Name: 使用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层进行高通量心脏毒性筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 学习使用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层进行高通量心脏毒性筛选的方法。该方案通过MECM培养板促进hiPSC-CMs成熟，提升药物心脏毒性预测的准确性，适用于大规模药物筛选研究。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL148068-04和R44ES027703-02（TJH）的支持。

本方案中使用的人诱导多能干细胞（hiPSC）已获得密歇根大学HPSCRO委员会（人类多能干细胞监管委员会）的批准。有关材料和设备的清单，请参见材料表。有关培养基及其成分的信息，请参见表1。
1. 解冻并接种 commercially available 冻存 hiPSC-CMs，使其在可诱导成熟的细胞外基质（MECM）上进行成熟
<ol>
	<li>将所有试剂恢复至室温，并在心肌细胞接种前1小时，用含钙和镁的Hank's平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）对MECM板进行再水化（每孔96孔板加入200 µL缓冲液）。</li>
	<li>在心肌细胞接种前1小时，用含钙和镁的HBSS或PBS洗涤MECM板2次（每孔96孔板加入200 µL缓冲液），并保持孔内湿润。</li>
	<li>准备一个37 °C水浴。</li>
	<li>从液氮罐中取出心肌细胞冻存管，转移至干冰上，并略微打开管盖以释放压力。 
	注意：释放冻存管内的压力极其重要！如果管内压力过高，可能导致管体爆炸。</li>
	<li>重新密封管盖，将其放入水浴中解冻4分钟。 
	注意：应确保完全解冻，以避免因部分解冻造成细胞损伤。</li>
	<li>细胞解冻后，用70%乙醇喷洒管体表面后再打开。使用1 mL移液器将细胞转移至15 mL锥形管中。缓慢滴加8 mL接种培养基，每加入1 mL后轻轻震荡锥形管，使细胞逐步适应渗透压变化。
	<ol>
		<li>使用1 mL玻璃移液器，用1 mL接种培养基冲洗冻存管，然后将冲洗液缓慢滴加至15 mL锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以约300 × g离心5分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL接种培养基中。取少量细胞悬液，使用血细胞计数板进行活细胞计数。根据计数结果补充接种培养基，使细胞浓度达到7.5 × 105 cells/mL。 
	注意：制备96孔板约需10 mL细胞悬液。</li>
	<li>使用多通道移液器，将100 µL细胞悬液加入MECM包被的96孔板每孔中。 
	注意：接种过程中应避免细胞沉淀，确保各孔细胞密度均匀。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养2天后，更换为维持培养基（每孔200 µL）。解冻后第5天更换一次维持培养基。如需延长培养，每隔一天更换一次培养基。电生理（EP）检测可在第7天或之后进行，具体方法见先前文献8,9。</li>
</ol>
2. hiPSC 心脏定向分化及 hiPSC-CM 纯化
<ol>
	<li>将市售的1×乙二胺四乙酸（EDTA）溶液、不含钙和镁的HBSS（HBSS--）以及包被有Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的可溶性基底膜基质（小鼠ECM）的6孔板置于室温预热。</li>
	<li>通过相差显微镜标记已分化的菌落并进行吸除或消融。每孔加入1 mL HBSS--进行洗涤。对含有菌落的孔进行两次洗涤 &#62;10个分化区域。</li>
	<li>吸弃 HBSS，每孔加入 1 mL EDTA 溶液。将培养板在 37 °C 下孵育最多 5 分钟。3 分钟后检查培养板，观察是否存在半透明白色、可见的克隆。</li>
	<li>吸除EDTA溶液，向单个孔中加入1 mL。用10 mL玻璃移液管反复吹打2 mL hiPSC培养基，使细胞悬浮，彻底脱离孔壁，将细胞悬液转移至收集管中。对后续各孔重复吸除和吹打操作。 
	注意：使用玻璃移液管的尖端松动难以挑起的菌落。</li>
	<li>计数干细胞，并调整体积以接种 8.0 × 105 细胞/孔。使用hiPSC培养基（2 mL/孔）培养细胞，直至干细胞融合度达到90%（此后将此时间点称为D）0).</li>
	<li>准备2 mL添加了4 µM CHIR99021的基础分化培养基。</li>
	<li>在 D0,&#160;用 1 mL HBSS 洗涤干细胞 6 孔板的每个孔。将 HBSS 替换为添加了 4 µM CHIR99021 的基础分化培养基。</li>
	<li>在 D1，不做任何操作。</li>
	<li>在 D2，准备添加了4 µM IWP4的基础分化培养基。</li>
	<li>每孔加入 2 mL 含 IWP4 的基础分化培养基以更换原有培养基。</li>
	<li>在 D3，对心室特异性分化不做任何处理。对于心房特异性分化，吸除培养基，每孔加入2 mL基础培养基，并补充4 µM IWP4和1 µM视黄酸（RA）溶液。</li>
	<li>在 D4吸弃培养基，每孔加入2 mL基础培养基用于心室样分化；对于心房样分化，吸弃培养基，每孔加入2 mL添加1 µM RA溶液的基础培养基。</li>
	<li>第D天5，不做任何操作。</li>
	<li>在 D6，吸去培养基，每孔加入2 mL基础培养基（适用于心房和心室分化）。</li>
	<li>在 D7，不做任何操作。</li>
	<li>在 D8吸出培养基，加入2 mL心肌细胞维持培养基。每隔一天更换一次培养基，直至细胞分离，或按照慢性药物暴露方案进行。</li>
</ol>
3. hiPSC-CM 纯化 通过 磁珠激活细胞分选（MACS）
<ol>
	<li>吸弃细胞培养基，每孔加入 1 mL HBSS-- 洗涤一次。每孔加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟以消化细胞。每孔加入 2 mL 铺板培养基重悬并分散细胞，以中和胰蛋白酶/EDTA 活性。</li>
	<li>将六孔中的细胞收集至一个 50 mL 圆底离心管中，使用 70 µm 细胞筛过滤。用 3 mL 铺板培养基冲洗细胞筛。计数细胞。</li>
