Name: 使用多电极阵列（MEA）的人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CM）的电生理分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 了解使用多电极阵列对人多能干细胞来源的心肌细胞进行电生理分析的方法。该技术可测量场电位并评估药物反应，为心脏疾病建模和个性化医疗中的药物筛选提供可靠支持。

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本工作获得了以下资助：CVON（HUSTCARE）：荷兰心血管研究计划（荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰健康研究与发展组织以及荷兰皇家艺术与科学学院）；欧洲研究理事会（ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC）。&#160;我们感谢E. Giacomelli（LUMC）在hPSC心肌分化方面的帮助。

1. 溶液与试剂的配制
<ol>
	<li>使用低胰岛素、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、必需脂质（LI-BPEL）培养基34,35,36配制hPSC-CM培养液，具体方法见表1中所述试剂。用0.22 µm孔径滤器过滤培养基，4 °C保存，最长可保存2周。</li>
	<li>将1 mg人重组纤连蛋白溶于5 mL无菌蒸馏水中，配制成200 µg/mL的储存液，分装后于-80 °C保存。</li>
	<li>配制1% (w/v) 酶洗涤剂溶液（见材料表），用于清除微阵列芯片上的残留细胞：将1 g酶洗涤剂粉末溶于100 mL温热（约40–45 °C）的去离子水中。待溶液冷却后，4 °C保存，最长可保存一年。</li>
</ol>
2. MEA芯片的灭菌（图1A）
注意：MEA 有多种不同配置，包括单孔或多孔格式。此处描述的方案使用单腔室 MEA，其包含 60 个记录电极，呈 8 × 8 网格排列（参见材料表）。电极直径为 30 µm，电极间距为 200 µm。此外还设有一个参考电极。
<ol>
	<li>用去离子水彻底冲洗芯片。</li>
	<li>将MEA芯片放入可高压灭菌的玻璃培养皿中，用铝箔包裹培养皿。</li>
	<li>在实验室高压锅中对芯片进行6分钟灭菌。打开前让培养皿冷却。 
	注意：或者，可将芯片浸入1 mL 80%（v/v）乙醇中，在室温下进行灭菌&#160;15–30 分钟。</li>
	<li>将芯片置于细胞培养罩中，并用紫外光照射表面约30分钟。</li>
</ol>
3. MEA芯片的包被（图1B和1C）
<ol>
	<li>将洁净的芯片放入标准的 10 cm Ø 塑料无菌培养皿中。</li>
	<li>向培养皿中加入 8 mL 无菌去离子水，以形成湿润环境，防止芯片上的少量培养基在放入培养箱时干燥。</li>
	<li>使用定制的聚四氟乙烯（PTFE）环（图 1B），确保将心肌细胞接种在芯片中央，即电极阵列所在的位置。（PTFE 环此前保存在 80% 乙醇中。）在超净台内，将环从乙醇中取出，放入无盖的无菌培养皿中，并在超净台内使其干燥。</li>
	<li>使用火焰灭菌的镊子将一个干燥的环放入一个 MEA 芯片内（图 1C）。 
	注意：也可使用 80% 乙醇清洗镊子，并在组织培养超净台内晾干后再使用。</li>
	<li>解冻一份人重组纤连蛋白原液（200 µg/mL 溶于去离子水），用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 稀释，配制成 40 µg/mL 的工作液。通过在环内加入 50 µL 的 40 µg/mL 纤连蛋白溶液，对电极进行包被。 
	注意：使用人重组纤连蛋白包被可确保 hPSC-CM 的最佳贴附效果。然而，&#160;也可使用其他类型的包被蛋白，如牛纤连蛋白或细胞外基质蛋白混合物。</li>
	<li>盖上 10 cm Ø 塑料培养皿的盖子，小心地将含有 MEA 芯片的培养皿转移至培养箱。在 37 °C 下孵育至少 1 小时，或在 4 °C 过夜。</li>
	<li>将含有 MEA 芯片的培养皿转移回细胞培养超净台。使用 MEA 芯片前，用 P200 移液器或超净台内的真空系统吸除 50 µL 纤连蛋白溶液，注意不要移动 PTFE 环。此步骤应使用塑料吸头。确保无任何固体物体（例如，&#160;移液器吸头）接触培养皿内部，以免损坏电极。 
	注意：此操作可延长 MEA 芯片的使用寿命。</li>
	<li>轻柔地加入 950 µL 的 LI-BPEL 培养基（参见 表 1 和 材料表），确保液体均匀分布且环不会漂浮。将培养皿放回培养箱。</li>
