Name: 微电极阵列和膜片钳记录在人诱导多能干细胞来源心肌细胞上的技术应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 了解利用微电极阵列和膜片钳技术评估人诱导多能干细胞来源心肌细胞的收缩性和电生理特性。该方法可提升药物心脏安全性评估的准确性，助力临床前毒性筛选和精准医学研究。

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感谢 Blake Wu 对手稿的校对。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 HL113006、R01 HL141371、R01 HL163680、R01 HL141851、U01FD005978 和 NASA NNX16A069A（JCW）以及美国心脏协会博士后奖学金 872244（GMP）资助。

1. 培养基与溶液的制备
<ol>
	<li>通过将一管10 mL的50倍浓缩B27添加剂与500 mL RPMI 1640培养基混合，配制hiPSC-CM维持培养基。将培养基储存在4 °C，一个月内使用。使用前平衡至室温（RT）。</li>
	<li>通过将20 mL血清替代物与180 mL hiPSC-CM维持培养基混合（10%稀释，v/v），配制hiPSC-CM接种培养基。建议使用新鲜配制的接种培养基，但可在4 °C储存不超过2周。使用前平衡至室温（RT）。</li>
	<li>通过在4 °C过夜解冻一管（10 mL）基底膜基质，并将其分装为每管500 µL至无菌1.5 mL离心管中，制备细胞外基质包被溶液。储存于-20 °C以备后续使用。将500 µL基底膜基质与100 mL冰冻的DMEM/F12培养基混合（1:200稀释，v/v），制成基底膜基质包被溶液。</li>
	<li>配制50 mL Tyrode溶液，其中含135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、5 mM葡萄糖和10 mM HEPES。用NaOH调节pH至7.4。实验当天新鲜配制Tyrode溶液。</li>
	<li>配制50 mL细胞内移液管溶液，其中含120 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM EGTA和10 mM HEPES。用KOH调节pH至7.2。将细胞内移液管溶液分装至无菌5 mL离心管中，储存在-20 °C。实验当天，新鲜加入MgATP至终浓度为3 mM。</li>
	<li>配制1 mL Fura-2 AM负载溶液，其中含2 µM Fura-2 AM和0.1% Pluronic F-127。实验当天新鲜配制负载溶液，并避光保存。</li>
</ol>
2. hiPSC-CM 收缩运动的测量
<ol>
	<li>通过向96孔板的每个孔中加入100 µL细胞外基质包被液，制备基底膜基质包被的培养板。将96孔板置于37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>hiPSC-CMs的酶解离
	<ol>
		<li>从斯坦福心血管研究所iPSC生物样本库&#160;(http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)申请获取hiPSCs。根据先前发表的研究方法8,9诱导生成hiPSC-CMs。在10倍显微镜下观察六孔板中培养的hiPSC-CMs。 
		注意：当细胞仍处于增殖状态时，不要进行解离。否则，传代后细胞将在孔中过度生长，导致功能检测结果不准确。通常hiPSC-CMs在培养第18–23天时停止增殖。</li>
		<li>确保hiPSC-CMs搏动强烈，且纯度超过95%。通过针对心肌细胞特异性标志物——心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T）的免疫染色评估细胞纯度8,9。</li>
		<li>吸除维持培养基，用1× DPBS洗涤细胞两次。向六孔板的每个孔中加入1 mL细胞解离液，于37 °C孵育10分钟。 
		注意：应定期监测孵育时间。避免过度消化，以免降低细胞活力。</li>
		<li>使用5 mL移液器轻柔地将hiPSC-CMs上下吹打数次，以获得单细胞悬液。加入等体积的hiPSC-CMs接种培养基以中和细胞解离液。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心3分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1–2 mL hiPSC-CMs接种培养基中。</li>
		<li>采用台盼蓝排斥法测定细胞密度和活力。简要步骤如下：将10 µL细胞悬液与等体积台盼蓝混合，转移至细胞计数板，然后使用细胞计数仪进行计数，具体操作如前所述21。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种hiPSC-CMs
	<ol>
		<li>从96孔板中移除细胞外基质包被液。</li>
		<li>在100 µL hiPSC-CMs接种培养基中每孔接种50,000个细胞，并将96孔板置于37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育过夜。</li>
		<li>接种后1天，将hiPSC-CMs接种培养基更换为100 µL hiPSC-CMs维持培养基。此后每2天更换一次维持培养基，直至开始记录数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>建议在接种后至少10天测量hiPSC-CMs的收缩运动。</li>
