Name: 基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习使用先进成像流式细胞术检测DLBCL细胞系中多种荧光衰老标志物的方法。该技术可快速生成高分辨率图像，实现单细胞水平的空间分布分析和荧光信号定量，为细胞衰老研究提供独特数据。

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本工作获得了林茨约翰开普勒大学资助予Yong Yu的项目（BERM16108001）的支持。

1. 使用马法兰酰胺或柔红霉素处理弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系以诱导细胞衰老
注意：该方案同样适用于贴壁癌细胞。根据细胞大小，将 1-2 × 105 个细胞接种至 6 孔板的一个孔中，并在处理前于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中过夜培养。该方案的步骤与悬浮细胞相同，但有两个例外。第一，在步骤 3.4 之后需用胰蛋白酶消化使细胞从培养板上脱落。第二，在胰蛋白酶消化前的洗涤步骤中不进行离心。
<ol>
	<li>计数弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞，并将细胞以每毫升1 × 106个细胞的密度接种于6孔培养板中，每孔加入4 mL培养基。在含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养DLBCL细胞。</li>
	<li>向细胞培养物中加入MAF（5 µg/mL）或DN（20 ng/mL），轻轻摇动培养板以混匀。 
	注意：MAF和DN不稳定。溶解于DMSO后，应将储备液分装并储存于-20 °C，避免反复冻融。</li>
	<li>将培养板置于5% CO2、37 °C的培养箱中孵育3天。</li>
	<li>孵育3天后，将DLBCL细胞收集至15 mL无菌离心管中，在4 °C、100 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用4 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，并将细胞悬液重新加回6孔板中。</li>
	<li>将细胞培养板继续在5% CO2、37 °C培养箱中培养2天，随后收获细胞用于分析。</li>
</ol>
2. 准备染色用溶液（表1）
3. 使用不同衰老标志物对DLBCL细胞进行染色
注意：需制备使用单个标记染色的细胞样品（即太平洋蓝-EdU、C12FDG 或 Alexa Fluor 647-γH2AX），以生成补偿矩阵，校正检测过程中发生的荧光溢出。尽管强烈建议执行此步骤，但当不同荧光染料的发射光谱重叠可忽略（补偿系数值 ≤ 0.1）时，可省略该步骤。然而，用户在使用不同仪器和荧光检测面板时，必须确定标准化的补偿步骤。
<ol>
	<li>将10 mM EdU溶液以1:1,000的比例加入步骤1.6制备的DLBCL细胞培养物中（最终EdU浓度为10 µM）。轻轻摇动培养板混匀，并在5% CO2、37 °C培养箱中孵育3小时。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，加入100 mM氯喹溶液至终浓度为75 µM（参见讨论部分）。轻轻摇动培养板混匀，并在5% CO2、37 °C培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，加入20 mM C12FDG溶液，按1:1,000稀释（最终C12FDG浓度为20 µM）。轻轻摇动培养板混匀，并在5% CO2、37 °C培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，加入100 mM 2-苯乙基-β-D-硫代半乳糖苷（PETG）溶液，按1:50稀释以终止fSA-β-gal染色（最终PETG浓度为2 mM）。轻轻旋转培养板混匀。</li>
	<li>将细胞转移至15 mL无菌离心管中，在100 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，用4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>重复PBS洗涤步骤一次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL 4%多聚甲醛固定液中。</li>
	<li>室温孵育10分钟后，在250 × g、室温条件下离心5分钟。弃去上清液，用4 mL PBS洗涤细胞。</li>
