Name: 研究与Bio3D-web的蛋白质序列 - 结构 - 动力学关系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 探索使用Bio3D-web进行蛋白质序列、结构与动力学关系的交互式分析。该平台无需编程知识即可实现序列比对、主成分分析和正态模式分析，帮助研究人员深入理解蛋白质家族的构象多样性。

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我们感谢 Guido Scarabelli 博士和 Hongyang Li 在开发过程中进行的大量测试，同时也感谢 Bio3D 用户社区以及卑尔根大学结构生物信息学研讨会的参与者所提供的反馈和意见，这些反馈和意见极大地改进了本应用程序。

注意：一次典型的 Bio3D-web 会话包含五个连续且相互关联的步骤（示意图参见图1）。每个步骤在网页应用中均以连续的导航标签实现，分别为 SEARCH、ALIGN、FIT、PCA 和 eNMA。
1. 结构搜索与选择（SEARCH）
<ol>
	<li>输入结构
	<ol>
		<li>获取腺苷酸激酶（Adk）的 PDB ID， 例如 通过搜索 PDB [http://www.rcsb.org/pdb] 获取。或者，获取目标蛋白质的氨基酸序列， 例如 来自 UniProt [http://uniprot.org]。</li>
		<li>输入 Adk 的四个字符长的 PDB ID例如 1AKE），或将蛋白质序列粘贴到文本框中 &#34;输入结构或序列&#34; 面板</li>
	</ol>
	</li>
	<li>命中筛选
	<ol>
		<li>点击蓝色 &#34;下一步&#34; （命中筛选）按钮位于第一个面板中，或直接向下滚动至面板 B） &#34;命中筛选&#34; 用于进一步分析。</li>
		<li>确保 &#34;限制所包含结构的总数&#34; 滑块被调至最大值，以包含所有高于阈值的结构。</li>
		<li>降低 &#34;调整包含的比特得分阈值&#34; 以包含亲缘关系更远的匹配结果，或提高阈值以排除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选的命中过滤
	<ol>
		<li>点击蓝色 &#34;下一步&#34; （命中筛选）按钮位于第一个面板中，或直接向下滚动至面板 C） &#34;可选的对相关结构进行过滤以供进一步分析&#34;.</li>
		<li>通过检查表格的详细信息，确保所选命中结果代表相关结构， 例如 PDB 名称、物种及结合配体。</li>
		<li>如有需要，可通过点击表格中的行来手动优化所选结构子集。 
		&#8203;注意：以蓝色高亮显示的行表示在后续标签页中被选中用于进一步分析的 PDB ID。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多序列比对分析（ALIGN）
<ol>
	<li>单击“对齐”选项卡，以对“搜索”选项卡中选定的结构进行序列比对。</li>
	<li>比对结果汇总
	<ol>
		<li>在面板 A) 中查看比对摘要 &#34;比对结果汇总&#34;确保目标区域已对齐，且未被一个或多个结构中的间隙所遮蔽。</li>
		<li>如有需要，切换 &#34;显示对齐编辑选项&#34; 并移除不需要的 PDB ID， 例如 含有缺失残基的PDB结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>序列比对分析
	<ol>
		<li>点击蓝色 &#34;下一步&#34; （分析）按钮以对收集的结构进行基于序列的聚类分析。</li>
		<li>选择“树状图”选项。调整“聚类为 K 组”滑块，将结构划分为 k 个组。</li>
		<li>如有需要，可通过勾选“更多聚类和输出选项”复选框来更改聚类方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>残基保守性分析
	<ol>
		<li>点击蓝色 &#34;下一步&#34; （保守性）按钮，用于计算列向的残基保守性。</li>
		<li>选择比对的结构组以生成每个比对位置上残基保守性的图谱。</li>
		<li>选择与PFAM种子比对对齐的结构，以显示相对于包含该家族代表性成员的关联PFAM种子比对所计算的保守性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>序列比对展示
	<ol>