	<li>以约 300 × g 离心 5 分钟。吸弃上清液，用 20 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液洗涤细胞。再次以约 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>每 5 × 106 个细胞用 80 µL 冰冷的 MACS 分离缓冲液重悬沉淀。每 5 × 106 个细胞加入 20 µL 冰冷的非心肌细胞耗竭试剂盒（人源）。轻柔混匀细胞悬液，冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>每 5 × 106 个细胞加入 4 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液洗涤样品。以约 300 × g 离心 5 分钟，吸弃上清液。</li>
	<li>每 5 × 106 个细胞用 80 µL 冰冷的 MACS 分离缓冲液重悬沉淀。每 5 × 106 个细胞加入 20 µL 冰冷的抗生物素微珠。轻柔混匀细胞悬液，冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>在样品孵育期间，将阳性耗竭柱（配备 30 µm 预分离滤器）置于 MACS 分离器上，并在柱下方放置已标记的 15 mL 收集管。每 5 × 106 个细胞需使用一根分离柱。</li>
	<li>每根柱用 3 mL 冰冷的 MACS 分离缓冲液预平衡。将抗体处理后的细胞悬液与每 5 × 106 个细胞 2 mL MACS 分离缓冲液混合后，加至柱中。 
	注意：此步骤切勿离心！离心会显著降低心肌细胞得率。</li>
	<li>向每根柱中加入 2 mL MACS 分离缓冲液，收集流出液，直至收集到 12 mL 流出液形式的心肌细胞悬液。 
	注意：切勿让柱子完全干燥。</li>
	<li>将心肌细胞以约 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，用 1 mL 铺板培养基重悬心肌细胞。</li>
	<li>计数细胞以确定浓度，调整体积至所需接种密度后进行铺板。将纯化后的心肌细胞接种于 MECM 96 孔板中，操作步骤如前述 1.9–1.11 所述（每孔 7.5 × 105 个细胞）。</li>
</ol>
4. 使用电压敏感性染料（VSDs）和钙敏感性荧光探针（CSFs）进行光学标测
<ol>
	<li>通过在含钙和镁的HBSS中加入每毫升1 µL的VSD染料和每毫升10 µL的负载佐剂，配制适量的VSD溶液。 
	注意：通常，一块96孔板需要10 mL的VSD溶液。</li>
	<li>或者，配制含有5 µM CSF的含钙和镁的HBSS。吸除心肌细胞维持培养基，并向96孔板的每孔中加入100 µL的VSD溶液或CSF。将细胞置于细胞培养箱中孵育30分钟。</li>
	<li>去除染料，更换为检测培养基或HBSS。在37 °C条件下平衡，以便使用高通量光学标测设备获取基线数据的光学标测结果。</li>
	<li>对细胞进行药物处理以进行急性暴露测试，或对长期暴露于目标药物的细胞进行标测。</li>
	<li>在96孔板中进行心脏毒性测试时，使用一种化合物的四个剂量，每个剂量至少设置六个复孔。剂量范围应涵盖低于和高于有效治疗血浆浓度的水平，并包括临床有效治疗血浆浓度的剂量。</li>
	<li>将药物用二甲基亚砜稀释，作为储备液储存于-20 °C，然后用HBSS稀释至所需浓度。</li>
	<li>在施加药物前，按照第5节所述进行基础电生理学测量。施加药物后，对于慢性研究，至少30分钟后开始电生理记录。有关光学标测数据的采集与分析步骤，请参见后续章节。</li>
</ol>
5. 使用基因编码的钙指示剂（GECI）进行光学标测
<ol>
	<li>按照上述方法，使用MECM包被的96孔板接种市售或经MACS纯化的hiPSC-CMs，以获得成熟hiPSC-CMs。为形成融合单层，每孔接种7.5 × 104个CMs，使用接种培养基。</li>
	<li>在接种培养基中培养48小时后，更换为心肌细胞维持培养基。</li>
	<li>解冻并重新接种后的第4天，加入表达GCaMP6m的重组腺病毒（AdGCaMP6m），感染复数（MOI）= 5。使用CM检测培养基加入病毒。 
	注意：本实验中使用的GCaMP6m在来自商业供应商的iCell2心肌细胞中进行。</li>
	<li>第5天，移除含adGCaMP6m的培养基，并更换为新鲜RPMI+B27（心肌细胞维持培养基）。</li>
	<li>第7天，使用显微镜或光学标测成像系统观察CMs，以可视化自发性收缩及相应的钙瞬变。</li>
	<li>第7天或之后，如需进行药物筛选，可直接将表达GCaMP6m的成熟hiPSC-CM单层96孔板从培养箱转移至光学标测成像系统，进行基线数据采集。</li>
	<li>完成电生理数据采集后，将CMs培养板返回组织培养箱，用于后续时间点的测量。</li>
	<li>完成基线记录后，进行药物处理，每种药物至少设置四个剂量，每个剂量至少六个复孔。药物加入细胞后，至少平衡30分钟再开始数据采集。在数据采集前及过程中，将孔内温度升至约37 °C。</li>
	<li>完成整块板的基线记录后，向所有孔中加入异丙肾上腺素（500 nM），以获得显著的药物反应数据。按照第5节所述方法，量化异丙肾上腺素对单层细胞搏动频率、收缩幅度（钙瞬变幅度）和钙瞬变持续时间的影响（见图6）。</li>
</ol>
6. 光学图谱数据的采集与分析
<ol>
	<li>确保光学作图仪的相机、透射光源和加热板均已开启。</li>
	<li>打开采集软件并确定文件保存位置。</li>
	<li>打开前面的抽屉，将培养皿放置在培养皿加热器上。</li>
	<li>通过单击获取暗场图像 暗场 按钮。</li>
	<li>选择 持续时间 （10-30 秒）和 采集帧率 （例如，100 fps；若需更高时间分辨率则设为250 fps），然后点击 开始采集.</li>
	<li>打开分析软件，并在其中 导入/筛选 标签，选择其中一项 浏览 单个文件或 平铺多个窗口 重建一块培养板。</li>
	<li>选择 参数模式 (APD 或 CaTD），输入 每像素距离，并使用 Well Wizard 以确定图像中孔的位置。点击 流程保存 切换到下一个标签页。</li>
	<li>打开 感兴趣区域 （感兴趣区域）选项卡并选择绘制感兴趣区域 手动, 自动地，或 完全不使用感兴趣区域，随后将对整个孔进行分析。选择好感兴趣区域（ROIs）后，单击 流程/保存 按钮以进入下一步。检查 隐藏孔板 和 仅显示已筛选结果 用于可视化感兴趣区域的方框。</li>
	<li>打开 分析 标签，并在屏幕右上角依次选择每个 良好 或 感兴趣区域 以确认 自动节拍检测的准确性. 添加 或 去除节拍 从轨迹中按压 添加节拍/保存节拍，或通过选择一个 单次搏动 并按压 删除 在键盘上。</li>
	<li>可选地，使用 平均热图 利用该功能可为选定参数创建平板的热图。</li>
	<li>点击 时空图 按钮在 分析 切换以查看每个孔或感兴趣区域（ROI）的数据。在确认搏动检测准确无误后，继续进行下一步操作。 导出 标签并选择 文件格式. 按压 导出 并创建一个用于导出数据的文件夹。接着打开数据文件并运行选定的统计分析程序。 
	注意：建议使用 .xlxs 文件格式，因为所有参数将被导出至单个文件中；其他格式（如 .csv 或 .tsv）会为每个参数生成单独的文件。</li>
</ol>