	<li>重复PBS洗涤步骤一次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL皂苷通透缓冲液中，并将悬液转移至新的1.5 mL离心管中。室温孵育10分钟后，在250 × g、室温条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL一抗溶液中（在抗体孵育液中按1:500稀释γH2AX抗体）。4 °C避光过夜孵育。</li>
	<li>在250 × g、4 °C条件下离心5分钟。弃去上清液，用100 µL皂苷洗涤液洗涤一次。</li>
	<li>再重复洗涤步骤两次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL EdU检测试剂混合液中。</li>
	<li>室温避光孵育30分钟。在250 × g、室温条件下离心5分钟。弃去上清液，用1 mL皂苷洗涤液洗涤一次。</li>
	<li>再重复洗涤步骤两次。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20–50 µL PBS中。随后进入第4节进行样本检测。</li>
</ol>
4. 使用成像流式细胞仪系统检测衰老标志物
<ol>
	<li>清空废液瓶。在开启仪器前，检查流速珠、消毒剂、清洁剂、除泡剂、鞘液和冲洗试剂（去离子水）的液位，确保液体充足（参见材料表）。</li>
	<li>开启仪器及成像软件（参见图1A中的软件界面）。</li>
	<li>点击启动按钮以初始化流路系统并进行系统校准。 
	注意：此过程约需45分钟。</li>
	<li>将放大倍数设为40x，将流速设为低速，并开启实验所需的激光器。开启405 nm、488 nm和642 nm激光器，分别用于检测EdU-太平洋蓝、C12FDG和Alexa Fluor 647-γH2AX（或Alexa Fluor 647-Ki67）。将Ch6设为散射通道，将Ch1和Ch9设为明场。</li>
	<li>从预期荧光最强的样本开始，调节激光强度。轻轻翻转样本管以混匀。打开管盖，将样本管插入进样口。点击加载开始进样。</li>
	<li>打开散点图，分别选择Area_M01和Aspect Ratio_M01作为X轴和Y轴。设置门控，选择长宽比大于0.5的细胞群，以排除下方和右侧的双细胞及细胞聚集体，以及左侧的速度珠群体（图1B）。</li>
	<li>打开直方图，选择Gradient RMS_M01_Ch01作为X轴。选择单细胞群体，并设置门控以筛选聚焦良好的细胞（图1C）。 
	注意：成像系统将自动利用速度珠调整焦距。但建议选择直方图峰值右侧半部分，以获得最佳聚焦的细胞群体。</li>
	<li>打开直方图，为每个荧光通道（Ch2、7和11）选择原始最大像素强度作为X轴。调节激光功率（即分别对应Ch2、7和11的488 nm、405 nm和642 nm激光器），使每种荧光染料的原始最大像素值保持在100至4,000之间，以避免信号过饱和。 
	注意：本实验中，激光功率设置分别为50 mW、200 mW和50 mW，对应488 nm、405 nm和642 nm激光器。</li>
	<li>选择聚焦良好的细胞群体进行记录，点击采集，以一致的参数测量DLBCL样本。更换样本时，点击返回取出样本管，按加载以弃去样本。</li>
	<li>所有样本测量完成后，关闭明场和散射激光。测量单色对照样本，以生成补偿矩阵。</li>
	<li>点击关机关闭成像系统。</li>
	<li>在图像分析软件中分析数据。
	<ol>
		<li>使用图像分析软件中的斑点向导工具，自动计数并量化活细胞图像中细胞核内的γH2AX焦点。选择两个细胞群体（一个高斑点数，一个低斑点数）训练斑点向导，以便后续自动进行斑点计数分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
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<li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740(2021).</li>
<li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方法通过明场成像和基于流式细胞术的定量分析，检测了四种不同弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系在接受化疗处理后进入衰老状态的能力。在单细胞水平上，我们成功检测到经处理的KARPAS422和WSU-DLCL2细胞中存在大量C12FDG+EdU-Ki67+的衰老细胞群体，在OCI-LY1细胞中也有一定程度的出现，而SU-DHL6细胞系则对处理具有抗性。不同细胞系在进入衰老能力上的差异可能归因于其独特的基因组缺陷16,17。然而，不适当的细胞培养密度或药物浓度也可能影响衰老的诱导能力。为了进行更全面的分析，应谨慎选择细胞密度和药物浓度的梯度稀释方案。值得注意的是，该方法的灵敏度足以准确检测在未施加额外基因毒性刺激条件下DLBCL细胞中自然发生的衰老细胞群体（见图3中C12FDG+EdU-Ki67+</...