		<li>打开温控装置，将目标温度设为37 °C。开启显微镜、相机和CO2供气系统。</li>
		<li>向载板架的水夹层中加入适量无菌去离子水（图2A）。将96孔板放置于载板架上，使细胞适应环境至少5分钟。</li>
		<li>打开成像软件，将相机帧率设置为每秒75帧（fps），视频/图像分辨率为1024 × 1024像素。启用自动对焦和自动亮度功能，记录hiPSC-CMs的视频和图像。 
		注意：记录过程中避免显微镜台面振动。</li>
		<li>打开分析软件以进行自动分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. hiPSC-CM 场电位的测量
<ol>
	<li>基底膜基质包被板的制备
	<ol>
		<li>在每孔48孔微电极阵列（MEA）板的记录电极区域上方，小心滴加8 µL细胞外基质包被溶液。参见 图3A 选择合适的电极区域放置液滴。此步骤对于保持hiPSC-CM单层集中在电极上至关重要。任何情况下均应避免触碰电极。</li>
		<li>向孔周围的区域加入 3 mL 无菌去离子水（图3A以防止48孔MEA板中的包被溶液蒸发。将48孔MEA板置于37 °C、5% CO₂的湿化细胞培养孵箱中孵育2 45–60 分钟。 
		注意：孵育时间不宜过长，以防止基底膜基质干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第2.2步所述进行hiPSC-CMs的酶解离。</li>
	<li>接种 hiPSC-CMs
	<ol>
		<li>使用200 µL枪头，在同一行或列中，小心移除孔表面大部分的细胞外基质培养基，避免触碰电极。</li>
		<li>在每孔同一行或列的记录电极区域，用8 µL hiPSC-CM接种培养基将50,000个细胞接种至每孔。</li>
		<li>重复最后两个步骤，直至所有孔均已接种细胞。在显微镜下检查，确认所有孔中均含有hiPSC-CM悬液。关于所需密度，请参见 图3B. 
		注意：如果基底膜基质完全干燥，将影响 hiPSC-CMs 的贴附，导致细胞贴附效果不理想。</li>
		<li>将48孔MEA板置于37 °C、5% CO₂的湿化细胞培养孵育箱中孵育2 60 分钟。</li>
		<li>缓慢而轻柔地向48孔MEA板的每孔中加入150 µL hiPSC-CM接种培养基。为避免分散先前已接种的hiPSC-CM，在加液时将培养板倾斜至45°角，将移液器枪头靠在每孔的孔壁上，缓慢释放培养基。 
		注意：加入培养基时速度过快或压力过高会导致贴壁的心肌细胞脱落。避免与hiPSC-CM悬液滴直接接触。</li>
		<li>将48孔MEA板置于37 °C、5% CO₂的湿化细胞培养孵育箱中孵育2 过夜。</li>
		<li>接种后1天，用300 µL hiPSC-CM维持培养基更换hiPSC-CM接种培养基。记录前每2天更换一次hiPSC-CM维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>接种后至少10天进行MEA检测（推荐）。接种后第10天，在10倍显微镜下观察自发搏动的hiPSC-CM单层细胞的密度，应如图所示 图3C.</li>
		<li>将48孔MEA板放入记录仪器中。触摸屏可用于监测温度（37 °C）和CO2 (5%) 状态。</li>
		<li>打开导航器软件。在实验设置窗口中，选择 心脏实时构型与场电位记录应用自发性或起搏控制的搏动模式。</li>
		<li>在搏动检测参数中，将检测阈值设为 300 µV，最小搏动周期设为 250 ms，最大搏动周期设为 5 s。选择 多项式回归 用于场电位持续时间（FPD）的计算。</li>
		<li>检查基线电活动信号是否成熟且稳定。 
		注意：多孔MEA板中每个电极记录到的成熟波形必须反映出具有清晰可辨特征的心脏场电位，这些特征应与心肌去极化峰和复极化相位相对应，如图所示 图3D- F.</li>
		<li>记录基线心肌活动1-3分钟。如需药物处理，在记录基线后向孔中加入化合物。将培养板置于培养箱中孵育至少30分钟，再进行下一次记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 人诱导多能干细胞衍生心肌细胞动作电位的测量
<ol>
	<li>通过将500 µL细胞外基质包被液加入35 mm玻璃底培养皿的玻璃底部区域，制备基底膜基质包被培养皿（图 4A）。将35 mm培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润化细胞培养孵育箱中孵育2 过夜。</li>
	<li>按照步骤2.2所述进行hiPSC-CMs的酶解离。</li>
	<li>接种 hiPSC-CMs
	<ol>
		<li>从35 mm培养皿中移除细胞外基质包被溶液。在35 mm培养皿的玻璃底部分，每孔加入500 µL hiPSC-CM接种培养基，接种50,000个细胞。</li>
		<li>将35 mm培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润化细胞培养孵育箱中孵育2 过夜。移除hiPSC-CM接种培养基，向35 mm培养皿中加入2 mL hiPSC-CM维持培养基。 
		注意：建议在2 mL吸液移液管上套一个200 µL非滤芯吸头，以去除废弃培养基，避免接触细胞。</li>
		<li>每2天更换一次hiPSC-CM培养基，然后再进行记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>至少在铺板后10天进行动作电位测量（推荐）。按照步骤1.4所述配制新鲜的Tyrode溶液。解冻一份细胞内电极溶液，并新鲜加入MgATP至终浓度为3 mM。</li>