<ol><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+voltage+and+calcium+mapping+of+genetically+purified+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocyte+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers.</a> Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).</li>
<li>Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+in+a+dish%3A+a+perspective+on+the+coming+revolution+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).</li>
<li>Strauss, D. G., Blinova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical trials in a dish.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trial+in+a+dish%3A+personalized+stem+cell-derived+cardiomyocyte+assay+compared+with+clinical+trial+results+for+two+QT-prolonging+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs.</a> Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).</li>
<li>Blinova,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+translational+assessment+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+for+evaluating+drug-induced+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias.</a> Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).</li>
<li>da Rocha, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiPSC-CM+monolayer+maturation+state+determines+drug+responsiveness+in+high+throughput+pro-arrhythmia+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13834(2017).</li>
<li>da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+drug-induced+Torsades+de+Pointes+arrhythmia+mechanisms+using+hiPSC-CM+syncytial+monolayers+in+a+high-throughput+screening+voltage+sensitive+dye+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay.</a> Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li>
<li>Lam, C. K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modelling+and+drug+discovery+for+hypertrophic+cardiomyopathy+using+pluripotent+stem+cells%3A+how+far+have+we+come%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come.</a> European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).</li>
<li>Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+current+strategies+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations.</a> Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).</li>
<li>Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+current+maturation+methods+for+human+induced+pluripotent+stem+cells-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).</li>
<li>Guo, Y., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+new+phase+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: new phase in development.</a> Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).</li>
<li>Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+adolescence%3Amaturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).</li>
<li>Karbassi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+maturation%3A+advances+in+knowledge+and+implications+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Herron, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-mediated+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+monolayer+structure+and+electrophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function.</a> Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638(2016).</li>
<li>Block, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+perinatal+stem+cell+derived+extracellular+matrix+enables+rapid+maturation+of+hiPSC-CM+structural+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19071(2020).</li>
<li>Gintant, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repolarization+studies+using+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+Validation+studies+and+best+practice+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).</li>
<li>Cyganek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+phenotyping+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 3 (12), 99941(2018).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
<li>Davis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+ischemic+heart+failure+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> JCI Insight. 6 (10), 134368(2021).</li>
<li>Diaz, R. J., Wilson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+ischemic+preconditioning+in+isolated+cardiomyocyte+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models.</a> Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).</li>
</ol>