		<li>点击蓝色 &#34;下一步&#34; （比对）按钮，以使用浏览器内嵌的比对可视化工具显示完整的序列比对结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 结构拟合与分析（FIT）
<ol>
	<li>进入 FIT 选项卡以执行结构叠合。</li>
	<li>结构叠合
	<ol>
		<li>勾选 &#34;显示 PDB&#34; 复选框，以在浏览器中可视化对齐的蛋白质结构。</li>
		<li>通过目视检查确保蛋白质结构已叠合到相应且相关的区域。点击并拖动鼠标可旋转结构，滚动可缩放。</li>
		<li>点击 &#34;颜色选项&#34; 调整结构的颜色。颜色选项包括对齐位置、每个位置的结构变异性、RMSD 聚类组、序列聚类组、对齐区域和二级结构。</li>
		<li>将叠合后的结构下载为常规 PDB 文件，或下载为单个 PyMOL 会话文件，以便在专用分子可视化程序中查看。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结构分析
	<ol>
		<li>点击蓝色的 &#34;下一步&#34;（分析）按钮，对收集的 PDB 结构进行基于结构的聚类分析。</li>
		<li>在“绘图选项”下拉菜单中切换 RMSD 热图。</li>
		<li>通过勾选 &#34;更多聚类和输出选项&#34; 复选框，调整聚类选项，包括聚类方法本身。 
		注：成对 RMSD 数据也可显示为树状图、直方图或热图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>残基波动性
	<ol>
		<li>点击蓝色的 &#34;下一步&#34;（RMSF）按钮，查看每个残基的结构变异性（以 RMSF 图显示），主要二级结构元件显示在横轴的边缘区域。</li>
		<li>勾选“显示 B 因子”复选框，将参考结构的晶体学 B 因子叠加到 RMSF 图上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 主成分分析（PCA）
<ol>
	<li>进入&#34;PCA&#34;标签页以执行主成分分析。</li>
	<li>主成分的可视化
	<ol>
		<li>勾选&#34;Show PC Trajectory&#34;复选框，使用浏览器内可视化工具查看主成分（PC）所描述的运动。</li>
		<li>确保从第一个下拉菜单中选择了&#34;Principal Component 1&#34;。</li>
		<li>若要可视化其他主成分所描述的运动，请从&#34;Choose Principal Component&#34;下拉菜单中选择所需的主成分。</li>
		<li>从&#34;Color options&#34;下拉菜单中更改轨迹的着色方式。</li>
		<li>在&#34;Color options&#34;中选择&#34;Variability per position&#34;，以位移幅度进行着色。</li>
		<li>点击&#34;Download PDB trajectory&#34;按钮，在&#34;Principal Component Visualization&#34;面板中获取主成分所描述运动的轨迹视图。</li>
		<li>点击&#34;Download PyMOL&#34;会话文件按钮，生成一个PyMOL会话文件，将运动表示为矢量场。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构象体分析
	<ol>
		<li>点击蓝色的&#34;Next&#34;（Plot）按钮，将各个结构投影到选定的两个主成分上。</li>
		<li>确保&#34;PC on X-axis&#34;设置为1，&#34;PC on Y-axis&#34;设置为2。若要将结构投影到其他主成分上，请相应调整主成分编号。</li>
		<li>选择&#34;Cluster by PC Subspace&#34;，按基于主成分的聚类对图中结构进行着色；选择&#34;RMSD&#34;，按基于&#34;RMSD&#34;的聚类着色；选择&#34;Sequence&#34;，按基于序列的聚类进行着色。</li>
		<li>点击图中的任意单个点以标记结构。或者，在图下方的表格&#34;PCA conformer plot annotation&#34;中高亮显示一个或多个结构。</li>
		<li>滑动“subspace slider”以包含更多或更少的主成分用于聚类算法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>残基贡献