		<li>使用显微拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制显微移液管。 
		注意：微电极的电阻宜为 2-5 MΩ。</li>
		<li>将hiPSC-CM维持培养基更换为Tyrode's溶液，使细胞在Tyrode's溶液中适应15分钟图4C）。将温度传感器插入腔室中，将35 mm培养皿按图示放入腔室 图4C，并将温度调节至 37 °C（图 4D).</li>
		<li>用细胞内液填充微量移液管，并将其插入连接至膜片钳放大器头级的电极架中图4E）。打开刺激/采集软件，加载动作电位记录程序，并选择电压钳制模式。</li>
		<li>将微移液管插入浴液中，选择合适的单个hiPSC-CMs，使用显微操作器调节并降低微移液管的位置，使其靠近选定的细胞。当移液管尖端插入浴液时，通过示波器显示器观察移液管电阻。</li>
		<li>将移液管靠近细胞，电流脉冲会略微减小，以反映封接电阻的增加。施加轻柔的负压吸力以进一步提高电阻，从而形成吉欧封接（gigaseal）。继续施加 密封 功能</li>
		<li>施加额外负压以击穿膜，获得全细胞记录构型。一旦吸破移液管尖端区域内的膜，细胞内液即与细胞胞质达到平衡。此时，通过放大器对话框从电压钳模式（V-clamp）切换至电流钳模式或零电流注入模式（C-Clamp）。按下 记录 单击按钮以生成并保存动作电位记录文件。 
		注意：模式切换可连续记录hiPSC-CMs的自发性动作电位 通过 无触发无刺激记录程序，可通过膜片钳放大器的V-mon输出进行监测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. hiPSC-CM 钙离子的测量2+ 瞬时的
<ol>
	<li>参见先前的实验方案，制备用于 Ca2+ 成像的定制化细胞培养室21。对于基底膜基质包被的细胞培养室，向细胞培养室中加入 200 µL 细胞外基质包被液。将细胞培养室置于 37 °C、5% CO2 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。</li>
	<li>按照步骤 2.2 所述方法对 hiPSC-CMs 进行酶解离散。</li>
	<li>接种 hiPSC-CMs
	<ol>
		<li>从细胞培养室中移除细胞外基质包被液。每孔加入 200 µL hiPSC-CM 接种培养基，接种 20,000 个细胞。</li>
		<li>接种后 1 天，将 hiPSC-CM 接种培养基更换为 200 µL hiPSC-CM 维持培养基。记录前每 2 天更换一次维持培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>建议在接种后至少 10 天进行 Ca2+ 瞬变测量。按照步骤 1.4 所述配制新鲜的台氏液。按照步骤 1.6 所述配制新鲜的 Fura-2 AM 负载溶液。</li>
		<li>吸除 hiPSC-CM 维持培养基，用台氏液洗涤两次。加入 100 µL Fura-2 AM 负载溶液，在室温下孵育 10 分钟。</li>
		<li>将 Fura-2 AM 负载溶液替换为台氏液，静置至少 5 分钟，以确保 Fura-2 AM 完全去酯化。</li>
		<li>在配备 40 倍油浸物镜（0.95 NA）的倒置落射荧光显微镜的 40 倍物镜上滴加一滴浸油。将细胞培养室置于显微镜载物台适配器中（图 5A）。</li>
		<li>将温度控制器导线连接至灌流室，并设定为 37 °C。安装电场刺激电极，设置脉冲频率为 0.5 Hz，脉冲持续时间为 20 ms。</li>
		<li>打开超高速波长切换光源，根据仪器说明书将其设置为 340 nm 和 380 nm 的快速切换模式。</li>
		<li>在软件中设置两个波长的曝光时间为 20 ms，记录时间为 20 s。记录反映 hiPSC-CMs 中 Ca2+ 瞬变实时变化的视频。将数据导出至电子表格，并按照先前所述方法进行分析23。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li>
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<li>Kozek, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+trafficking-deficient+variants+in+the+cardiac+potassium+channel+KV11.1%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1.</a> Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).</li>
<li>Heyne, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+functional+effects+of+missense+variants+in+voltage-gated+sodium+and+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels.</a> Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662(2019).</li>
<li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565(2021).</li>
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</ol>

