次。接着每孔加入一毫升β-半乳糖苷酶染色液，并用铝箔纸包裹培养板，在37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中培养24至48小时。在24小时时观察细胞。当细胞染色充分后，用新鲜的PBS替换β-半乳糖苷酶溶液，并使用配备相机的光学显微镜在10倍或更高倍数的物镜下检查培养物。与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞将呈现蓝色。然后，每孔获取至少五个无重叠的图像。手动计数每张图像中与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的总数以及细胞总数，以计算每孔中与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性细胞的百分比。γ射线照射后10天，用PBS洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，将 PBS 替换为 2.5 毫升无血清培养基（每 6 厘米培养皿添加抗生素），并将细胞放回组织培养孵育箱中过夜。次日早晨，将培养基转移至冰上的锥形管中，并用新鲜 PBS 洗涤细胞两次。然后，用胰蛋白酶消化并计数细胞。接着，离心收集自细胞培养板的上清液。随后通过0.45微米注射器滤器过滤，并将培养基以500微升分装后于-80摄氏度保存，直至用于ELISA分析。与复制性衰老和DNA损伤诱导的衰老相关的衰老相关β-半乳糖苷酶染色增强。注意衰老细胞相较于增殖性成纤维细胞的纺锤形外观，呈现出增大、扁平的形态。在本实验中，增殖期的年轻细胞或复制性衰老细胞均按照书面实验方案所述步骤进行固定。并使用针对DNA双链断裂生物标志物的抗体以及DAPI进行染色。在衰老细胞中可观察到DNA双链断裂灶的数量明显增加。对衰老相关分泌表型因子进行RT-qPCR分析，结果显示，在低代次人二倍体成纤维细胞中，经γ射线照射诱导的衰老后，至少部分因子在mRNA水平上表达上调。这一点通过γ射线照射后细胞培养上清液的ELISA检测得到了进一步证实。一旦掌握，DNA损伤诱导和SA-β-半乳糖苷酶染色可在约30分钟的实验操作时间内完成。用于定量SASP蛋白水平的条件培养基可在约30分钟内制备完成。在进行该实验操作时，重要的是要记住，在进入衰老标志物定量分析之前，需先观察细胞培养物中发生的形态学变化。这些技术建立之后，为衰老与癌症领域的研究人员探索多种组织、细胞培养物及模式生物中的细胞衰老现象铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何诱导、监测并定量分析细胞衰老。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

技术诱导和量化细胞衰老

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。...

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

在此，我们提供了一种详细的实验方案，用于在诱导骨骼肌损伤后同时检测衰老细胞和多能干细胞 体内 重编程。该方法适用于评估细胞衰老在组织再生与重编程过程中的作用 体内.

损伤诱导的衰老评估 在体 内 骨骼肌中的重编程

本文讨论了一系列在培养细胞中诱导和验证细胞衰老的实验方案。我们重点关注不同的衰老诱导刺激，并描述了常见的衰老相关标志物的定量方法。我们以成纤维细胞为模型提供了技术细节，但这些方案可适用于多种细胞模型。...

原代人细胞中细胞衰老的诱导与验证

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。...

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

本方案描述了使用脉冲式SILAC对衰老细胞和非分裂细胞进行代谢标记、非靶向质谱分析以及蛋白质半衰期的简化计算的工作流程。...

通过代谢标记与质谱法测定衰老及非分裂培养细胞中的蛋白质周转率

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。...

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。...

利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

该方法研究衰老的皮肤成纤维细胞如何影响健康的成纤维细胞。通过UVB照射诱导细胞衰老，然后将条件培养基施加于正常成纤维细胞。该方法有助于评估靶向皮肤老化过程中异常细胞间通讯的生物活性化合物。...

一种新型抗氧化剂组合用于恢复细胞间健康通讯 体外 使用衰老细胞条件培养基的模型

学习诱导和量化细胞衰老的技术方法，通过γ射线照射和SA-β-gal染色评估衰老标志物。这些方案适用于多种细胞类型，为衰老生物学研究提供可靠工具。

诱导与定量细胞衰老的技术

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