多种刺激可触发细胞衰老，导致细胞进入稳定的细胞周期阻滞状态。这些刺激包括内在的信号变化或外在的应激因素。内在信号包括端粒进行性缩短、端粒结构改变、表观遗传修饰、蛋白质稳态失调、线粒体功能障碍以及癌基因的激活。外在应激因素包括炎症和/或组织损伤信号、辐射或化学处理以及营养缺乏1,2,3,4。在不同类型的衰老中，最常见且研究最深入的是复制性衰老、癌基因诱导的衰老（OIS）、辐射诱导的衰老以及治疗诱导的衰老（TIS）。OIS 是细胞对异常癌基因激活引起的复制应激所导致的基因毒性损伤的一种急性反应，在一定程度上可阻止癌前病变向完全恶性肿瘤的病理进展。TIS 则发生在肿瘤细胞受到化疗药物或电离辐射应激时5,6。
衰老在病理学中因其高度动态的特性而被视为一把双刃剑。最初，衰老被认为是一种有益的肿瘤抑制机制，可通过清除分裂细胞群体中的受损细胞，保护器官的正常功能并抑制肿瘤生长。7,8,9然而，越来越多的证据表明细胞衰老也存在不利的一面。衰老细胞会分泌促炎性细胞因子，即衰老相关分泌表型（SASP），导致纤维化和器官功能障碍，并促进肿瘤的发生与进展10此外，衰老的癌细胞会伴随染色质重塑和持续性DNA损伤反应（DDR）的激活，同时发生表观遗传和基因表达的重编程。11,12，新获得癌症干细胞特性3尽管具有衰老能力的肿瘤对治疗干预的反应优于缺乏衰老能力的肿瘤13，如果衰老细胞未能被衰老细胞清除药物有效识别并清除，可能会导致较差的长期预后5因此，一种可靠的衰老评估方法具有重要的临床意义，不仅有助于治疗方案的预后判断，也对靶向衰老细胞的新型策略开发至关重要。
无论诱因如何，衰老细胞均表现出一些共同特征，包括体积增大、形态扁平、多核并伴有大空泡，细胞核显著扩张，细胞核内形成富含H3K9me3的衰老相关异染色质灶（SAHF），DNA损伤标志物γH2AX焦点持续积累，p53-p21CIP1和Rb-p16INK4a细胞周期调控通路被激活，细胞稳定停滞于G1期，衰老相关分泌表型（SASP）大量诱导，以及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性升高14。由于单一标志物不足以定义细胞衰老，通常将被视为衰老检测金标准的SA-β-gal酶活性染色，与H3K9me3和Ki67的免疫组织化学染色联合使用，以检测治疗诱导的衰老（TIS）15。然而，基于化学显色的SA-β-gal检测难以实现定量分析。在此，我们结合了5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳糖吡喃苷（C12FDG）荧光法检测SA-β-gal（fSA-β-gal）与γH2AX免疫荧光染色及EdU掺入DNA检测，利用先进的成像流式细胞术系统识别C12FDG+EdU-γH2AX+衰老细胞。该系统结合了流式细胞术的高速度、高灵敏度与显微镜所能提供的单细胞精细图像及空间信息，而这些信息是传统流式细胞术和显微镜各自无法单独提供的。该方法可快速生成高分辨率图像，实现细胞内荧光信号的定位与定量，同时通过建立标准化分析流程，支持多个样本的快速分析。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 抗 H2A.X 磷酸化（Ser139）抗体</td><td>Biolegend</td><td>613407</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ki-67 小鼠单克隆抗体（Alexa Fluor 647）</td><td>Biolegend</td><td>350509</td><td></td></tr><tr><td>C12FDG（5-十二烷酰氨基荧光素二-&amp;beta;-D-半乳吡喃糖苷）</td><td>费舍尔科技</td><td>11590276</td><td></td></tr><tr><td>氯喹-二磷酸盐</td><td>Sigma aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>清洗剂（Coulter Clenz）</td><td>贝克曼库尔特</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Pacific Blue 流式细胞术检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10418</td><td></td></tr><tr><td>柔红霉素</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-13062A</td><td></td></tr><tr><td>除泡剂（70% 异丙醇）</td><td>默克密理博</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件（Amnis&amp;nbsp;IDEAS&amp;nbsp;6.3）</td><td>Luminex</td><td>CN-SW69-12</td><td></td></tr><tr><td>仪器及成像软件（Amnis&amp;nbsp;ImageStreamX&amp;nbsp;Mk II 成像流式细胞仪系统及 INSPIRE 软件）</td><td>Luminex</td><td>100220</td><td></td></tr><tr><td>KARPAS</td><td>DSMZ</td><td>ACC 31</td><td></td></tr><tr><td>马法兰环己胺盐</td><td>Niomech</td><td>D-17272</td><td></td></tr><tr><td>OCI-LY1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 722</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>费舍尔科技</td><td>11473704</td><td></td></tr><tr><td>PETG（2-苯乙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷）&amp;nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>P4902</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>鞘液</td><td>默克密理博</td><td>BSS-1006-B</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBead Kit for ImageStream</td><td>Luminex</td><td>400041</td><td></td></tr><tr><td>消毒剂（0.4–0.7% 次氯酸盐）</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>SU-DHL6</td><td>DSMZ</td><td>ACC 572</td><td></td></tr><tr><td>WSU-DLCL2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 575</td><td></td></tr></tbody></table>

