基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

该方法可以快速生成高分辨率图像，允许分析细胞内荧光信号的空间分布和定量，同时允许快速分析多个样品。使用先进的成像流式细胞术系统测量细胞，将速度、灵敏度和详细的单细胞图像与空间信息相结合，产生流式视光学或显微镜无法提供的独特数据。一个重要的建议是提供足够的电池来建立仪器设置，我们将细胞以高密度悬浮以进行测量。

除此之外，数据采集非常简单，类似于传统的流式细胞术。首先生成手稿中描述的DLBCL细胞系。然后将10毫摩尔EdU溶液以1:1000的比例加入DLBCL细胞培养物中，并将板在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育3小时，然后通过轻轻摇动混合板。

孵育后取出板，加入100毫摩尔氯喹溶液至终浓度为75微摩尔。轻轻摇动混合并孵育 30 分钟。然后加入20毫摩尔C12 FDG溶液至终浓度为20微摩尔。

轻轻混合后，如前所述将板孵育一小时。接下来，以 1 至 50 的比例加入 100 毫摩尔 2-苯乙基-β-d-硫代半乳糖苷溶液以停止 FSA β-半乳糖染色。并轻轻旋转盘子进行混合。

将细胞转移到15毫升无菌离心管中，并在4摄氏度下以100倍G旋转5分钟。丢弃上清液后，用四毫升PBS洗涤细胞，并在4摄氏度下以100倍G离心5分钟。然后将细胞沉淀在4%多聚甲醛固定溶液中的500微升中重新悬浮。

在室温下孵育10分钟后，在室温下以250倍G离心5分钟。弃去上清液，用四毫升PBS洗涤细胞两次，并在室温下以100倍G离心5分钟。洗涤后，弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在200微升皂苷透化缓冲液中。

现在将悬浮液转移到新的1.5毫升管中，并在室温下孵育10分钟。在室温下以250倍G沉淀细胞五分钟。然后将细胞重新悬浮在200微升一抗溶液中，并在黑暗中以4摄氏度孵育过夜。

在 250 倍 G 下以 4 摄氏度离心管五分钟。弃去上清液，用100微升皂苷洗涤液洗涤。洗涤细胞两次后，弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在500微升EdU检测混合物中。

在室温下在黑暗中孵育30分钟，并在室温下以250倍G离心5分钟。弃去上清液，用一毫升皂苷洗涤液洗涤。重复洗涤两次，弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在20至50微升PBS中。

在打开仪器之前，清空废液瓶并检查速珠、灭菌器、清洁器、除泡器和护套的液位是否充足。打开仪器和成像软件后，单击启动按钮以初始化流体和系统校准。将放大倍率设置为 40 倍，并将流体速度设置为低。

打开激光器后，打开405纳米激光测量EdU Pacific Blue，488纳米测量C12-FDG，642纳米测量Alexa-Fluor-647-γ-H2AX。为散射通道设置通道六，为明场设置通道 1 和通道 9。然后从预期具有最高荧光的样品开始，以设置激光的强度，并轻轻翻转样品管进行混合。

打开试管盖后，将样品管插入底座上。单击加载以开始并打开散点图。接下来，选择 特征 区域，下划线 MO1 和纵横比下划线 MO1 分别用于 X 轴和 Y 轴。

将上方的门设置为0.5，以排除下方和右侧的双峰和细胞聚集体以及左侧的SpeedBead群。现在，打开直方图并为X轴选择掩码1和通道1的特征梯度均方根。选择单重态群体并设置门以选择聚焦细胞。

打开直方图并为 X 轴通道 2、7 和 11 选择原始最大像素强度。然后分别调整通道二、七和 11 的 488 纳米、405 纳米和 642 纳米激光器的激光功率，使每个荧光染料的原始最大像素值在 100 到 4， 000 之间，以避免过饱和。选择要记录的重点人群，然后单击"获取"以一致的设置测量DLBCL样本。

更换样品进行测量时，单击返回以恢复样品管。按加载以丢弃样本。测量完所有样品后，关闭明场并散射激光。

测量单色对照样品以生成补偿矩阵。单击关机关闭成像系统。在图像分析软件中分析数据。

使用图像分析软件的点向导工具自动计数和量化核伽马 H2AX 病灶和活细胞图像。选择两个细胞群，一个具有高斑点计数，一个具有低斑点计数，以训练斑点向导以进行进一步的自动斑点计数分析。单细胞图像中的流式细胞术方法显示C12-FDG阳性，EdU阴性，γH2AX阳性，衰老群体和KARPAS422增加。

WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞，但不在SU-DHL6细胞中。基于成像的分析显示γ H2AX病灶和KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1的数量显着增加，但在SU-DHL6细胞中则不然。频率和定量数据表示了类似的结果。

在细胞悬液中添加皂苷至关重要，否则抗体无法到达细胞内部抗原，刺激性去垢剂会导致C12-FTG信号丢失 成像细胞术是分析标志物定位变化的最佳选择，例如转录因子对某些刺激的易位到细胞核。这样的分析也可以通过我们的协议来实现。该方法允许在单细胞水平上可视化多个荧光标记物，这有助于检测单个信号的存在、强度和定位。