J.C.W. 是 Greenstone Biosciences 的联合创始人，但不存在利益冲突，因为本文所展示的工作完全独立。其他作者声明无利益冲突。

人类诱导多能干细胞（iPSC）技术已成为疾病建模和药物筛选的强大平台。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，用于测量hiPSC-CM的收缩力、场电位、动作电位以及Ca2+瞬变。该方案可对hiPSC-CM的收缩功能和电生理特性进行全面表征。这些功能性检测方法已在本课题组的多项研究中得到应用12,13,18,24,25,26,27。
必须使用搏动状态良好的hiPSC-CMs，否则检测信号的信噪比将显著下降。此外，建议在测量前确保hiPSC-CMs具有高纯度。非心肌细胞的存在尤其会影响收缩运动和场电位测量的...

药物研发是一个漫长且昂贵的过程。一项针对2009年至2018年间获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的新治疗药物的研究报告指出，每种产品的资本化研发和临床试验的估计中位成本为9.85亿美元1。药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的首要原因2。值得注意的是，多种类别的治疗药物均被报道可引发心脏毒性3。因此，心脏安全性评估是药物研发过程中的关键环节。目前心脏安全性评估的范式仍高度依赖动物模型。然而，使用动物模型所带来的物种差异正日益被视为对人类患者药物诱导心脏毒性预测不准确的主要原因4。例如，由于复极化电流的差异，人类与小鼠之间的心肌动作电位形态存在显著不同5。此外，不同物种间心脏肌球蛋白和可影响心脏生理功能的环状RNA的差异性亚型已有充分文献记录6,7。为弥补这些差距，迫切需要建立一种可靠、高效且基于人类的模型，用于临床前心脏安全性评估。
诱导性多能干细胞（iPSC）技术的突破性发明，为药物筛选和疾病建模提供了前所未有的平台。在过去十年中，生成人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的方法已日趋成熟8,9。hiPSC-CMs 因其在疾病建模、药物诱导心脏毒性筛选以及精准医学中的潜在应用而受到广泛关注。例如，hiPSC-CMs 已被用于模拟由遗传因素引起的心脏疾病的病理表型，如长QT综合征10、肥厚型心肌病11,12和扩张型心肌病13,14,15。由此，研究人员已鉴定出参与心脏疾病发病机制的关键信号通路，为开发有效的治疗策略提供了线索。此外，hiPSC-CMs 还被用于筛选与抗癌药物相关的心脏毒性，包括阿霉素、曲妥珠单抗和酪氨酸激酶抑制剂16,17,18；目前，减轻此类心脏毒性的策略正在研究中。最后，hiPSC-CMs 中保留的遗传信息使得在个体和群体水平上对药物诱导心脏毒性进行筛查和预测成为可能19,20。综上所述，hiPSC-CMs 已被证实是个性化心脏安全性预测中不可或缺的工具。
本方案的总体目标是建立一套全面且高效的方法，用于研究hiPSC-CMs的功能特性，这对于将hiPSC-CMs应用于疾病建模、药物诱导的心脏毒性筛选以及精准医学具有重要意义。本文详细介绍了多种功能检测方法，用于评估hiPSC-CMs的功能特性，包括收缩力、场电位、动作电位以及钙离子（Ca2+）处理能力的测定（图1）。