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

化疗药物可在癌细胞中诱导不可逆的DNA损伤，导致细胞凋亡或过早衰老。与凋亡性细胞死亡不同，衰老是一种本质上不同的机制，可抑制&#160;癌细胞的增殖。数十年的科学研究揭示了衰老癌细胞在肿瘤及其微环境中复杂的病理效应，这些效应可调节癌细胞和间质细胞的行为。新近证据表明，细胞衰老是癌症治疗过程中一个重要的预后因素，因此在癌组织样本中快速、准确地检测衰老细胞至关重要。本文介绍了一种用于可视化和检测癌细胞中治疗诱导性衰老（TIS）的方法。采用甲酰磷酰胺（mafosfamide, MAF）或柔红霉素（daunorubicin, DN）处理弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系，并检测衰老标志物——衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）、DNA合成标志物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）以及DNA损伤标志物γ-H2AX（γH2AX）。通过流式细胞仪成像，可在短时间内获得高分辨率的单细胞图像，从而同时对癌细胞中的这三种标志物进行可视化观察和定量分析。

使用图像分析软件加载单色对照样本的记录数据，生成了补偿矩阵。如补充图S1所示，检测到EdU对C12FDG存在不可忽略的光溢出（系数值≥0.1），串扰系数为0.248，而其他通道之间的串扰不显著。四种不同的弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系分别用5 µg/mL MAF或20 ng/mL DN处理以诱导细胞衰老，并采用传统的SA-β-半乳糖苷酶染色或成像流式细胞术方法进行分析。
超过70%的KARPAS422、WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞进入衰老状态，表现为SA-β-半乳糖苷酶阳性，而SU-DHL6细胞对MAF和DN诱导的衰老完全耐受（补充图S2A）。值得注意的是，MAF和DN也在所有DLBCL细胞中诱导了细胞死亡，尽管程度并不显著（补充图S2B）。通过成像流式细胞术方法，单细胞图像及基于流式细胞术的定量分析显示，在KARPAS422、WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞中，C12FDG+EdU<sup...