	<ol>
		<li>点击蓝色的&#34;Next&#34;（Residue contributions）按钮，计算各个主成分的残基贡献。</li>
		<li>在&#34;Choose Principal Component&#34;文本框中输入主成分编号，以绘制其他主成分的贡献图。</li>
		<li>勾选&#34;Spread lines&#34;复选框，避免残基贡献值重叠绘制。</li>
		<li>取消勾选&#34;Multiline plot&#34;复选框，将残基贡献值绘制在独立的图中。</li>
		<li>勾选&#34;Show RMSF&#34;以包含RMSF值（来自FIT标签页）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 集合正则模式分析（eNMA）
<ol>
	<li>点击 eNMA 选项卡以启动正则模式（NMs）计算。</li>
	<li>结构筛选
	<ol>
		<li>通过调高或调低&#34;截断值&#34;来调整纳入/排除的结构数量。</li>
		<li>点击绿色的&#34;运行集合NMA&#34;按钮以开始NMA计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>正则模式可视化
	<ol>
		<li>向下滚动至 eNMA 选项卡的第二个面板（正则模式可视化），以查看正则模式的运动情况。 
		&#8203;注：默认情况下，可视化窗口中显示的是与PC-1重叠度（相似性）最高的正则模式。</li>
		<li>若要可视化其他正则模式或其他PDB结构所描述的运动，请分别从&#34;选择模式&#34;和&#34;为结构显示NMs&#34;下拉菜单中选择所需的正则模式和结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>残基波动分析
	<ol>
		<li>点击蓝色的&#34;下一步&#34;（波动）按钮，以计算选定用于eNMA分析的结构中各残基的波动情况。</li>
		<li>切换&#34;按RMSD聚类&#34;选项，以基于RMSD聚类对波动曲线进行着色。</li>
		<li>切换&#34;按RMSIP聚类&#34;选项，以基于RMSIP聚类对波动曲线进行着色。</li>
		<li>勾选&#34;分散线条&#34;复选框，以将分组后的波动曲线彼此分开绘制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较NMA与PCA
	<ol>
		<li>点击蓝色的&#34;下一步&#34;（PCA与NMA比较）按钮，以计算各个正则模式（NMs）与主成分（PCs）之间的相似性。</li>
		<li>从&#34;比较结构的NMs&#34;下拉菜单中选择一个PDB编号，以计算该结构的正则模式与PCA选项卡中计算出的主成分之间的相似性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重叠分析
	<ol>
		<li>点击蓝色的&#34;下一步&#34;（重叠分析）按钮，以计算所计算的正则模式与两个选定结构之间结构差异向量的重叠程度。</li>
		<li>从&#34;比较结构的NMs&#34;下拉菜单中选择一个“参考”PDB编号，并/或在结构表格中选择一个或多个PDB编号，以与参考PDB进行成对比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>聚类分析
	<ol>
		<li>点击蓝色的&#34;下一步&#34;（聚类）按钮，以基于两两之间的正则模式相似性（RMSIP）进行结构聚类。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kornev, A. P., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics-Driven+Allostery+in+Protein+Kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics-Driven Allostery in Protein Kinases.</a> Trends Biochem. Sci. 40 (11), 628-647 (2015).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