TJH 是 StemBioSys, Inc. 的顾问和科学顾问。TB 是 StemBioSys, Inc. 的员工。AMR 和 JC 曾任 StemBioSys, Inc. 的顾问。TJH、TB、AMR 和 JC 均为 StemBioSys, Inc. 的股东。

有多种不同的方法 体外 使用hiPSC-CMs进行心脏毒性筛选。近期 &#34;最佳实践&#34; 关于hiPSC-CMs应用的研究论文展示了多种 体外 检测方法、其主要读数，以及重要的是，每种检测方法在量化人类心脏电生理功能方面的精细程度20除了使用穿膜电极外，最直接评估人类心脏电生理功能的方法是通过电压敏感染料（VSD）检测。VSD检测的读数能够直接可视化并量化关键的电生理参数，包括动作电位时程、动作电位传导速度、动作电位上升速率、动作电位三角化、搏动频率、搏动节律规律性以及动作电位时程的空间异质性。类似地，钙离子敏感探针可提供关于hiPSC-CM单层细胞节律、频率及事件持续时间的信息。利用荧光探针检测hiPSC-CM钙瞬变，还可反映每次收缩的收缩力及收缩强度。本文提供了在高通量电压敏感染料检测和钙瞬变测量实验中使用成熟hiPSC-CM（96孔板）的方法。此外，除光学标测方法外，还介绍了用于高通量电生理数据分析的软件。
本文所述方法对心脏毒性筛选和监管科学领域具有重要意义。我们在此介绍了在高通量...