<table><tbody><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔，#1.5 盖玻片</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>50x B27添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>hiPSC-CM 培养基</td></tr><tr><td>6孔培养板</td><td>E &amp;amp; K Scientific</td><td>EK-27160</td><td>hiPSC-CM 培养</td></tr><tr><td>96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板</td><td>康宁</td><td>3603</td><td>收缩运动测量</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td>酶解离</td></tr><tr><td>Axion集成工作室（AxIS）</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>导航软件</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>哈佛仪器</td><td>BF 100-50-10</td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1 M H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>细胞计数板载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10228</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>CytoView 48孔MEA板</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-tMEA-48B</td><td>多电极阵列</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12634028</td><td>细胞外基质培养基</td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td>细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>EPC 10 USB&amp;nbsp;膜片钳放大器</td><td>Warner Instruments</td><td>89-5000</td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>Fura-2 AM，细胞通透性</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F1221</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 瞬态测量</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode&amp;rsquo;溶液</td></tr><tr><td>hiPSCs</td><td>斯坦福心血管研究所iPSC生物样本库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529552</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828-028</td><td>hiPSC-CM 接种培养基</td></tr><tr><td>KOH 8&amp;nbsp;M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4494</td><td>细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>Lambda DG 4</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 瞬态测量；超高速波长切换光源</td></tr><tr><td>Luna-FL 全自动荧光细胞计数仪</td><td>WISBIOMED</td><td>LB-L20001</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>Maestro Pro&amp;nbsp;MEA系统</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>多电极阵列</td></tr><tr><td>基底膜基质（生长因子减少型 Matrigel GFR）</td><td>康宁</td><td>356231</td><td>细胞外基质培养基</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>细胞内移液管溶液</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>NaOH 10&amp;nbsp;M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Tyrode&amp;rsquo;s 溶液</td></tr><tr><td>NIS 元素 AR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127（DMSO 中 20% 溶液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P3000MP</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 瞬态测量</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>hiPSC-CM 培养基</td></tr><tr><td>索尼 SI8000 细胞运动成像系统</td><td>索尼生物技术</td><td></td><td>收缩运动测量</td></tr><tr><td>Sutter 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>膜片钳</td></tr><tr><td>台盼蓝染色</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>细胞计数</td></tr></tbody></table>

人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的主要原因。因此，在药物开发过程中采用适当的临床前心脏安全性评价模型至关重要。目前，心脏安全性评价仍高度依赖动物实验。然而，由于物种间差异，特别是心脏电生理特性的种属特异性，动物模型在向人类转化时存在特异性差的问题。因此，迫切需要建立一种可靠、高效且基于人类细胞的临床前心脏安全性评价模型。人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种极具价值的 体外 用于药物诱导心脏毒性筛选和疾病建模的模型。hiPSC-CMs 可从具有不同遗传背景和多种疾病状态的个体中获得，使其成为评估个体化药物诱导心脏毒性的理想替代模型。因此，亟需建立全面研究 hiPSC-CMs 功能特性的方法体系。在本方案中，我们详细描述了可在 hiPSC-CMs 上进行的多种功能检测，包括收缩力、场电位、动作电位和钙处理能力的测量。总体而言，将 hiPSC-CMs 应用于临床前心脏安全性评估，有望彻底改变药物研发模式。

本方案描述了如何测量hiPSC-CMs的收缩运动、场电位、动作电位以及Ca2+瞬变。包含酶消化、细胞接种、维持培养及功能检测操作的示意图见图1。hiPSC-CM单层的形成是进行收缩运动测量的必要条件（图2B）。hiPSC-CMs收缩-舒张运动的代表性轨迹如图2C所示。分析软件可通过默认设置自动识别收缩起始点、收缩峰值点、收缩终止点、舒张峰值点和舒张终止点，从而实现对收缩-舒张运动轨迹的自动化分析（图2D）。收缩与舒张峰值速度可用于评估hiPSC-CMs的收缩与舒张能力。此外，还可获得收缩与舒张的形变距离。
MEA 检测是一种细胞外记录动作电位（称为场电位）的方法。成功记录场电位需要在 MEA 板每孔内的所有电极上完全覆盖 hiPSC-CM 单层细胞（图 3C）。每个...