Bio3D-web 可用于交互式地探索和绘制现有晶体结构中蛋白质的结构、动态及功能状态。此外，基于 NMA 和 PCA 的聚类结果，结合注释信息和基于序列的分析，对于选择代表性结构以进行更耗时的分析（如集合小分子对接或分子动力学模拟）尤其有帮助。因此，Bio3D-web 通过降低所需的技术门槛，促进了更广泛研究人员开展高级结构生物信息学分析。当前 Bio3D-web 的设计更注重简洁性，而非全面涵盖完整独立版 Bio3D 软件包中的所有分析方法。在许多情况下，研究人员可先使用 Bio3D-web 理解其感兴趣的蛋白家族或超家族中的总体趋势，进而指导后续更专门化的分析。因此，Bio3D-web 被设计为一种快速探索生物分子结构数据集并生成科学假说的工具。我们鼓励用户进一步深入分析其数据，为此我们在可重复性报告中提供了示例 Bio3D 代码，该报告同时保存了所有查询细节和分析结果。
在上述代表性实验方案中，我们展示了 Bio3D-web 揭示腺苷酸激酶（Adk）功能构象转变结构特征的能力。Bio3D-web 的其他应用还包括对用户上传的 PDB 结构进行结构与动力学分析。例如，用户可上传新的结构，甚至蛋白质序列用于分析。前文提到的分析步骤，尤其是弹性网络模型分析（eNMA）步骤，能够揭示蛋白质运动中的局部和全局趋势，其中协同运动具有功能意义。与无配体（apo）结构的比较还可揭示从非结合态到结合态构象转变的特征。更多针对不同蛋白质家族的应用实例可在线获取。
尽管所有蛋白质都是具有柔韧性和动态性的实体，但并非所有蛋白质在多种不同状态（例如 活性与非活性状态）下都有可用的原子分辨率结构。因此，我们对蛋白质结构空间的认识是有限的，从而通过 Bio3D-web 等工具获得的洞察也必然在某些蛋白质上受到限制。然而，随着当前技术的进步以及结构基因组学新计划的推进，本文所介绍的方案将日益成为揭示重要结构-功能关系的重要途径。一个关键步骤是在分析进化上较远源的蛋白质时尤为重要的问题，即 ALIGN 标签页中可能出现的比对错误。当序列相似性低于 30% 时，比对错误不可避免，用户在此类情况下必须仔细检查并修正 ALIGN 标签页中的序列比对。比对错误可能导致 FIT 标签页中结构叠加结果不正确，并掩盖后续主成分分析（PCA）中最相关的构象变化。此外，用户应注意所选 PDB 结构中是否存在残基缺失，因为在当前实现中，PCA 仅能对所有结构均具有对应碳α原子解析的蛋白质残基进行。因此，若某个选定的 PDB 结构在蛋白质的特定区域中存在未解析的残基，则该区域将被排除在 PCA 之外。
Bio3D-web 目前仅限于分析单链 PDB 结构。因此，无法使用当前协议探索发生在四级结构水平上的功能运动。尽管我们目前正在开发新算法以在 Bio3D-web 中包含此类分析，但目前唯一可行的选择是通过传统的 Bio3D 使用方式实现。
Bio3D-web 是唯一一款能够在线查询和识别结构集合、解读其序列与结构变异模式，并通过分析和预测其结构可塑性来提取机制信息的应用程序。目前已有大量分子可视化工具和在线服务器，可帮助研究人员探索和分析单个生物分子结构。然而，针对大规模异源蛋白家族的序列、结构与动力学分析工具，通常需要较高的计算技术背景，且往往仅对具备相关编程技能的用户开放。例如，Bio3D 软件包需要掌握 R 语言8，ProDy 需要 Python 编程基础，而 Maven 则要求具备 Matlab 使用经验9,10。相比之下，Bio3D-web 无需任何编程知识，从而显著提升了高级比较性序列、结构与动力学分析的可及性，并降低了使用门槛。此外，Bio3D-web 服务还集成了分子结构的准备、整理、注释和清理等常规分析前所需的处理步骤。同时，依托服务器端的计算实例，用户可通过任意现代网页浏览器启动并控制对大量结构的分析，从而摆脱了本地需具备高性能计算资源的限制。
Bio3D-web 的开放开发正在进行中（参见 https://bitbucket.org/Grantlab/bio3d）。我们持续添加新的分析功能并改进现有方法。未来的发展重点将包括基于距离矩阵的主成分分析（PCA）和扭转角主成分分析（torsional PCA）、引入系统发育成分的更全面的序列保守性分析方法、集合结合位点识别，以及跨蛋白质家族的动态网络分析新方法。在此意义上，当前的网络应用为许多其他协作式结构生物信息学分析工作流提供了起点，支持在用户自定义的实验结构集上实现可重复和可共享的分析步骤。我们还计划未来支持PDB结构中除不对称单元中的单条或多条链外的生物大分子组装体（biological unit）坐标集。其他新增功能将包括增强的协作工作区保存与加载功能，以及撤销操作的可能性。
Bio3D-web 是一个用于生物分子结构数据交互式分析的在线应用程序。Bio3D-web 可在任何现代网络浏览器上运行，提供以下功能：（1）根据用户设定的相似性阈值，识别相关的蛋白质结构集合；（2）进行多序列比对和结构叠合；（3）序列与结构保守性分析；（4）通过主成分分析绘制构象间关系图；以及（5）通过集合态正则模式分析比较预测的内部动力学特性。该集成化功能为研究蛋白质家族及超家族中的序列-结构-动力学关系提供了完整的工作流程。除了提供便捷、易于使用的动态界面以探索参数和方法选择的影响外，Bio3D-web 还会完整记录用户的输入内容及会话过程中生成的图形结果。这使得用户能够轻松共享并复现生成其结果的分析步骤序列。Bio3D-web 完全使用 R 语言实现，基于 Bio3D 和 Shiny R 软件包开发。用户可通过我们的在线服务器使用该程序，也可在任何安装了 R 的计算机上本地安装运行。这包括在本地服务器上部署，以建立可定制的多用户实例，并访问制药行业常用的专属结构数据集。完整的源代码和详尽的文档依据 GPL-3 开源许可证提供，获取地址：http://thegrantlab.org/bio3d/webapps