</ol>
4. hPSC-CM 的解离与铺板（图2）
注意：此处描述的方案使用了通过细胞因子在单层培养中分化的大约18天后的hPSC-CMs34。然而，该方案已被证实适用于任何二维（2D）和三维（3D）&#160;hPSC-CM培养体系。当使用更早或更晚时间点分化的细胞时，可能需要调整解离酶（见材料表）的孵育时间。以下体积适用于12孔板中的单个孔（3.8 cm2）。
<ol>
	<li>吸出hPSC-CMs培养孔中的培养基。</li>
	<li>在超净工作台内操作，每孔加入1–2 mL不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤培养物，随后吸除PBS。</li>
	<li>每孔加入500 µL解离酶溶液，在37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>每孔加入1 mL LI-BPEL以稀释酶液。使用P1000移液器轻轻刮擦，使hPSC-CMs单层细胞脱落。将细胞悬液收集至15 mL离心管中。</li>
	<li>用1 mL LI-BPEL冲洗孔内残留的细胞及细胞团块，并收集入离心管。</li>
	<li>再加入2–3 mL LI-BPEL，使终体积达到5–6 mL，使用5 mL移液器轻柔吹打3–5次，以分散细胞团块。 
	注意：此时无需将细胞完全解离为单细胞，因为这会影响细胞存活率。保留少量细胞簇有助于提高细胞活力。</li>
	<li>在室温&#160;下以300 × g离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，尽量去除多余液体，但避免扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用250 µL LI-BPEL重悬细胞沉淀（使用P1000，吹打动作需极其轻柔）。</li>
	<li>将细胞悬液分装至MEA芯片，每片约50 µL（一个12孔板中的单孔可制备最多5片MEA），直接将细胞悬液滴加至PTFE环中央、电极阵列上方。 
	注意：由于存在细胞簇，此时难以准确计数，每片MEA上的细胞总数可能因hPSC-CMs来源不同而有较大差异。接种时应确保解离后的细胞云覆盖电极区域。</li>
	<li>小心将MEA芯片转移至37 °C培养箱中，过夜静置使细胞贴壁。</li>
</ol>
5. 去除琼脂环与培养基更换（图3）
<ol>
	<li>铺板后第1天，在无菌环境中使用无菌镊子小心移除环状结构（图3A-3B）。</li>
	<li>用80%（v/v）乙醇冲洗该环，并将其储存于含有新鲜80%（v/v）乙醇的50 mL离心管中。</li>
	<li>轻柔地从MEA芯片中移除500 µL培养基，并加入500 µL新鲜的LI-BPEL培养基。</li>
	<li>将MEA芯片转移至37 °C培养箱中。 
	注意：细胞通常在移除环状结构并更换培养基后的1–7天内开始搏动（图3C）。</li>
	<li>在移除环状结构后的1–7天内，利用MEA检测hPSC-CMs的电活动。</li>
</ol>
6. 检查信号质量（图4）
<ol>
	<li>打开计算机并启动与MEA系统连接的软件套件：TCX-Control、MC_MEA Select 和 MC_Rack。在TCX-Control中将温度设置为37 °C，以在生理温度下记录测量数据。</li>
	<li>从培养箱中取出含有MEA芯片的培养皿。打开盖子，取出MEA芯片，并将其放置在纸巾上以吸除残留水分。</li>
	<li>用纸巾小心擦拭芯片板外部的电极接触点，并使用蘸有100%（v/v）乙醇的棉签清洁这些接触点，以去除可能引起信号噪声的残留水分或碎屑。</li>
	<li>将MEA芯片板转移至加热（37 °C）的记录头阶段，以检测自发性电活动（例如，硬件：见材料表；软件：MC_Rack）。
	<ol>
		<li>打开MC_Rack：点击“Edit” → “Add MC_Card”以创建新协议。使用“Edit”下拉菜单向协议中添加不同的Recorder和Display窗口。 
		注意：建议采样频率至少为10 kHz。我们使用的协议包含一个Longterm Display Tool，显示整个MEA芯片的完整布局，以及一个Spike Sorter，用于实时捕捉药物效应。Spike Cutout参数设置为“Pre Trigger”20 ms、“Post Trigger”800 ms和“Dead Time”2 ms。该协议可保存为“.rck”文件，并在实验开始前重新加载。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击“play”按钮，以播放模式启动协议。 