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已在国际范围内得到验证，可用于体外心脏毒性筛选1。这些高度纯化的人诱导性多能干细胞心肌细胞可近乎无限地生成，并能进行冻存与复苏。复苏后重新接种时，细胞可恢复活性并开始规律性收缩，其节律类似于人类心脏的搏动2,3。值得注意的是，单个hiPSC-CMs之间可相互耦合，形成功能性的合胞体，以类似单一组织的方式同步搏动。如今，hiPSCs可常规地从患者血液样本中获得，因此任何人都可通过体外hiPSC-CM心脏毒性筛选实验进行代表性建模4,5。这为开展“在培养皿中进行临床试验&#34;Clinical Trials in a Dish&#34;”提供了可能，并可广泛涵盖不同人群的代表性样本6。
相较于现有的动物及动物细胞心脏毒性筛选方法，hiPSC-CMs 的一个关键优势在于其利用了完整的人类基因组，并提供了一个在遗传学上与人类心脏相似的 in vitro 系统。这一特性在药物基因组学和个体化医学领域尤其具有吸引力——利用 hiPSC-CMs 进行药物及其他疗法的开发，有望实现更准确、更精确且更安全的用药方案。事实上，二维（2D）hiPSC-CMs 单层细胞检测已被证实能够预测药物的心脏毒性，其通过一组临床常用药物进行验证，这些药物具有已知的致心律失常风险1,7,8,9。尽管 hiPSC-CMs 具有巨大的潜力，并有望简化药物研发流程并降低成本，但目前对这些新型检测方法的应用仍存在迟疑态度10,11,12。
迄今为止，hiPSC-CM 筛选检测在广泛采用和接受方面的一个主要限制是其不成熟、类似胎儿的形态和功能。hiPSC-CM 成熟度这一关键问题已在科学文献中被反复综述和讨论ad nauseum13,14,15,16。同样，已有多种方法被用于促进 hiPSC-CM 的成熟，包括在二维单层培养中对细胞外基质（ECM）进行调控，以及构建三维工程化心肌组织（EHTs）17,18。目前普遍认为，与基于二维单层的方法相比，使用三维 EHTs 能够实现更优越的成熟效果。然而，二维单层培养在细胞利用效率和铺板成功率方面更高；相比之下，三维 EHTs 需要更多的细胞，且常常需要引入其他细胞类型，这可能干扰实验结果。因此，本文重点介绍一种简单的方法，用于促进以二维单层形式培养的、电学和力学耦合的心肌细胞的成熟。
利用细胞外基质（ECM）可在二维单层培养中实现hiPSC-CM的高级成熟。通过使用涂有Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜基质（小鼠ECM）的柔软、可变形聚二甲基硅氧烷盖玻片，可促进hiPSC-CM的二维单层培养成熟。2016年的研究报道显示，在这种柔软ECM条件下培养的hiPSC-CM在功能上趋于成熟，其动作电位传导速度接近成人心脏水平（约50 cm/s）18。此外，这些成熟的hiPSC-CM表现出多种类似成人心肌细胞的电生理特征，包括超极化的静息膜电位以及Kir2.1的表达。最近的研究进一步发现了一种来源于人类围产期干细胞的ECM涂层，可促进二维hiPSC-CM的结构成熟19。本文介绍了易于操作的方法，用于实现二维hiPSC-CM单层的结构成熟，以适用于高通量电生理筛选。此外，我们还验证了一种光学标测仪器，可用于自动采集和分析二维hiPSC-CM单层的电生理功能，该方法结合使用电压敏感性染料（VSDs）以及钙离子敏感探针和蛋白。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mg/mL BSA (7.5 &amp;micro;mol/L)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)</td><td>Millipore Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>AdGCaMP6m</td><td>Vector biolabs</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9731-1G</td><td></td></tr><tr><td>α-肌动蛋白抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-22863</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>CalBryte 520AM</td><td>AAT Bioquest</td><td>20650</td><td></td></tr><tr><td>CELLvo MatrixPlus 96孔板</td><td>StemBiosys</td><td>N/A</td><td>https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>LC Laboratories</td><td>c-6556</td><td></td></tr><tr><td>透明培养基（Fluorobrite）</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>用于腺病毒转导</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt</td><td>ThermoFisher</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>iCell CM 维持培养基</td><td>FUJIFILM/Cellular Dynamics</td><td>M1003</td><td></td></tr><tr><td>iCell&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; CMs</td><td>FUJIFILM</td><td>1434</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Zoom&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPS DF19-9-11T.H</td><td>WiCell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>MilliporeSigma</td><td>CAS-51-30-9</td><td></td></tr><tr><td>IWP4</td><td>Tocris</td><td>5214</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物</td><td>Sigma</td><td>A8960-5g</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyii Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 缓冲液（autoMACS 运行缓冲液）</td><td>Miltenyii Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Nautilus HTS 光学图谱系统&amp;nbsp;</td><td>CuriBio</td><td></td><td>https://www.curibio.com/products-overview</td></tr><tr><td>Nikon A1R 共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器</td><td>Miltenyii Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>人源多能干细胞衍生心肌细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyii Biotec</td><td>130-110-188</td><td></td></tr><tr><td>Pulse</td><td>CuriBio</td><td></td><td>https://www.curibio.com/products-overview</td></tr><tr><td>Quadro MACS 分离器（磁铁）</td><td>Miltenyii Biotec</td><td>130-091-051</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640（含 HEPES，含 L-谷氨酰胺）</td><td>Gibco</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS iPS-Brew XF</td><td>Miltenyii Biotec</td><td>130-107-086</td><td></td></tr><tr><td>肌钙蛋白 I 抗体（泛肌钙蛋白 I）</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB1691&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Versene（乙二胺四乙酸 - EDTA 溶液）</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

High-Throughput Cardiotoxicity Screening Using Mature Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Monolayers