蛋白质数据库（PDB）目前包含超过 120,000 个蛋白质结构——其中许多属于同一蛋白质家族，但在不同的实验条件下解析得到。这些多重结构为理解蛋白质结构与功能的复杂性提供了宝贵的资源。例如，对这些结构集合进行严格比较，可以揭示重要的分子机制1,2,3，并阐明配体结合、酶催化以及双分子识别等过程中涉及的构象动态4,5,6,7。通过对蛋白质家族的序列、结构和动力学进行详细的规模化分析，常常可以获得新的见解。然而，这通常需要具备相当的生物信息学和计算机编程专业知识，并熟悉所研究的蛋白质系统。例如，Bio3D、ProDy 和 Maven 等软件包分别要求使用 R、Python 和 Matlab 进行编程8,9,10。相反，在线的结构柔性分析工具通常仅限于对单个结构进行研究11,12。在这方面的一个例外是最近开发的 WebNM@ 服务器，它允许比较由用户指定的多个预对齐结构经正常模式分析（NMA）得到的柔性模式13。然而，该服务器缺乏自动识别用于比较的结构、进行结构比对或在 NMA 之外进一步分析的功能。另一个近期的贡献是在线 PDBFlex 数据库，它提供了对序列同一性达到 95% 或更高的 PDB 结构的预计算分析14。然而，目前尚无法对更为多样化的结构集合进行分析。
我们此前已介绍过 Bio3D-web——一个易于使用的网络应用程序，用于分析蛋白质序列-结构-动力学之间的关系15。Bio3D-web 的独特之处在于，它在线提供了简便的一体化功能，可用于识别、比较和深入分析大型同源结构集合。本文介绍了一种利用 Bio3D-web 在线研究蛋白质序列-结构-动力学关系的详细实验方案。Bio3D-web 提供多种功能，以支持如图1所示并下文详述的数据分析五大主要步骤。这些步骤构成一个完整的工作流程，从输入查询序列或结构开始，经过多个层次的序列-结构-动力学分析，最终生成总结性报告。分析结果可通过浏览器内丰富的可视化和绘图工具即时获取，也可通过下载常用格式的结果文件获得。除了提供便捷易用的动态界面以探索参数和方法选择的影响外，Bio3D-web 还会将用户会话中的全部输入信息及后续图形结果记录下来，生成可在 PDF、DOC 和 HTML 格式之间共享且可重复的报告。用户会话可被保存，并在将来重新加载；完整的结果也可下载并在用户本地计算机上通过 Bio3D R 软件包进行进一步分析与解读。
Bio3D-web 由 Bio3D R 软件包驱动，用于分析生物分子结构、序列及分子模拟数据8,16。特别是，Bio3D 中用于刚性核心识别 8、结构叠合、主成分分析（PCA） 8 和集合态正常模式分析（eNMA）16 的算法构成了该应用的基础。我们还采用了依赖 pHMMER 17 来识别相关蛋白质结构的 Bio3D 协议，以及利用 MUSCLE 18 进行多序列比对的协议。结构与序列注释通过 Bio3D 工具从 RCSB PDB 19 和 PFAM 数据库 20 获取。Bio3D-web 可在我们的在线服务器上运行，也可在任何安装了 R 的计算机上本地部署。Bio3D-web 向所有用户开放，并依据 GPL-3 开源许可证免费提供，访问地址为：http://thegrantlab.org/bio3d/webapps