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外 用于药物诱导心脏毒性筛选和疾病建模。本文中，我们详细描述了一种测量人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）收缩力和电生理特性的实验方案。

药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的首要原因。因此，采用适当的临床前心脏安全性评估……

心脏安全性评估是药物研发过程中的关键环节。人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞已被证实是一种可靠、高效且基于人体的临床前心脏安全性评估模型。我们已建立了一系列方法，用于全面研究人iPSC来源心肌细胞的功能特性，这些方法在重要疾病建模、药物诱导心脏毒性筛选以及精准医学中具有重要意义。将人iPSC来源的心肌细胞越来越多地纳入标准的临床前安全性评价流程，有望提高对候选化合物毒性预测的准确性。在进行检测前，需先将人iPSC来源的心肌细胞培养至少10天。打开温度控制器，并将其设定为37°C。打开显微镜、相机和二氧化碳供应。向培养板支架的水套中加入适量无菌去离子水。将96孔板放置在板架上，并将细胞孵育至少五分钟。打开观察软件，将相机帧率设置为每秒75帧，视频或图像分辨率为1024 × 1024像素。启用自动聚焦和自动亮度功能，记录由人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的视频和图像。在48孔微电极阵列板每个孔的记录电极区域上，小心地滴加8 µL细胞外基质包被溶液。然后向孔周围区域加入三毫升无菌去离子水，以防止包被溶液蒸发。使用200微升移液枪头，在不接触电极的情况下，移除同一行或同一列中各孔表面大部分的细胞外基质培养基。在记录电极区域上，用八微升接种培养基液滴，每孔接种50,000个细胞。重复操作直至所有孔均接种细胞。然后将微电极阵列板放入湿润的细胞培养孵育箱中孵育。缓慢向微电极阵列板的每个孔中加入150 µL铺板培养基。接种后第10天，在显微镜下检查人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层的自发搏动密度。将48孔微电极阵列板放入记录仪器中。确保温度为37摄氏度，二氧化碳浓度为5%。打开导航软件。在实验设置窗口中，选择心脏实时配置和场电位记录。应用自发性或粘贴搏动配置。在搏动检测参数中，将检测阈值设为 300 微伏，最小搏动周期设为 250 毫秒，最大搏动周期设为 5 秒。选择多项式回归法用于场电位持续时间的计算。检查基线电活动信号是否成熟且稳定，并采集一到三分钟的基线心脏活动数据。在铺板后第10天进行记录。将人iPSC-CM维持培养基更换为Tyrode's溶液，让细胞适应15分钟。将温度传感器插入腔室，并将35毫米培养皿放入其中。调节温度至37摄氏度。使用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制微电极。用细胞内液填充微电极，并将其插入连接至膜片钳放大器前置放大器的电极 holder 中。打开数据采集软件，加载动作电位记录程序，并选择电压钳制模式。将微量移液器插入灌流液中，选择合适的人单个iPSC来源的心肌细胞。使用显微操作器调节并降低微量移液器的位置，使其靠近选定的细胞。当移液器尖端插入灌流液中后，通过示波器监视器检查移液器的阻抗。将移液管靠近细胞，此时电流脉冲会略微减小，反映出封接电阻的增加。施加轻柔的负压吸力以进一步提高电阻，从而形成吉欧封接（gigaseal）。然后应用封接功能，施加额外的负压以破裂膜片，获得全细胞记录构型。此时，通过放大器对话框切换至电流钳模式，或不进行电流注入。按下记录按钮以生成并保存动作电位记录文件。在铺板后至少 10 天进行钙瞬变测量。配制新鲜的台氏液和 Fura-2 AM 负载溶液。吸弃人iPSC CM维持培养基，用Tyrode's溶液洗涤培养室两次。加入100微升Fura-2 AM负载溶液，在室温下孵育10分钟。将Fura-2 AM负载溶液替换为Tyrode's溶液，并继续孵育至少5分钟，以确保Fura-2 AM完全去酯化。在倒置落射荧光显微镜的40倍油镜物镜上滴加一滴浸油。将细胞腔室放入显微镜的载物台适配器中。将温度控制器导线连接至灌流腔室，并将其设定为37摄氏度。安装电场刺激电极，将脉冲设置为0.5赫兹，持续时间为20毫秒。打开超高速波长切换光源，并将其设置为340纳米和380纳米的快速切换模式。两种波长的曝光时间均设置为20毫秒，记录时间为20秒。记录反映钙瞬变实时变化的视频，并将数据导出至电子表格进行分析。采用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞单层进行收缩运动测量。利用分析软件对收缩-舒张运动轨迹进行分析，可检测到收缩起始点、收缩峰值点、收缩终止点、舒张峰值点以及舒张终止点。在微电极阵列板的所有电极上均观察到人诱导多能干细胞来源的心肌细胞单层完全覆盖。每个电极记录到的成熟波形反映了具有可识别特征的心脏场电位。经分析后，获得了搏动周期、场电位持续时间和锋电位幅度。采用电流钳模式进行全细胞膜片钳记录，可记录单个心肌细胞的自发动作电位。分析后获得了多个参数，包括动作电位幅度、最大舒张电位和动作电位持续时间。钙成像分析后，得到了随时间变化的F340/F380比值，并绘制了刺激诱导的钙瞬变原始轨迹。此外，还获得了幅度、舒张期钙水平和钙衰减时间常数等参数。使用处于良好搏动状态的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞非常重要，同时需确保人诱导多能干细胞来源心肌细胞的高纯度。本方案包含四种特定技术，用于研究人诱导多能干细胞来源心肌细胞的功能性、其他构型或自动性，以及研究在心脏活动中起关键作用的心脏离子电流