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）可用于替代并减少临床前心脏毒性测试中对动物及动物细胞的依赖。在二维单层培养条件下，当接种于最佳细胞外基质（ECM）上时，hiPSC-CMs能够重现成人人心肌细胞的结构与功能。一种来源于人围产期干细胞的细胞外基质（促进成熟型细胞外基质，MECM）可在接种后7天内促进hiPSC-CMs在结构、功能及代谢状态上的成熟。
成熟的hiPSC-CM单层细胞对具有已知致心律失常和心脏毒性风险的临床相关药物也表现出预期的反应。在迄今为止之前，hiPSC-CM单层细胞的成熟问题一直是限制这些宝贵细胞在监管科学和安全性筛选中广泛应用的障碍。本文介绍了经过验证的方法，用于hiPSC-CM电生理和收缩功能的铺板、成熟以及高通量功能性表型分析。这些方法适用于 commercially available purified cardiomyocytes（商业化获得的纯化心肌细胞），以及利用高效、心室特异性的分化方案在实验室内部生成的干细胞来源心肌细胞。
采用电压敏感性染料（VSDs；发射波长：488 nm）、钙敏感性荧光探针（CSFs）或基因编码的钙离子传感器（GCaMP6）来测量高通量电生理功能。使用高通量光学标测装置对各项功能参数进行光学记录，并采用定制专用软件进行电生理数据分析。应用心肌细胞外基质模拟物（MECM）方案，结合正性肌力药物（异丙肾上腺素）和人 Ether-a-go-go 相关基因（hERG）通道特异性阻断剂，用于药物筛选。这些资源将有助于其他研究人员成功利用成熟的诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs），开展高通量、临床前的心脏毒性筛选、心脏药物疗效测试以及心血管科学研究。

通过相差显微镜和免疫荧光共聚焦成像表征hiPSC-CM的成熟过程 
使用MECM包被的96孔板进行商品化hiPSC-CMs经ECM介导成熟的实验时间线如图所示 图1A. 这些数据使用商业可获取的心肌细胞收集，这些细胞以冷冻保存的小管形式运抵实验室。每管含有 &gt;5 × 106 存活的心肌细胞。细胞纯度约为98%，并经过严格的质量控制检测（每管细胞均附有分析证书）。大量心肌细胞的存在使得可使用同一批次细胞在解冻后接种于不同的细胞外基质组合上。在 图1，将hiPSC-CMs接种于小鼠ECM或MECM包被的培养板上。接种在MECM上的hiPSC-CMs相较于同一批次接种于小鼠ECM上的细胞更为成熟，且在结构上具有明显差异。具体而言，成熟细胞呈杆状，而未成熟细胞则保持圆形。这一差异可通过相差显微成像以及对心肌肌原纤维染色后观察到图1B；肌钙蛋白 I [TnI]，红色）。hiPSC-CMs 结构成熟度的更...

人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）为临床前心脏毒性筛选提供了一种替代动物实验的方案。hiPSC-CMs在临床前毒性筛选中广泛应用的一个局限性在于其未成熟、类似胎儿表型的特性。本文介绍了一套高效且快速促进hiPSC-CMs成熟的实验方案。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）被用于替代并减少临床前研究中对动物及动物细胞的依赖……