<table><tbody><tr><td>Bio3D-web</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>网站</td><td>http://thegrantlab.org/bio3d-web/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>系统要求</td><td>网页浏览器</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用bio3d-web研究蛋白质序列-结构-动力学关系

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

我们展示了如何使用 Bio3D-web 进行生物分子结构数据的交互式分析。Bio3D-web 应用程序提供以下在线功能：（1）根据用户设定的相似性阈值，识别相关的蛋白质结构集合；（2）对这些结构进行多序列比对和结构叠合；（3）序列与结构保守性分析；（4）通过主成分分析绘制构象间关系图；以及（5）通过集合态正则模式分析比较预测的内部动力学特性。这一集成化功能为研究蛋白质家族及超家族中的序列-结构-动力学关系提供了完整的在线工作流程。

腺苷酸激酶（Adk）是一种普遍存在的酶，其功能是维持细胞质核苷酸之间的平衡，这对于许多细胞过程至关重要。Adk 通过催化 ATP 向 AMP 转移磷酸基团的可逆反应发挥作用。该反应伴随着已被深入研究的限速构象转变3,21。本文中，我们利用 Bio3D-web 分析所有目前可获得的 Adk 结构，以揭示这些关键转变的详细特征和作用机制。
我们可以通过输入任意已知Adk结构的RCSB PDB编号，开始在Bio3D-web中对Adk进行分析。例如，在“SEARCH”选项卡的A面板中输入PDB ID 1AKE，将返回167个序列相似的结构，其中排名前26的结构会被自动选中用于进一步分析（见B面板）。C面板中的注释信息显示，这些被选中的结构均来源于E. coli，通过X射线衍射法解析，属于多种不同的空间群，分辨率范围为1.63至2.8 Å，并与多种不同的配体共结晶（包括无配体、AMP、ADP、MG以及抑制剂AP5）。请注意，通过点击C面板中的“Show/Hide Columns”选项，可显示更多注释详情。
在进入 ALIGN 标签页后执行多序列比对。ALIGN 标签页的第一个面板显示比对结果的摘要，提供序列行数（等同于 PDB 结构的数量）以及位点数的详细信息即 比对列），包括含空位和不含空位列的数量说明。首行右侧的图示为序列比对的示意图，其中灰色区域代表无空位的位置，白色区域代表比对中的空位。比对上方展示了序列保守性，红色区域表示高度保守的位置，白色区域表示保守性较低。请注意，本图中的序列根据左侧聚类树状图所提供的相似性进行排序。该标签页的第二个面板进一步支持基于所选 PDB 结构之间的两两序列相似性进行聚类分析，结果可显示为树状图或热图。默认显示表示聚类排列的树状图（或称树形图），树状图的 y 轴表示聚类之间的距离（以序列一致性为度量）。
进入“FIT”选项卡后，结构叠合将自动执行。在面板A中交互式显示的叠合结构表明存在一个相对刚性的核心区域（包含残基1-29、68-117和161-214；详见FIT选项卡底部的“可选核心区域及RMSD细节”面板）。两个更具变异性的核苷酸结合区域（残基30-67和118-167）也清晰可见（图2）。基于RMSD的聚类分析将这些结构分为两种不同的构象。
