使用多电极阵列（MEA）的人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CM）的电生理分析

该程序的总体目标是解离源自人类多能干细胞的心肌细胞，并将它们接种在多电极阵列上，以测量和量化其典型电信号（也称为场电位）的持续时间和频率。这种方法可以帮助回答该领域的关键问题，例如携带突变的心肌细胞和对照之间的电生理差异是什么。该技术的主要优点是它允许对来自患者细胞的人心肌细胞进行药物筛选。

这种方法的视觉演示至关重要。因为解离和电镀步骤对于成功的电信号记录至关重要。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为识别质量好坏的电信号并非易事，自由电位的分析需要经验。

要开始此过程，请将干净的芯片放入直径为 10 厘米的标准塑料无菌培养皿中。接下来，向培养皿中加入 8 毫升无菌蒸馏水，形成一个加湿室，这将防止芯片上的少量培养基在放入培养箱时被吸入。然后使用定制的聚四氟乙烯环，以确保心肌细胞电镀在电极阵列所在的芯片中心。

在培养罩中，从乙醇中取出环。将它们放入没有盖子的无菌培养皿中，让环在罩中晾干。然后使用火焰消毒的镊子将干燥环放入 MEA 芯片内。

通过在环内添加 50 μL 每毫升 40 μg 纤连蛋白来包被电极。之后，用盖子盖住培养皿，小心地将含有 MEA 芯片的培养皿转移到培养箱中。然后将含有 MEA 芯片的培养皿转移到细胞培养罩中。

在使用 MEA 芯片之前，使用 P200 移液器或通风橱中的真空系统吸出 50 微升纤连蛋白，而不会移位 PTFE 环。保持尖端倾斜，确保没有固体物体接触电极。然后轻轻加入 950 微升 LI-BPEL 培养基，确保其分布均匀且环不会漂浮。

随后将培养皿放回培养箱中。这是跳动心肌细胞的初始培养。在组织培养罩中，从 hPSC-CMs 培养物中充分吸出培养基。

向每个孔中加入 1 至 2 毫升不含钙和镁的 PBS，以洗涤培养物并吸出 PBS。然后向每个孔中加入 500 微升解离酶。将样品在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

5 分钟后，向每个孔中加入 1 mL LI-BPEL 以稀释酶。用 P1000 移液器轻轻刮擦 hPSC-CM 单层，以分离它们。然后将细胞悬液收集在 15 毫升试管中。

接下来用 1 毫升 LI-BPEL 冲洗孔，以收集所有剩余的细胞和细胞团块。再加入 2 到 3 毫升 LI-BPEL，达到大约 5 到 6 毫米的最终体积，然后用 5 毫升移液器轻轻上下移液 3 到 5 次以解离细胞团块。然后，在室温下以 300 x g 离心细胞 3 分钟。

之后，去除上清液，不要移动细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于 250 微升 LI-BPEL 中。随后，通过将细胞悬液直接移入电极阵列顶部的 PTFE 环中心，每个 MEA 分配 50 μL 细胞悬液。

小心地将 MEA 转移到 37 摄氏度的培养箱中，让细胞附着过夜。电镀后一天，在无菌环境中使用无菌镊子小心地取下环。用 80% 的乙醇冲洗戒指。

并将其储存在含有 50% 新鲜乙醇的 80 毫升试管中。接下来，从 MEA 芯片中轻轻去除 500 微升培养基。并向其中添加 500 微升新鲜的 LI-BPEL。

这些是环移除后跳动的心肌细胞。然后将 MEA 转移到 37 摄氏度的培养箱中。然后从环移除后 1 天开始测量 MEA 上 hPSC-CMs 的电活性，最多一周。

现在启动链接到 MEA 设置的软件套件。接下来在 TCX-Control 中将温度设置为 37 摄氏度以记录测量值。之后，从培养箱中取出含有 MEA 芯片的培养皿。

从培养皿中取出 MEA 芯片，将其放在纸巾上以吸收残留的水。用纸巾小心擦拭板的外部环境，并使用蘸有 100% 乙醇的棉签清洁，以去除任何可能导致信号噪声的残留水或碎屑。然后将 MEA 板转移到 37 摄氏度的记录头载物台上，以检测自发活动。

打开 MC Rack 并单击 edit 以加载 MEA 硬件。要创建新协议，请使用下拉菜单 edit 向协议添加不同的记录器和显示窗口。随后，通过单击播放按钮以播放模式启动协议。

如果信号明显表现出可见的 R 峰和 T 峰，请等待 10 到 15 分钟以结束适应阶段。要开始实验，请单击 record（录制），然后在基准条件下播放并采集数据 10 分钟以确定稳定状态。注释具有最佳信号的电极，以便轻松识别并导出以供以后分析。

对于药物反应评估，每 10 分钟添加一次浓度递增的药物。单击 stop 在协议结束时结束录制。以下是使用 MEA 记录的代表性迹线，显示质量良好的迹线，RQ 和 T 峰清晰可见，信噪比高。

质量差的迹线，没有清晰可见的 RQ 和 T 峰以及有噪声的迹线，RQ 和 T 峰清晰可见，但信噪比较低。以下是使用 hPSC-CM 在 MEA 实验期间可以记录的具有不同形态的高质量场电位迹线的代表性示例。阴影区域表示分析期间测得的 QT 间期。

由于 MEA 的场势类似于动作电位的一阶导数，因此场电位迹线的积分已被计算为接近完全动作电位再极化的 T 波的理论演示。在尝试此过程时，请务必记住使用最多的电极，以确保信号可靠且一致。在此程序之后，可以使用其他方法，如双币种胫骨时间 PCR 或单细胞膜片钳，以回答其他问题，例如与电表型或特定离子电流密度相关的特定基因表达。

开发后，这项技术为干细胞领域的研究人员铺平了道路，使用源自人类多能干细胞的心肌细胞探索心律失常和体外药理学。观看本视频后，您应该对如何在 MEA 上解离和接种人多能干细胞衍生的心肌细胞进行电生理测量和药物筛选有很好的了解。不要忘记，使用药物可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如标准 GLP。