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。

化疗药物可诱导癌细胞产生不可修复的DNA损伤，从而导致细胞凋亡或过早衰老。与凋亡性细胞死亡不同，……

该方法可快速生成高分辨率图像，能够在允许对多个样本进行快速分析的同时，实现对细胞内荧光信号空间分布及定量的分析。细胞通过先进的成像流式细胞术系统进行检测，该系统结合了检测速度、灵敏度以及包含空间信息的详细单细胞图像，从而获得流式光度法或显微镜无法提供的独特数据。一个重要的建议是提供足量的细胞以建立仪器参数，我们建议在测量时将细胞重悬于高密度状态下。除了上述内容外，该数据采集过程简单直接，与常规流式细胞术类似。首先，按照论文中所述方法建立DLBCL细胞系。然后，以1:1000的比例将10毫摩尔的EdU溶液加入DLBCL细胞培养物中，轻轻摇动培养板混匀后，置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育3小时。孵育结束后取出培养板，加入100毫摩尔的氯喹溶液，使其终浓度为75微摩尔。轻轻摇动混匀，孵育30分钟。然后加入20毫摩尔的C12 FDG溶液，使其终浓度为20微摩尔。轻轻混匀后，将培养板孵育一小时，操作如前所述。接着，加入100毫摩尔的2-苯乙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液（1:50），以终止FSA β-半乳糖苷酶染色。然后轻轻旋转培养板以混匀。将细胞转移至15毫升无菌离心管中，在4°C条件下以100 × g离心5分钟。弃去上清液后，用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并在4°C条件下以100 × g再次离心5分钟。随后，将细胞沉淀重悬于500微升4%多聚甲醛固定液中。室温孵育10分钟后，在室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，用4毫升PBS洗涤细胞两次，并在室温下以100 × g离心5分钟。洗涤后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL皂苷透化缓冲液中。现在将悬液转移至一个新的1.5毫升离心管中，在室温下孵育10分钟。在室温下以250 × g离心5分钟，沉淀细胞。然后在暗处用200微升一抗溶液重悬细胞，并在4°C下过夜孵育。在4°C条件下，以250 × g离心5分钟。弃去上清液，并用100 µL皂苷洗涤液洗涤。细胞洗涤两次后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL EdU检测混合液中。室温避光孵育30分钟，然后在室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，加入1毫升皂苷洗涤液洗涤。重复洗涤两次，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20至50微升PBS中。开启仪器前，清空废液瓶，并检查SpeedBeads、消毒剂、清洗液、除泡剂和鞘液的液位是否充足。开启仪器和成像软件后，点击启动按钮以初始化流路系统并进行系统校准。将放大倍数设置为40倍，流速设置为低速。打开激光器后，开启405纳米激光以检测EdU Pacific Blue，488纳米激光以检测C12-FDG，以及642纳米激光以检测Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX。将第六通道设为散射通道，第一通道和第九通道设为明场。然后从预期荧光最强的样本开始，调节激光强度，并轻轻翻转样品管以混匀。打开管盖后，将样本管插入对接座。点击“加载”以启动并打开散点图。接下来，在“特征”区域中，分别选择 MO1 和长径比 MO1 作为 X 轴和 Y 轴。设置门控，选择长宽比大于0.5的细胞，以排除下方和右侧的双联体及细胞聚集体，以及左侧的SpeedBead群体。现在打开直方图，X轴选择掩膜一和通道一的特征梯度均方根。选择单细胞群体，并设置门控以筛选出聚焦良好的细胞。打开直方图，为第二、第七和第十一通道的 X 轴选择原始最大像素强度。然后分别调整 488 纳米、405 纳米和 642 纳米激光器的激光功率，使每个荧光染料的原始最大像素值介于 100 至 4,000 之间，以避免过度饱和。选择聚焦的细胞群进行记录，点击“采集”以一致的设置测量弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）样本。更换样品进行测量时，单击返回以取回样品管。按加载键以弃去样品。所有样品测量完成后，关闭明场和散射激光器。测量单色对照样本以生成补偿矩阵。单击“关闭”以关闭成像系统。在图像分析软件中分析数据。使用图像分析软件中的“斑点向导”（Spot Wizard）工具，自动计数并定量细胞核内γH2AX焦点及活细胞图像。选择两个细胞群体，一个斑点数量较多，另一个较少，用于训练“斑点向导”以进行后续的自动斑点计数分析。单细胞图像的流式细胞术结果显示，C12-FDG阳性、EdU阴性、γH2AX阳性、衰老细胞群体以及KARPAS422细胞系均有所增加。WSU-DLCL2 和 OCI-LY1 细胞中存在显著更多的γH2AX灶，但在SU-DHL6细胞中不存在。基于成像的分析显示KARPAS422、WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞中γH2AX灶的数量显著增加，而在SU-DHL6细胞中则无此现象。频率和定量数据也呈现出类似的结果。向细胞悬液中加入皂苷至关重要，否则抗体无法接触到细胞内的抗原，而使用强效去垢剂则会导致C12-FTG信号的丢失。成像流式细胞术非常适合分析标志物定位的变化，例如转录因子在特定刺激下向细胞核的转位。此类分析也可通过本方案实现。该方法可在单细胞水平上对多种荧光标记进行可视化，有助于检测各信号的存在、强度及其定位情况。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

本视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于通过双衰老标志物定量治疗诱导的衰老癌细胞。衰老细胞的检测与定量涉及使用β-半乳糖苷酶底物。该底物被衰老细胞内活跃的溶酶体β-半乳糖苷酶切割，产生荧光产物，结合自发荧光的脂褐素颗粒，共同标记衰老的癌细胞。...

基于流式细胞术的治疗诱导癌细胞衰老定量分析

本视频演示了一种 原位 利用荧光多光谱成像技术分析肿瘤组织中不同亚群的浸润性T细胞。将肾细胞癌组织冷冻切片用抗体处理，标记表达特定抑制性受体并呈现免疫治疗耐受表型的CD8+ T细胞。通过多光谱显微镜观察标记后的切片，以鉴定不同的CD8+...

多重免疫荧光成像分析对免疫治疗耐药的T细胞亚群

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。...

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

用于双色荧光显微镜的双相机发射分光系统能够生成具有优异光学和时间分辨率的实时图像序列，这是某些活细胞检测（包括平行板流动腔黏附实验）所必需的。当使用软件将同时获取的发射通道图像进行合并时，可生成伪彩图像序列。...

同时利用双相机发射分光系统在两个发射通道中捕获实时图像：在细胞黏附研究中的应用

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

我们介绍一种流式细胞术方法，可同时鉴定从小鼠脑或脊髓中分离的不同细胞类型。该方法可用于在神经退行性疾病中分离或表征纯化的细胞群体，或用于定量评估在体内给予病毒载体或纳米颗粒后对细胞的靶向程度。...

通过不同匀浆方法从小鼠脑/脊髓中分离多种细胞类型的同步流式细胞术表征

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。...

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的...

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

学习使用先进成像流式细胞术检测DLBCL细胞系中多种荧光衰老标志物的方法。该技术可快速生成高分辨率图像，实现单细胞水平的空间分布分析和荧光信号定量，为细胞衰老研究提供独特数据。

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

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