点击PCA标签可更清晰地展示这些结构区域在空间位移上的关系，这些位移有效闭合了结合的核苷酸物种所在的区域（图2B和图2C）。大多数结构处于“闭合”构象（图2C中蓝色部分），并与结合的配体或抑制剂相关；相比之下，更“开放”的构象则不结合核苷酸和抑制剂。这与大量关于Adk结构与动力学的研究结果一致，表明这些区域的开放构型有利于核苷酸结合，而闭合构象则有利于高效的磷酸基团转移并抑制有害的水解反应。值得注意的是，在该Adk结构集中，仅第一个主成分（PC）就捕捉到了97%的总均方位移，清晰且有力地描述了从开放到闭合的构象转变过程，以及各个残基在这一功能位移中的贡献（应用程序的C面板及图2）。
访问 NMA 选项卡并增加用于计算的结构数量（通过降低过滤相似结构的截断值）表明，与闭合态结构相比，开放态结构表现出增强的局部和全局动力学特征（图 2D 及应用程序中的面板 C）。比较单个结构的 PCA 与 NMA 结果（面板 D）显示，所有开放态结构的第一模式与 PC1 具有相对较高的重叠度（平均值为 0.37 ± 0.04）；相比之下，闭合态结构的该值较低（平均值为 0.30 ± 0.01）。开放态结构的 RMSIP 值（0.62 ± 0.003）也高于闭合态结构（0.56 ± 0.008）。此外，重叠分析表明，开放态的第一模式与描述开放态和闭合态之间构象变化的模式具有良好一致性（面板 E）。基于 RMSIP 值的聚类分析再次显示出对开放态和闭合态结构的一致划分（面板 F）。
总体而言，这些结果表明腺苷酸激酶（Adk）存在两种主要的、截然不同的构象状态。这两种状态在核苷酸结合位点区域表现出不同的柔性，并且在核苷酸结合时发生集体的低频位移。
<img alt="蛋白质分析工作流程图，展示结构与比对的五步序列。" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1： Bio3D-web 概览，附 PCA 和 NMA 选项卡的屏幕截图。 Bio3D-web 在 SEARCH 选项卡中接收用户提供的蛋白质结构或序列作为输入（1）。服务器提供一组相关结构列表，可供用户选择以进行进一步分析（2）。ALIGN 选项卡提供对在 SEARCH 选项卡中选定结构的序列比对与分析（3）。在 FIT 选项卡中，所有结构被叠加并以 3D 形式可视化，同时显示传统两两结构分析的结果（4）。在 PCA 选项卡中对结构集合执行主成分分析，以表征构象间的关系（5）。在 eNMA 选项卡中可对每个结构进行正常模式分析，以探究可用结构状态的动态趋势。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55640/55640fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构分析；主成分分析图、波动图、构象比较图。" src="/files/ftp_upload/55640/55640fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 腺苷酸激酶的 Bio3D-web 分析结果。 （A）腺苷酸激酶的可用 PDB 结构叠加在已鉴定的不变核心上。结构根据“拟合”（FIT）选项卡中提供的基于 RMSD 的聚类结果进行着色。（B）“主成分分析”（PCA）选项卡可提供主成分的可视化，用于表征数据集中主要的构象变化。此处显示的是对应第一主成分的轨迹，以管状表示，展示蛋白质的大尺度闭合运动。（C）结构在构象图中投影到其前两个主成分上，展示构象可变性的低维表示。每个点（或结构）根据用户指定的标准着色，本例中为基于 PCA 的聚类结果。（D）“增强型正态模式分析”（eNMA）选项卡中的分析表明，与闭合态（蓝色）结构相比，开放态（红色）结构表现出增强的局部和全局动力学特性。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55640/55640fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用 Bio3D-web 在线研究蛋白质序列-结构-动力学关系的实验方案。