technical-applications-microelectrode-array-patch-clamp-recordings-on

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

微电极阵列和膜片钳记录在人诱导多能干细胞来源心肌细胞上的技术应用

对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理表征，对于心脏疾病建模及评估药物反应至关重要。本方案提供了将hPSC-CMs解离并接种于多电极阵列上的必要信息，用于测量其场电位，并介绍了一种分析QT间期和RR间期的方法。...

利用多电极阵列（MEAs）对人多能干细胞来源的心肌细胞（hPSC-CMs）进行电生理分析

本文介绍一种光学成像技术，用于特异性检测心室样诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中的动作电位。该方法基于启动子驱动的电压敏感型荧光蛋白表达。...

人诱导性多能干细胞来源的心室样心肌细胞中亚型特异性光学动作电位记录

本文包含一系列实验方案，用于在多孔微电极阵列（MEA）板上培养人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM）网络，并通过可逆电穿孔技术穿透细胞膜，以记录动作电位。可在数天内对相同的细胞位点进行多次高通量记录。...

基于多孔微电极阵列的人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞网络用于重复动作电位记录

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

分析人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞收缩功能和细胞完整性的变化，对于非临床药物开发具有重要意义。一种混合式96孔细胞分析系统能够以实时且符合生理条件的方式同时检测这两个参数，从而获得可靠且与人体相关的结果，为安全进入临床阶段提供必要支持。...

用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

激光穿孔与微电极阵列（MEA）相结合，可实现对培养的原代心肌细胞及干细胞来源心肌细胞的动作电位样信号记录。相较于标准记录方法，该技术提供的波形形态可更深入揭示受试化合物的作用机制，将膜片钳与MEA检测结果相联系，有望进一步优化未来的心脏安全性研究。...

基于微电极阵列的激光诱导心肌细胞动作电位样检测以提高安全药理学预测性

在此，我们展示了一种利用二维人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）单层在柔性基底上培养，并结合基于视频的显微镜技术，用于无创评估心脏医疗设备收缩力的方法。该工具将有助于 体外...

在二维人源干细胞衍生心肌细胞中评估心脏收缩力调节治疗

本文介绍了一种利用基于光学的平台在人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞中进行收缩力和钙离子测量的成熟方法。该平台使研究人员能够快速且可重复地研究突变的影响以及对各种刺激的反应。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中钙离子与收缩参数的实时测量

为了揭示前列腺癌发生早期的分子机制，迫切需要新颖且创新的人类模型系统和研究方法。前前列腺尿生殖窦间充质（UGSM）具有诱导多能干细胞群体形成人类前列腺上皮的潜力，是前列腺研究中一种强大的实验工具。...

利用啮齿类动物泌尿生殖窦间质与人类干细胞的组织重组形成人类前列腺上皮

目前关于心脏疾病细胞基础的研究主要依赖于动物模型。本文描述并验证了一种从人类心室心肌的小型手术样本中获取单个活心肌细胞的创新方法。所获得的人类心室心肌细胞可用于电生理学研究和药物测试。...

从新鲜手术样本中分离与功能表征人类心室心肌细胞

了解利用微电极阵列和膜片钳技术评估人诱导多能干细胞来源心肌细胞的收缩性和电生理特性。该方法可提升药物心脏安全性评估的准确性，助力临床前毒性筛选和精准医学研究。

人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

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