	注意：此时可以重新加载步骤6.5中保存的协议。在MC_Rack中，通过点击“File” → “Open”来加载协议（.rck文件扩展名）。</li>
	<li>如果信号中清晰可见R峰和T峰，则等待10–15分钟以完成适应阶段。良好与低质量信号示例见图4。 
	注意：如果在任何电极上均无法检测到T峰，则不应继续实验。这通常是由于hPSC-CMs电活动较弱或细胞与电极附着不良所致。</li>
</ol>
7. 开始实验并记录
<ol>
	<li>点击“记录”然后点击“播放”，在基线条件下采集10分钟数据，以确定稳态。对信号最佳的电极进行标注，以便后续能够轻松识别并导出用于分析。</li>
	<li>为评估药物反应，每隔10分钟加入递增浓度的药物。例如，加入hERG阻断剂E4031，终浓度为1 μM。具体操作为：移除100 μL培养基，加入等体积溶于培养基中的10 μM E4031。 
	注意：如Cavero及其同事先前所证实31，选择合适的药物溶解体积至关重要，因其可能显著改变药物反应曲线。</li>
	<li>对所有其他感兴趣的药物浓度重复步骤7.2。</li>
	<li>在实验方案结束时，点击“停止”以结束记录。</li>
</ol>
8. 微电极阵列的清洁与重复使用
<ol>
	<li>实验记录结束后，使用 P1000 移液器轻柔地移除培养基。切勿触碰培养皿内壁，以免损坏电极。根据当地安全规定处理废液。</li>
	<li>使用洗瓶以去离子水冲洗 MEA 芯片，并重复清洗 3–4 次。 
	注意：此时无需确保细胞完全从芯片上脱离。</li>
	<li>向每个孔中加入 1 mL 1% (v/v) 酶类洗涤剂溶液，于 4 °C 条件下孵育过夜，以促进细胞脱离和清除。</li>
	<li>第二天，用去离子水彻底冲洗 MEA 芯片，以去除酶类洗涤剂溶液及残留细胞，然后加入 1 mL 去离子水。清洁后的 MEA 芯片可浸泡于去离子水中，于 4 °C 保存。</li>
</ol>
9. 数据导出
<ol>
	<li>打开与MEA系统连接的MC_Data Tool软件。</li>
	<li>点击“文件” → “打开MCD”。</li>
	<li>点击“工具” → “将MCD转换为ABF”。</li>
	<li>选择记录信号最佳的电极用于导出分析。选择要保存导出文件的目录，然后点击“保存”。导出过程可能需要数分钟，具体时间取决于导出的电极数量和记录文件的总大小。</li>
</ol>
10. 数据分析
<ol>
	<li>下载并安装电生理数据采集与分析软件（例如&#160;pClamp）。安装完成后，启动分析软件（例如Clampfit）。</li>
	<li>RR 间期计算（图 5）。
	<ol>
		<li>放置两个垂直光标以在波形上定义感兴趣区域。选择“事件检测” → “阈值搜索”。水平光标应穿过所有需要量化的事件，如图 5A所示。</li>
		<li>点击“确定”，然后选择“接受整个类别”。软件将自动搜索波形中所有符合条件的事件。事件上方将标有蓝色标记。</li>
		<li>通过调整主事件检测窗口中的参数，优化自动选择的灵敏度。</li>
		<li>当所有事件均被自动识别后，进入结果窗口（窗口 → 结果），复制标题为&#34;Intervent Interval&#34;的列，该列包含频率数据（图 5B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>QT 间期计算（图 6–9）：
	<ol>
		<li>在稳态条件下，于单个动作电位（FP）起始前和结束后的波形位置各放置一个光标。选择“事件检测” → “创建模板”（图 6）。</li>
		<li>确认动作电位（FP）被正确识别后，点击“添加”。模板将移至下方面板。</li>
		<li>将模板保存为“.atf”文件。由此创建的模板波形将被软件用于在整个记录中进行搜索（图 7）。为每种实验条件单独创建一个模板，因为药物效应可能改变动作电位的形态。如有必要，可对波形进行轻微滤波，确保两个光标之间的数据点不超过 10,000 个。</li>
		<li>模板以“.atf”扩展名保存后，选择“事件检测” → “模板搜索”，并加载该模板。</li>
		<li>调整&#34;模板匹配阈值&#34;，以准确识别所选区间内的所有动作电位（FP）。</li>
		<li>当所有事件均被正确识别后，将其保存为一个新的“.abf”文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分析软件打开文件，并自动计算 Q/R 峰和 T 峰的“达峰时间”（图 8、图 9）。若波形噪声较大，可应用滤波处理。在任意电子表格编辑软件中，通过将 T 峰时间减去 Q/R 峰时间，计算 QT 间期。</li>
</ol>