本方案具有重要意义，因为它能够将商业来源或实验室自制的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）诱导成熟为类似成人心肌细胞的表型，从而显著提高hiPSC-CMs在心脏毒性筛选中的预测价值。该方案的主要优势在于，能够以高通量形式获得成熟的hiPSC-CMs，用于钙离子或电压变化的光学标测。本方案可用于研究疾病机制，或用于药物心脏毒性筛选。本实验操作将由我实验室的研究助理 Jeffrey Creech 演示。在心肌细胞接种前 1 小时，用 200 微升汉克斯平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution, HBSS）将成熟诱导型细胞外基质（maturation-inducing extracellular matrix, MECM）培养板洗涤两次。保持孔内湿润。将心肌细胞管从液氮罐转移至干冰中，并通过稍微打开管盖释放压力。接着，重新密封管盖，并在水浴中解冻4分钟。细胞解冻后，在打开管子前用70%乙醇喷洒管体。用1毫升移液器将细胞转移至15毫升锥形管中。向冻存管中加入1毫升铺板培养基，并将洗涤液转移至15毫升锥形管中。然后，缓慢滴加1毫升铺板培养基，并轻轻振荡管子。重复此步骤，直至转移8毫升铺板培养基。将15毫升离心管在300 × g条件下离心5分钟，并将沉淀重悬于1毫升铺板培养基中。取一份等分试样，使用血细胞计数板进行活细胞计数，然后加入铺板培养基，使细胞浓度达到每毫升7.5 × 10⁵个细胞。使用多通道移液器将细胞悬液每孔100微升加入MECM包被的96孔板中，细胞培养2天。随后，更换为200微升维持培养基，继续培养7天，并在第5天更换一次培养基。第7天时，按照文中所述方法进行EP检测。若选择延长细胞培养，务必每隔一天更换一次培养基。为通过磁性激活细胞分选（MACS）纯化人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM），请吸除细胞培养基，并用1毫升HBSS洗涤细胞。随后加入1毫升0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），孵育10分钟以解离细胞。接着，加入2毫升铺板培养基重悬并单细胞化细胞，以终止胰蛋白酶/EDTA的消化作用。从六个孔中使用70微米细胞筛将细胞收集到一个50毫升的锥形管中。用3毫升铺板培养基冲洗细胞筛后，对细胞进行计数。计数后，将细胞沉淀用2毫升冰MACS分离缓冲液离心洗涤，然后将每5 × 10⁶个细胞重悬于80微升冷MACS分离缓冲液中。加入20 µL冷的非心肌细胞去除试剂盒溶液，混匀后置于冰上孵育10分钟。用4 mL冷的MACS分离缓冲液在300 × g离心5分钟洗涤细胞后，将细胞沉淀重悬于80 µL冷的MACS分离缓冲液中。每5 × 10⁶个细胞加入20 µL冷的抗生物素微珠，轻轻混匀细胞悬液，然后置于冰上孵育10分钟。在样本孵育的同时，将装有30微米预分离过滤器的阳性去除柱置于MACS分离器上，并在柱下方放置已标记的15毫升收集管。接着，用3毫升冷的MACS分离缓冲液预润每个柱子。将经抗体处理的细胞悬液与2毫升MACS分离缓冲液混合，然后加入柱中。向每根柱中加入 2 毫升 MACS 分离缓冲液，收集 12 毫升流穿的心肌细胞悬液。离心心肌细胞并弃去上清液，然后将心肌细胞重悬于 1 毫升铺板培养基中。为确定浓度，对细胞进行计数，并调整体积至所需接种密度，随后将纯化的心肌细胞接种至 MECM 96 孔板上。吸弃96孔板中每孔的心肌细胞维持培养基，更换为100 µL电压敏感性染料（VSD）或钙离子敏感性荧光探针（CSF）。孵育30分钟后，将染料更换为检测培养基或HBSS。在使用高通量光学标测设备采集基线数据前，将细胞在37 °C条件下平衡。 为了进行急性暴露测试或绘制长期暴露于目标药物的细胞图谱，需将药物用二甲基亚砜（DMSO）稀释，并在使用前以20摄氏度保存为储备液，随后将其在HBSS中稀释至所需浓度。在96孔板中进行心脏毒性测试时，每种化合物设置四个剂量，每个剂量至少包含八个孔。所用剂量范围应涵盖低于和高于临床有效治疗血浆浓度的水平，并包括有效剂量。与给药前的基础电生理学测量类似，在慢性研究中，每次药物处理后至少30分钟再进行电生理记录。在完成基础记录后，对表达GCaMP6m的成熟hiPSC-CM单层细胞至少施加四种剂量的每种药物，每种剂量至少八个孔。药物与细胞平衡30分钟，并在数据采集前及采集过程中将细胞升温至37摄氏度。在完成整块培养板的基线记录后，向每个孔中加入500纳摩尔的异丙肾上腺素，以获得显著的药物反应数据，并量化异丙肾上腺素对单层细胞搏动频率、收缩幅度和钙瞬变持续时间的影响。为获取光学标测数据，打开前面板抽屉，将培养板放置在板式加热器上。启动采集软件后，在软件中设定文件保存位置，选择10至30秒的采集时长以及较高的帧率以实现更高的时间分辨率，然后点击“开始采集”。打开分析软件，在“导入筛选”选项卡中，选择“浏览单个文件”或“拼接多个文件”以重建微孔板。选择文件后，输入行数和列数，并选择“自动”。接着，选择“更新像素大小”，输入每个像素对应的实际距离，并使用“孔位向导”确定图像中各孔的位置，然后点击“处理保存”，进入下一个选项卡。打开 ROI（感兴趣区域）选项卡，选择手动绘制 ROI、自动绘制 ROI，或完全不使用 ROI（此时将对整块板进行分析）。在孔中选定区域后，单击“处理并保存”按钮进入下一步。勾选“隐藏孔”和“仅显示已筛选”复选框以查看 ROI。打开分析选项卡，选择每个孔或感兴趣区域（ROI），以确认自动搏动检测的准确性。通过选择单个搏动并按键盘上的删除键，可从轨迹中添加或删除搏动。完成后，点击保存。接下来，点击“分析”选项卡中的“时空图”按钮，并添加一条直线以生成时空图，用于可视化每个孔或感兴趣区域（ROI）的数据。选择水平或垂直线后，点击“生成图表”。在确认搏动检测准确无误后，进入“导出”选项卡，选择文件格式，进入“搏动统计”选项，然后点击“导出”。导出后，打开数据文件并运行选定的统计分析程序。相差显微成像显示，接种在MECM上的hiPSC-CMs相较于同一批次接种在小鼠ECM上的hiPSC-CMs，表现出更明显的成熟特征，并在结构上出现差异。成熟的细胞呈杆状，而未成熟的细胞则保持圆形。使用α-肌动蛋白抗体染色的心肌细胞显示出在每种ECM条件下培养的细胞典型形态。与肌钙蛋白I染色结果一致，α-肌动蛋白染色表明，在MECM上成熟的hiPSC-CM呈现出杆状成熟表型，并促进了更显著的肌节结构排列。在小鼠ECM与MECM上培养的细胞之间，线粒体含量和活性存在明显差异。使用电压敏感染料（VSD）和光学标测系统记录的动作电位电生理数据显示，心房特异性细胞的自发搏动频率显著快于心室特异性细胞，且动作电位持续时间（即APD80）更短。针对APD80等参数的全孔板热图揭示了在同一块孔板内特定参数具有良好的可重复性。成熟的hiPSC-CM单层细胞的典型动作电位反映了已分离并检测的成年心肌细胞的动作电位形态特征。还观察到典型的动作电位自发节律。在异丙肾上腺素作用下，β1-肾上腺素能受体的激活产生了正性变时性、正性变力性和正性松弛性效应。通过使用GCaMP6m钙荧光监测节律，研究了人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（HiPSC-CM）对人类Ether-a-go-go相关基因（hERG）通道阻滞剂（包括E-4031、多潘立酮、凡德他尼和索他洛尔）的反应。该研究显示，由E-4031阻断hERG通道所引发的早后除极现象可被检测到。处理悬浮细胞时应迅速操作，并通过轻柔移液避免剪切应力。此外，更换培养基时应小心进行，以避免损伤hiPS细胞合胞体。按照此操作步骤，可收集细胞中的蛋白质、RNA、DNA 和脂质，并用于研究者常用的技术分析。该技术使研究人员能够利用成年样心肌细胞研究疾病，并检测新药的心脏毒性。

