同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

该方法可快速生成高分辨率图像，能够在允许对多个样本进行快速分析的同时，实现对细胞内荧光信号空间分布及定量的分析。细胞通过先进的成像流式细胞术系统进行检测，该系统结合了检测速度、灵敏度以及包含空间信息的详细单细胞图像，从而获得流式光度法或显微镜无法提供的独特数据。一个重要的建议是提供足量的细胞以建立仪器参数，我们建议在测量时将细胞重悬于高密度状态下。

除了上述内容外，该数据采集过程简单直接，与常规流式细胞术类似。首先，按照论文中所述方法建立DLBCL细胞系。然后，以1:1000的比例将10毫摩尔的EdU溶液加入DLBCL细胞培养物中，轻轻摇动培养板混匀后，置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育3小时。

孵育结束后取出培养板，加入100毫摩尔的氯喹溶液，使其终浓度为75微摩尔。轻轻摇动混匀，孵育30分钟。然后加入20毫摩尔的C12 FDG溶液，使其终浓度为20微摩尔。

轻轻混匀后，将培养板孵育一小时，操作如前所述。接着，加入100毫摩尔的2-苯乙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液（1:50），以终止FSA β-半乳糖苷酶染色。然后轻轻旋转培养板以混匀。

将细胞转移至15毫升无菌离心管中，在4°C条件下以100 × g离心5分钟。弃去上清液后，用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并在4°C条件下以100 × g再次离心5分钟。随后，将细胞沉淀重悬于500微升4%多聚甲醛固定液中。

室温孵育10分钟后，在室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，用4毫升PBS洗涤细胞两次，并在室温下以100 × g离心5分钟。洗涤后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL皂苷透化缓冲液中。

现在将悬液转移至一个新的1.5毫升离心管中，在室温下孵育10分钟。在室温下以250 × g离心5分钟，沉淀细胞。然后在暗处用200微升一抗溶液重悬细胞，并在4°C下过夜孵育。

在4°C条件下，以250 × g离心5分钟。弃去上清液，并用100 µL皂苷洗涤液洗涤。细胞洗涤两次后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL EdU检测混合液中。

室温避光孵育30分钟，然后在室温下以250 × g离心5分钟。弃去上清液，加入1毫升皂苷洗涤液洗涤。重复洗涤两次，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20至50微升PBS中。

开启仪器前，清空废液瓶，并检查SpeedBeads、消毒剂、清洗液、除泡剂和鞘液的液位是否充足。开启仪器和成像软件后，点击启动按钮以初始化流路系统并进行系统校准。将放大倍数设置为40倍，流速设置为低速。

打开激光器后，开启405纳米激光以检测EdU Pacific Blue，488纳米激光以检测C12-FDG，以及642纳米激光以检测Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX。将第六通道设为散射通道，第一通道和第九通道设为明场。然后从预期荧光最强的样本开始，调节激光强度，并轻轻翻转样品管以混匀。

打开管盖后，将样本管插入对接座。点击“加载”以启动并打开散点图。接下来，在“特征”区域中，分别选择 MO1 和长径比 MO1 作为 X 轴和 Y 轴。

设置门控，选择长宽比大于0.5的细胞，以排除下方和右侧的双联体及细胞聚集体，以及左侧的SpeedBead群体。现在打开直方图，X轴选择掩膜一和通道一的特征梯度均方根。选择单细胞群体，并设置门控以筛选出聚焦良好的细胞。

打开直方图，为第二、第七和第十一通道的 X 轴选择原始最大像素强度。然后分别调整 488 纳米、405 纳米和 642 纳米激光器的激光功率，使每个荧光染料的原始最大像素值介于 100 至 4,000 之间，以避免过度饱和。选择聚焦的细胞群进行记录，点击“采集”以一致的设置测量弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）样本。

更换样品进行测量时，单击返回以取回样品管。按加载键以弃去样品。所有样品测量完成后，关闭明场和散射激光器。

测量单色对照样本以生成补偿矩阵。单击“关闭”以关闭成像系统。在图像分析软件中分析数据。

使用图像分析软件中的“斑点向导”（Spot Wizard）工具，自动计数并定量细胞核内γH2AX焦点及活细胞图像。选择两个细胞群体，一个斑点数量较多，另一个较少，用于训练“斑点向导”以进行后续的自动斑点计数分析。单细胞图像的流式细胞术结果显示，C12-FDG阳性、EdU阴性、γH2AX阳性、衰老细胞群体以及KARPAS422细胞系均有所增加。

WSU-DLCL2 和 OCI-LY1 细胞中存在显著更多的γH2AX灶，但在SU-DHL6细胞中不存在。基于成像的分析显示KARPAS422、WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞中γH2AX灶的数量显著增加，而在SU-DHL6细胞中则无此现象。频率和定量数据也呈现出类似的结果。

向细胞悬液中加入皂苷至关重要，否则抗体无法接触到细胞内的抗原，而使用强效去垢剂则会导致C12-FTG信号的丢失。成像流式细胞术非常适合分析标志物定位的变化，例如转录因子在特定刺激下向细胞核的转位。此类分析也可通过本方案实现。该方法可在单细胞水平上对多种荧光标记进行可视化，有助于检测各信号的存在、强度及其定位情况。