C.L.M. 是 Pluriomics bv 的联合创始人兼顾问。部分出版费用由 Multi Channel Systems 承担。

本方案展示了如何解离和制备人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs），以使用多电极阵列（MEAs）测量其场电位（FP）。hPSC-CMs通常表现出自发性电活动，该活动可被记录为场电位（FP），并可提供有关搏动频率、QT间期持续时间以及心律失常事件的有意义数据。
二维心肌分化培养物的解离对于在多电极阵列（MEA）上重建搏动细胞层至关重要，是其中的关键步骤。反复吹打造成的机械应力和/或剧烈的解离酶处理可能导致细胞死亡率升高、细胞无法贴附于MEA板以及缺乏自发性电活动。本方案已针对单层培养物进行了优化。然而，对于三维（3D）培养物（例如，类胚体或EBs），采用类似方法并进行少量修改亦可适用，例如先收集EBs，随后用PBS洗涤，并延长解离酶孵育时间。重要的是，无论是二维还是三维分化的培养物，分化细胞的培养时间越长，由于细胞外基质沉积增加，解离细胞所需的孵育时间也可能越长。
本文所述的FP参数定量方案可用于生成心脏活性药物的剂量-反应曲线。正如Cavero 等31最近所述，药物的起始浓度可能显著影响MEA测量的结果。因此，为了提高结果的准确性和可靠性，我们建议采取以下措施：1）对于不可逆的激活剂/阻断剂，应使用含有待测药物的较大体积的培养基。具体而言，从MEA芯片中移除10%-50%的培养基体积，然后加入等体积的、预先将药物溶解至适当浓度的培养基。在此情况下，计算药物最终浓度时，必须考虑移除培养基后浓度的变化。2）对于可逆的激活剂/阻断剂，从100倍浓缩的储备液中加入10 µL的每种药物剂量。
大多数心脏分化方案会产生包含起搏样、心房样和心室样心肌细胞的混合细胞群体，其中以心室样细胞占主导。当用于模拟影响特定心肌细胞亚型的心脏疾病或作用于心肌细胞亚型特异性离子通道的药物时，这可能构成一定局限性。尽管已有若干研究优化了心脏分化过程中的定向诱导条件，以实现更精确的细胞命运控制3,5,37,38，但这些方法的广泛适用性仍有待进一步验证。
此外，在不同实验及不同人多能干细胞系中，可能会观察到分化效率的差异39,40,41,42,43,44基于表面蛋白表达的心肌细胞富集策略35,45 （通过荧光辅助细胞分选或磁珠筛选）46,47，以及代谢筛选44,48 可能代表可应用的有效策略&#160;在接种hPSC-CMs之前，对任何（经基因修饰或未修饰的）hPSC细胞系进行处理，以改善电信号。
尽管人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）与人类成人心肌细胞相比具有显著的不成熟性4,49，但它们已被证实可用于重现并识别特定的疾病相关改变（例如，在通道病中）19,20,50，以及药物诱导的反应（例如，心脏离子通道阻滞剂）4,51。此外，不成熟细胞比成人心肌细胞更容易解离，并且在解离和铺板后具有更好的恢复能力44，因此在此方面，hPSC-CMs 的不成熟性可被视为一种优势。然而，为了能够重现例如晚发性心脏疾病，并真实模拟成人心肌细胞对药物的反应，仍需获得机械、代谢和电生理特性更为成熟的 hPSC-CM 状态。促进这些细胞成熟的策略包括延长培养时间52、施加机械应变53、电刺激起搏54、添加小分子化合物55、三维培养56、与其他类型细胞共培养57，甚至联合使用上述多种方法58；迄今为止，这些方法中尚无一种能够诱导出类似成人心肌细胞的表型。
作为不成熟特征的一部分，hPSC-CMs 表现出电生理自动性。本文详细介绍了如何准确量化 QT 间期和 RR 间期。测量自发性电活动的一个局限性在于，当 hPSC-CMs 表现出不同搏动频率时，QT 间期的比较可能变得困难。在此情况下，可采用 Bazett 或 Fridericia 公式对 QT 间期进行频率校正。然而，正如先前报道30，我们强烈建议通过绘制 QT 间期与 RR 间期的关系图，对原始数据和校正后的数据均进行主轴回归分析，以排除校正方法本身可能带来的任何偏差。
本文所述方案结合先前报道的方法59,60，有助于标准化人多能干细胞来源心肌细胞动作电位（hPSC-CM FPs）的实验流程和分析方法，提高数据的可重复性，并实现不同实验室之间结果的更好比较。

人类多能干细胞（hPSCs）具有自我更新的能力，并可通过分化产生人体几乎所有类型的细胞1,2。已有详细方案描述了如何将hPSCs定向分化为多种心肌细胞谱系（如心室样、心房样及起搏细胞样心肌细胞）3,4,5,6,7。心肌细胞是电活性细胞，深入了解其电生理活动对于认识心脏&#160;发育与疾病具有重要意义8。患者特异性的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成功用于建模并研究多种心脏心律失常的细胞、分子和电生理特征，包括长QT综合征（LQTS）9,10,11,12,13、Brugada综合征14以及儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速15,16。此外，已有多种药物被施加于病变的hiPSC-CMs中，以模拟治疗干预并挽救细胞的病理表型10,15,20,21,22。近年来，为满足药物发现早期阶段对人类模型系统的需求，研究人员开发了基于野生型hiPSC-CMs的筛选平台23,24,25，因为啮齿类动物心肌细胞在离子通道表达和生物物理特性方面与人类存在显著差异26。
为此，适合中高通量应用的技术正在被开发和实施。这些技术包括膜电位的光学记录、Ca2+ 瞬变与应变、阻抗测量（作为细胞收缩力的间接指标）以及细胞外场电位（FP）测量（综述见参考文献）24）。多电极阵列（MEA）设备可用于记录由心肌细胞单层或小细胞簇产生并形成的电波形信号（即场电位，FP）。场电位的波形轮廓与心脏动作电位相关，并在一定程度上与心电图（ECG）记录相对应。27；它们通常表现出初始的快速上升支，对应于 Na+ 内流和膜去极化（R/Q峰），一个缓慢的去极化波/平台期，可能对应于Ca2+ 内流，以及对应于主要为 K⁺ 外流的复极化阶段+ 外流（T峰）。FP波形的扰动可与动作电位特定时相的变化相关联28.
尽管膜片钳记录动作电位可提供更丰富的信息，尤其是关于上升速度和静息膜电位等参数，但在中、高通量规模的实验中，手动测量并不可行，而自动膜片钳技术直到最近才被应用于人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）29。然而，由于多电极阵列（MEA）上的长时间记录能够同时研究化合物的急性与慢性暴露效应，目前已有可能将hPSC-CM平台用于药物筛选、药物发现24,30以及安全性药理学研究31,32。这为未来实现精准医疗或个体化医疗带来了希望33。
本实验方案的目的是提供在MEA芯片上分离和接种hPSC-CMs并测量其动作电位（FP）所需的全部信息。该流程中每一步均已优化，以确保细胞在解离后具有最佳的存活率和恢复能力，细胞在MEA板上的贴附效果最佳，并实现参数的标准化分析与定量。特别地，本文详细解释并举例说明了细胞外动作电位记录、QT间期和RR间期的分析方法以及药物效应的评估。