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使用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层进行高通量心脏毒性筛选

本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。...

高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征

本文介绍一种稳定的人心肌细胞诱导方案，该方案结合了小分子调控的心脏分化与葡萄糖剥夺介导的心肌细胞纯化，可实现高纯度心肌细胞的制备，适用于心血管疾病建模与药物筛选。...

利用小分子调控分化及后续葡萄糖饥饿法从人诱导性多能干细胞中衍生高纯度心肌细胞

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

来源于人诱导性多能干细胞的自发收缩心肌细胞合胞体是研究人类心脏生理学和药理学的有用模型。本文介绍了一种高通量筛选系统，该系统利用钙敏感性荧光染料和温度可控的成像多孔板读数仪，定量分析外源性化合物对搏动频率的影响。...

在温度控制的384孔板中使用钙敏感荧光染料测量人诱导多能干细胞衍生心肌细胞合胞体的收缩

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本文描述并验证了一种稳定生成强健的人诱导性多能干细胞来源心肌细胞的方法，并对其功能进行了表征。这些技术可能有助于深入理解信号通路的机制，为大规模药物筛选提供平台，并可靠地模拟心脏疾病。...

生成心室样人诱导多能干细胞来源心肌细胞及用于钙处理特性表征的高质量细胞制备

本方案描述了在生理条件下对心脏组织进行切片并培养6天的方法。该培养系统可作为测试新型心力衰竭治疗药物有效性的平台，也可用于在三维心脏模型中可靠地检测急性心脏毒性。...

在生理条件下切片与培养猪心脏

本方案描述了用于高通量药物筛选和毒性检测的诱导多能干细胞衍生心肌细胞（iPSC-CMs）中触发细胞活动的全光学控制与观测方法。展示了在时间和空间上对表型模式进行多参数定量分析的结果，并演示了药物在数小时内产生的长期效应或在数天内进行的连续测量。...

用于毒性测试和表型药物筛选的诱导多能干细胞衍生心肌细胞中钙信号的高通量光学调控与记录

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外...

人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

分析人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞收缩功能和细胞完整性的变化，对于非临床药物开发具有重要意义。一种混合式96孔细胞分析系统能够以实时且符合生理条件的方式同时检测这两个参数，从而获得可靠且与人体相关的结果，为安全进入临床阶段提供必要支持。...

用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

学习使用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层进行高通量心脏毒性筛选的方法。该方案通过MECM培养板促进hiPSC-CMs成熟，提升药物心脏毒性预测的准确性，适用于大规模药物筛选研究。

高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

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