利用Bio3D-web研究蛋白质序列-结构-动力学关系

我们展示了 Bio3D-web 在生物分子结构数据交互式分析中的应用。Bio3D-web 应用程序提供在线功能……

Bio3D-web 的总体目标是实现对蛋白质家族序列、结构及构象多样性的交互式分析。Bio3D-web 是一款新的网络应用程序，有助于我们理解大型蛋白质家族中序列、结构与动力学之间的关系。Bio3D-web 的主要优势在于，它提供了无需用户具备任何编程背景即可进行的交互式、可重复的在线序列、结构和动力学分析。为了输入结构进行分析，可通过搜索蛋白质数据库获取腺苷酸激酶的 PDB ID。在输入结构或序列面板的文本框中输入腺苷酸激酶的四位字符 PDB ID，或粘贴蛋白质序列。单击第一个面板中的蓝色“下一个命中选择”按钮，或直接滚动至面板 B 的命中选择部分以进行进一步分析。确保将包含结构的总数上限滑块设置为其最大值，以包括所有高于截断值的结构。降低包含的比特分数（BitScore）截断值可纳入进化关系更远的匹配项，提高该值则可排除部分匹配。通过检查表格中的详细信息（如PDB名称、物种和结合配体），确保所选匹配项代表相关的结构。单击“比对”选项卡，对“搜索”选项卡中选定的结构进行序列比对。在分析亲缘关系较远的蛋白质时，尤其是当序列相似性低于30%时，可能会出现比对错误。务必在“比对”选项卡中仔细检查并校正序列比对结果。请在面板A的比对摘要中查看比对统计信息。确保目标区域已对齐，且未被一个或多个结构中的缺口所遮蔽。单击蓝色的“下一步分析”按钮，对收集的结构进行基于序列的聚类分析。然后，单击蓝色的“下一步保守性”按钮，计算列向的残基保守性。选择比对的结构集，以生成每个比对位置上残基保守性的图谱。进入拟合标签页执行结构叠加。通过目视检查，确保蛋白质结构已叠加到相应且相关的区域。点击并拖动鼠标以旋转结构，滚动鼠标滚轮可进行缩放。通过点击颜色选项来调整结构的着色方式。然后，点击蓝色的“下一步分析”按钮，对收集的 PDB 结构进行基于结构的聚类分析。在图表选项的下拉菜单中切换 RMSD 热图。点击蓝色的 nest RMSF 按钮，查看每个残基的结构变异性，X 轴边缘区域显示主要的二级结构元件。进入 PCA 选项卡以执行主成分分析。为了可视化主成分，请选中“显示主成分轨迹”复选框，以使用浏览器内置的可视化工具来观察由主成分描述的运动。请确保从第一个下拉菜单中选择主成分一。若要可视化其他主成分所描述的运动，可从“选择主成分”下拉菜单中选择所需的主成分。单击蓝色的“下一个图”按钮，将各个结构投影到选定的两个主成分（PC）上。确保X轴的PC设置为1，Y轴的PC设置为2。若要将结构投影到其他主成分上，请相应调整PC的编号。单击图中的任意单个点以标记相应结构。或者，可在图下方的主成分分析构象图注释表格中高亮显示一个或多个结构。单击蓝色的“下一个残基贡献”按钮，可计算各个主成分中残基的贡献。在“选择主成分”文本框中输入主成分编号，以绘制其他主成分的贡献。点击 eNMA 选项卡以启动正常模式分析的计算。通过降低或提高结构包含或排除的阈值，调整所包含结构的数量。单击绿色的“运行集合NMA”按钮，开始正常模式分析计算。向下滚动至eNMA标签页的第二个面板，即“正常模式可视化”面板，以查看正常模式的可视化结果。单击蓝色的“下一步：涨落”按钮，可计算用于集合正常模式分析的所选结构的残基级涨落。通过 RMSD 切换聚类，以基于 RMSD 的聚类结果为波动谱着色。勾选展开线条复选框，将分组后的波动谱相互分开绘制。然后，点击蓝色的“下一项：PCA 与 NMA 对比”按钮，计算各个简正模式与主成分之间的相似性。点击底部的蓝色“下一步”按钮，以生成包含分析结果、用户自定义输入和参数选择的报告。该报告可下载为可共享的 PDF、Word 和 HTML 格式。报告中还包含一个链接，可用于日后重新访问分析会话，该链接也可与合作者共享。此处显示的是腺苷酸激酶的可用PDB结构，已叠加于所鉴定的不变核心区域。结构根据“拟合”标签页中基于RMSD的聚类结果进行着色。“PCA”标签页可查看主成分分析结果，用于表征数据集中主要的构象变化。此处，以管状表示法显示了对应于第一主成分的轨迹，展示了蛋白质的大尺度闭合运动。在构象分布图中，结构被投影到其前两个主成分上，呈现出构象变异性的低维表示。每个点或结构根据用户指定的标准着色，在本例中为基于主成分分析（PCA）的聚类结果。在eNMA标签页中的正常模式分析表明，与闭合状态相比，开放状态的结构表现出增强的局部和全局动力学特性。Bio3D-web可用于探索序列和结构集合，并在数分钟内帮助理解目标蛋白家族的总体趋势。Bio3D-web已帮助我开展驱动蛋白超家族的结构分析。Bio3D-web 提供了一个完整的流程，用于全面定制化地研究序列-结构-动力学之间的关系。该流程提供了利用主成分分析（PCA）进行构象间关系映射的功能，并可通过系综弹性网络模型分析（ensemble NMA）对大量异源结构中的局部和全局动力学特征进行定量比较。预计大多数研究人员将使用 Bio3D-web 来理解其感兴趣蛋白家族中的普遍趋势，从而为后续的专门化分析提供依据。Bio3D-web 因此被设计为一种假设生成工具，可生成包含所有用户自定义参数的可共享摘要报告。Bio3D-web 的结果可下载，并且与 Bio3D-R 软件包完全兼容，便于进行更深入的分析。对于特定的蛋白质家族，目前已可获得大量结构，这些结构通常是在不同条件下测定的。对这些大量结构进行比较，可以揭示其功能所依赖的关键结构机制，例如配体结合、催化作用以及别构调节。Bio3D-web 具有广泛的可访问性，无需安装专用软件或学习新的编程语言即可轻松使用。Bio3D-web 支持所有主流浏览器。本地设置的完整源代码和安装说明可免费获取。

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科研

JoVE Journal

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生物化学

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