<table><tbody><tr><td>生物安全柜/层流罩</td><td>洁净空气</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEA2100 &lt;em&gt;体外&lt;/em&gt; 记录系统</td><td>Multi Channel Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 细胞培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO-15A</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>日立</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>Leica 体视显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MS5</td><td></td></tr><tr><td>手持移液器（P-10（10 &amp;mu;L）、P-200（200 &amp;mu;L），P-1000（1,000 &amp;mu;L))</td><td>吉尔森国际</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤器吸头（10 &amp;mu;L, 200&amp;mu;L, 1,000&amp;mu;L</td><td>康宁</td><td>4807 (10 &amp;mu;L），4810（200&amp;mu;L），4809（1000&amp;mu;L)</td><td></td></tr><tr><td>一次性瓶顶滤器（0.22 μm） &amp;mu;m 孔径大小)</td><td>Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料移液管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180（5 mL），607180（10 mL），760180（25 mL）</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>杜蒙</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌的培养皿</td><td>VWR/ Duran 集团</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>MEA芯片</td><td>Multi Channel Systems</td><td>MEA200/30iR-Ti-gr</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水（PBS）含钙、含镁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），无钙，无镁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>人重组纤连蛋白</td><td>Tebu-Bio</td><td>J64560</td><td></td></tr><tr><td>定制聚四氟乙烯（PTFE）MEA环</td><td>莱顿大学医学中心：仪器开发部门</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解离酶 - TrypLE Select 1x</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12563-029</td><td></td></tr><tr><td>Tergazyme 酶清洁剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287-1EA</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;LI-BPEL 培养基试剂&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove改良的DMEM培养基（IMDM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21056-023</td><td></td></tr><tr><td>F12营养混合物（Ham）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>无蛋白杂交瘤培养基-II (PFHMII)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12040-077</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Bovogen Biologicals Australia</td><td>BSAS05</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇（PVA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩物（CDLC）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11905-031</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS-X）100倍浓缩液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51599-056</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;单硫代甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;软件版本&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Multi Channel Systems</td><td>4.6.2</td><td>或者，可以使用 Cardio2D 或 MC_Experimenter（MultiChannel Systems）记录数据</td></tr><tr><td>TCX 对照</td><td>Multi Channel Systems</td><td>1.3.4</td><td></td></tr><tr><td>MEA Select</td><td>Multi Channel Systems</td><td>1.3.0</td><td></td></tr><tr><td>MC_Data 工具</td><td>Multi Channel Systems</td><td>2.6.15</td><td>或者，当需要自定义数据导出（HDF5、EDF）时，可使用 Multi Channel Data Manager（MultiChannel Systems）。 &lt;em&gt;等等。&lt;/em&gt;)</td></tr><tr><td>Clampfit</td><td>Molecular Devices</td><td>7.0.0</td><td>在步骤10.1中用于所有数据的分析、绘图和格式化。要使用Clampfit，请从Molecular Devices网站下载并安装电生理数据采集软件pClamp（最新版本10.7.0）。安装完成后，启动Clampfit软件。或者，也可使用Cardio2D（MultiChannel Systems）或MatLab自定义代码进行数据分析。</td></tr></tbody></table>

利用多电极阵列（meas）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hpsc-cms）进行电生理分析

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

现在可以高效地从人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞（hPSC）分化获得心肌细胞。人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs） increasingly 被认为在人类心血管疾病建模中具有重要价值，尤其是心律失常综合征的研究。此外，它们在以下方面也显示出相关性： 体外 用于预测药物反应的系统，使其在药物筛选与发现、安全性药理学，甚至最终在个体化医疗中具有潜在应用价值。通过从患者或易感个体获取人诱导多能干细胞（hiPSCs）来衍生人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs），将有助于实现上述应用。然而，对于所有应用而言，精确测量和分析hPSC-CMs的电生理特性对于识别由心脏离子通道突变和/或作用于离子通道并可能导致猝死的药物所引起的变化至关重要。与人工膜片钳技术相比，多电极阵列（MEA）设备具有可实现中至高通量记录的优势。本方案描述了如何将hPSC-CMs的二维培养物解离为小聚集体和单细胞，并将其接种至MEA上，以记录其自发性场电位活动。本文还介绍了分析记录数据以提取特定参数（如QT间期和RR间期）的方法。携带导致心律失常突变的hPSC-CMs，或在添加特定药物后，这些参数会发生预期变化，从而可检测出具有心脏毒性的药物。

解离并接种一天后，hPSC-CMs将形成一层致密的白色薄膜，覆盖在MEA腔的中央区域图3A）。移除环状物后（图3B), 该层应保持原位，在光学显微镜下观察可看到MEA电极被（收缩的）hPSC-CM层覆盖图3C由于细胞之间存在物理和电学耦合，仅需使用一个电极（金电极）进行分析。
或者，在处理三维结构（如类胚体或微组织）时，可将其接种，使其在物理上和电学上相互分离。通过显微镜观察可确认各簇之间无物理连接，而多电极阵列（MEA）上非同步的R波则证实无电学耦合。在此情况下，可对多个独立电极进行分析。
FP 信号的典型记录如图4所示。具体而言，高质量的信号应包含一个清晰的峰值，对应 Na+ 内流和膜去极化（R/Q 峰），以及一个清晰的复极化相，对应 K+ 外流（T 峰），并具有较高的信噪比（图4A，左侧：注意 y 轴刻度，以及图4B）。低质量信号（图4A，中间）可能是由于 hPSC-CM 未能成功贴附于 MEA 板，或 hPSC-CM 电活动较弱所致。等待 1–3 天以改善细胞贴附可能有助于提升信号质量；然而，若未观察到信号改善，则建议将该 MEA 排除在实验之外。噪声较大的信号（图4A，右侧）可在滤波后进行分析。
通过目视检查显示峰值检测的屏幕，可判断RR间期分析是否成功（图5A、5B）。在垂直光标所定义的时间区间内，应出现对应于每个峰值的蓝色标记。若程序未能识别一个或多个峰值，可尝试移动水平光标后重新运行分析，或调整检测设置。类似地，通过目视检查显示FP检测的屏幕，可判断QT间期分析是否成功（图7）。在垂直光标所定义的时间区间内，应出现对应于每次FP检测的蓝色标记。若程序未能识别一个或多个FP，可尝试重新定义FP模板（图6），或调整检测设置后重新运行分析。
提取的单个动作电位（FP）轨迹或其平均值（图8）可用于在特定设置下获取QT间期值，如图9所示。分析QT-RR关系具有重要意义，适用于疾病模型和野生型（WT）人多能干细胞（hPSC）系（图10A），并可用于评估是否需要以及QT间期校正的效果（图10B–10D）。携带导致长QT综合征（LQTS）突变的hPSC来源心肌细胞（hPSC-CMs）与野生型对照相比，QT间期延长（图11A）。使用hERG通道阻滞剂处理hPSC-CMs会导致QT间期延长（图11B）；相反，使用hERG通道激活剂处理则导致QT间期缩短（图11C）。最后，使用影响hPSC-CMs搏动频率的药物处理应表现为RR间期的变化（图11D，RR间期缩短）。
<img alt="MEA芯片制备过程；用于细胞培养的灭菌和纤连蛋白包被示意图。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：MEA芯片的灭菌与包被。（A）表示灭菌过程的示意图，包括将MEA芯片放入可高压灭菌的玻璃培养皿中，用铝箔包裹，蒸汽处理6分钟，并暴露于紫外线下30分钟。（B）定制PTFE环的顶视图（左图）和侧视图（中图）；该环外径为1.2 cm，包含4个凸片，可使其定位在MEA芯片的中心位置，内径为0.4 cm（右图）。（C）MEA芯片制备的示意图，包括将芯片置于标准塑料培养皿中，在MEA腔室外加入8 mL去离子水，将PTFE环放置在腔室中央，并用纤连蛋白包被电极阵列。孵育后，去除纤连蛋白并更换为培养基。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养制备示意图；解离、离心及用于分析的MEA装置。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：hPSC-CMs的解离与接种。 示意图展示了hPSC-CMs的酶解解离、离心、重悬以及接种至MEA腔室中央的过程。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于培养皿中细胞培养分析的微流控装置设置；包含电极排列。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：带有hPSC-CM层的MEA芯片。（A）包含环状结构和hPSC-CM层的MEA芯片的顶视图。（B）移除环状结构后MEA芯片的侧视图。（C）接种在微电极阵列上的hPSC-CM层的明场图像；放大倍数为4倍。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电压测量结果；时间序列图；信号质量比较；数据分析。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：hPSC-CMs 的多电极阵列记录。（A）使用多电极阵列记录的代表性轨迹，显示高质量轨迹，R/Q 波和 T 波清晰可见，信噪比较高（左图）；低质量轨迹，R/Q 波和 T 波不清晰（中图）；以及噪声较大但 R/Q 波和 T 波仍清晰可见、信噪比较低的轨迹（右图）。（B）在使用 hPSC-CMs 进行多电极阵列实验期间可记录到的不同形态的高质量场电位（FP）轨迹的代表性示例。阴影区域表示分析过程中测量的 QT 间期。由于多电极阵列上的场电位类似于动作电位的一阶导数28，我们计算了场电位轨迹的积分（以红色虚线表示），作为理论上接近完整动作电位复极化的 T 波选择的演示。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用信号处理软件界面进行心电间期测量和数据分析的示意图。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：RR间期计算。（A）使用分析软件（见材料表）进行RR间期分析的示例，包括自动峰值检测（上方）和数据提取（下方）。垂直游标标示出感兴趣的时程区间，水平游标穿过所有被检测并以蓝色标记标识的事件。（B）放大列显示用于计算RR间期的提取数据。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示光子信号随时间变化的光谱分析图，具有瞬态吸收峰。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：FP模板的创建。 使用垂直光标在单个FP前后进行模板选取的示例。该模板用于FP的自动识别。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示神经信号数据分析及软件中瞬态响应图的电生理学图表。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：FP 模板自动识别。 在由两条垂直光标定义的时间区间内进行模板搜索的示例。所有检测到的事件均以蓝色标记标出，并在插图中自动叠加显示。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理学电压-时间图；显示膜电位随时间的变化；数据分析。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8：FP 参数的定量分析。 对保存的事件进行分析，R 峰通过前两个游标手动识别，T 峰通过后两个游标手动识别。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="信号测量设置、测量参数选择、电生理数据分析界面。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：分析窗口。在“统计”窗口中用于检测R波峰值的参数。如需检测T波峰值，请调整游标位置，必要时更改极性。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="QT 间期与 RR 间期比较图；LQT 和 WT 数据；心脏电生理研究。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 10"> 
图 10：QT-RR 关系。（A）野生型（LQT1corr）与 1 型长 QT 综合征（LQT1R190Q）人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）之间 QT 间期与 RR 间期关系差异的示例。阴影区域显示，相同的 RR 间期变化在 LQT1 疾病细胞系中引起更大的 QT 间期变化，因此可能增加心律失常易感性。（B）在来自 7 个不同 hPSC 系的心肌细胞中通过微电极阵列（MEA）测量的未校正 QT 间期与 RR 间期之间的关系。QT 间期经 Bazett 公式（C）或 Fridericia 公式（D）校正后的关系以 QT-RR 间期关系斜率的变化形式展示。图改编自参考文献30。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示野生型与长QT综合征、hERG阻断、激活以及RR间期缩短的电压-时间图。" src="/files/ftp_upload/55587/55587fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图11"> 
图11：疾病或药物引起的QT间期与RR间期变化。（A）来源于携带长QT综合征（LQTS）突变患者的hPSC-CM与其同基因野生型（WT）对照相比，QT间期延长的示例。（B）hPSC-CM在药物诱导的hERG通道阻断下QT间期延长的示例。（C）使用逐渐增加剂量的hERG激活剂处理后QT间期缩短的示例。箭头指示缩短的方向。（D）药物诱导RR间期缩短的示例。图（C）改编自参考文献30。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55587/55587fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">低胰岛素、牛血清白蛋白、聚乙烯醇、必需脂质（LI-BPEL）培养基</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">组分</td>
			<td colspan="2">每 100 mL 所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">IMDM</td>
			<td colspan="2">43 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">F12</td>
			<td colspan="2">43 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">抗坏血酸-2-磷酸（5 mg/mL，溶于蒸馏水）</td>
			<td colspan="2">1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">细胞培养添加剂（L-谷氨酰胺的直接替代物）</td>
			<td colspan="2">1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">青霉素/链霉素</td>
			<td colspan="2">0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">酚红</td>
			<td colspan="2">1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">无蛋白杂交瘤培养基-II（PFHMII）</td>
			<td colspan="2">5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">牛血清白蛋白（10% wt/vol，溶于 IMDM）</td>
			<td colspan="2">2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">聚乙烯醇（5% wt/vol，溶于蒸馏水）</td>
			<td colspan="2">2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">化学成分明确的脂质浓缩液（CDLC）</td>
			<td colspan="2">1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS-X）100X</td>
			<td colspan="2">0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">α-单硫代甘油（13 µL 溶于 1 mL IMDM）</td>
			<td colspan="2">0.3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">将上述试剂混合，用 0.22 µm 滤膜过滤，4 °C 保存，最多可使用 2 周。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Li-BPEL培养基成分。

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

现在可以高效地从人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞（hPSC）中获得心肌细胞。由hPSC分化而来的心肌细胞……

本实验的总体目标是分离源自人多能干细胞的心肌细胞，并将其接种于多电极阵列上，以测量和量化其典型电信号（即场电位）的持续时间和频率。该方法有助于回答该领域的一些关键问题，例如携带突变的心肌细胞与对照细胞之间在电生理学特性上存在哪些差异。该技术的主要优势在于，可在源自患者细胞的人源心肌细胞上进行药物筛选。该方法的可视化演示至关重要，因为解离和铺板步骤对于成功记录电信号必不可少。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为判断电信号质量优劣并非易事，且自由电位的分析需要经验积累。开始此操作时，将洁净的芯片放入标准的直径10厘米的无菌塑料培养皿中。接着向培养皿中加入8毫升无菌蒸馏水，以形成一个加湿环境，防止芯片上的少量培养基在放入培养箱后发生干燥。然后使用定制的聚四氟乙烯（PolyTetraFluoroEthylene）环，确保心肌细胞被接种在芯片中央电极阵列所在的位置。在超净工作台中将环状物从乙醇中取出，放入无盖的无菌培养皿中，使其在工作台内干燥。然后用火焰灭菌的镊子将干燥的环状物放入MEA芯片内。在圆环内加入 50 微升浓度为 40 微克/毫升的纤连蛋白，对电极进行包被。随后，用盖子盖好培养皿，并小心地将含有 MEA 芯片的培养皿转移至培养箱中。之后，将含有 MEA 芯片的培养皿转移至细胞培养超净台中。使用MEA芯片之前，用P200移液器或在通风橱中使用真空系统吸取50微升纤连蛋白，注意不要移动PTFE环。保持移液器尖端倾斜，避免任何固体物体接触电极。然后轻柔加入950微升LI-BPEL培养基，确保培养基均匀分布且环不会漂浮。随后将培养皿放回培养箱。这是搏动心肌细胞的初始培养。在组织培养超净台中，吸除hPSC-CMs培养孔中的培养基。向每个孔中加入一到两毫升不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）以洗涤培养物，然后吸去PBS。随后，向每个孔中加入500微升解离酶。将样品在37摄氏度下孵育5分钟。五分钟后，向每孔加入一毫升 LI-BPEL 以稀释酶。用 P1000 移液器轻轻刮擦，使 hPSC-CMs 单层细胞脱落。然后将细胞悬液收集至 15 毫升离心管中。接下来，用一毫升 LI-BPEL 冲洗孔板，以收集所有残留的细胞和细胞团块。再加入两到三毫升 LI-BPEL，使终体积达到约五到六毫升，并用五毫升移液器轻柔吹打三到五次，以解离细胞团块。随后，将细胞在室温下以 300 × g 离心三分钟。随后，去除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。然后将细胞沉淀重悬于 250 微升 LI-BPEL 中。接着用移液器将 50 微升细胞悬液直接加入每个 MEA 的 PTFE 环中心位置，覆盖电极阵列表面。将MEA小心转移至37摄氏度的培养箱中，使细胞过夜贴壁。铺板后一天，在无菌环境下使用无菌镊子小心取下环状物。用80%乙醇冲洗该环状物。并将样品置于含有80%新鲜乙醇的50毫升离心管中。接下来，从MEA芯片中轻柔地移除500微升培养基，然后加入500微升新鲜的LI-BPEL。取出环后的心肌细胞正在搏动。随后将微电极阵列（MEA）转移至37摄氏度的培养箱中。接着从取出环后的第一天开始，持续一周时间，检测MEA上人多能干细胞来源心肌细胞（hPSC-CMs）的电生理活性。现在启动与MEA装置相连的软件套件。接下来，在TCX-Control中将温度设置为37摄氏度以记录测量数据。随后，从培养箱中取出含有MEA芯片的培养皿。从培养皿中取出MEA芯片，置于纸巾上以吸收残留水分。用纸巾小心擦拭芯片外部，再用浸有100%乙醇的棉签清洁，以去除可能引起信号噪声的残留水分或碎屑。随后将MEA芯片转移至37摄氏度的记录头阶段，以检测自发性电活动。打开 MC Rack，点击“编辑”以加载 MEA 硬件。要创建新协议，使用“编辑”下拉菜单向该协议中添加不同的记录器和显示窗口。随后，点击播放按钮，以播放模式启动协议。如果信号中明显可见R波和T波，则需等待10至15分钟以完成适应阶段。实验开始时，单击“记录”，然后单击“播放”，在基线条件下采集10分钟数据，以确定稳态。标记出信号质量最佳的电极，以便后续能够轻松识别并导出用于分析。进行药物反应评估时，每隔10分钟加入浓度递增的药物。在实验方案结束时点击“停止”以结束记录。以下是使用微电极阵列（MEA）记录的代表性轨迹，显示质量良好的信号，RQ波和T波清晰可见，且信噪比较高。一段质量较差的信号迹线，RQ和T波峰不清晰可见；另一段为噪声较大的迹线，尽管RQ和T波峰清晰可辨，但信噪比较低。以下是使用hPSC-CMs进行MEA实验期间可记录到的不同形态的高质量场电位迹线的代表性示例。阴影区域表示在分析过程中测量的QT间期。由于MEA上的场电位类似于动作电位的一阶导数，因此已计算场电位轨迹的积分，以理论模拟接近完整动作电位复极化的T波。在执行此操作时，需注意应尽可能使用电极数量最多的阵列，以确保信号的可靠性和一致性。完成此步骤后，可进一步采用其他方法，如定量胫骨时间PCR或单细胞膜片钳技术，以回答更多问题，例如与电生理表型相关的特定基因表达或特定离子电流密度。该技术发展之后，为干细胞领域的研究人员探索心脏心律失常以及利用人多能干细胞来源的心肌细胞进行体外药理学研究开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何将人多能干细胞来源的心肌细胞解离并接种到微电极阵列（MEAs）上，以进行电生理学测量和药物筛选。请务必注意，操作药物可能具有极高危险性，在执行本实验流程时，应始终采取适当防护措施，例如遵循标准的优良实验室规范（GLP）。

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Research

科研

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Developmental Biology

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高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.

一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。...

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

从多能干细胞生成心肌细胞 体外 可获取大量心脏组织 体外 用于基础科学与临床应用。该方案利用心房化因子...

利用BMP拮抗剂Grem2从多能干细胞分化心房型心肌细胞

了解使用多电极阵列对人多能干细胞来源的心肌细胞进行电生理分析的方法。该技术可测量场电位并评估药物反应，为心脏疾病建模和个性化医疗中的药物筛选提供可靠支持。

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