Name: 用于图像分析的时钟扫描协议:ImageJ插件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习使用ImageJ插件进行时钟扫描图像分析，快速表征选定感兴趣区域的平均像素强度。该方法适用于神经科学和组织切片分析，为研究人员提供高效的图像处理工具。

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我们感谢德国柏林分子药理学莱布尼茨研究所的Tanja Maritzen博士和Fabian Feutlinske博士与我们分享他们版本的Fuji ImageJ Clock Scan插件，并激励我们开发本版本程序。我们还感谢马克斯·普朗克感染生物学研究所淋巴细胞发育系的Fritz Melchers博士慷慨允许我们使用其部门数据库中的图像，用于测试和改进该插件。资助：转化神经科学中心；美国国立卫生研究院基金：P30-GM110702-03。

1. 软件安装
<ol>
	<li>根据各自网站上的建议，安装最新版本的捆绑 Java 以及 ImageJ 或 Fiji ImageJ（参见材料表中的相应网站链接）。在下文中，这两个程序均称为 &#34;ImageJ&#34;。</li>
	<li>使用材料表中提供的链接复制 &#34;Clock_Scan-1.0.1. jar&#34; 和 &#34;Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar&#34; 插件文件，并将其粘贴到 ImageJ 插件目录中。或者，在计算机硬盘上保存这些文件后，使用 &#34;Plugins | Install plugin&#34; 菜单选项安装这些文件。</li>
</ol>
2. 时钟扫描分析
<ol>
	<li>标准时钟扫描插件 (图1):
	<ol>
		<li>使用 ImageJ &#34;文件 | 打开&#34; 菜单命令以打开感兴趣的图像。</li>
		<li>单击“多边形”工具或“折线选择”工具，然后在图像上绘制，以勾勒出整个感兴趣区域（ROI）或该区域的一部分。参见 图1A 以多边形选择为例（内侧虚线轮廓）。 
		注意：软件中提供的其他选择工具（矩形、椭圆和手绘线条选择）也可使用。</li>
		<li>选择 &#34;插件 | 时钟扫描&#34; 从菜单中选择以打开标准时钟扫描协议的弹出选项窗口。请注意，此命令还将同时打开ROI管理器窗口，并自动添加轮廓。</li>
		<li>使用插件选项窗口执行以下操作。
		<ol>
			<li>通过滚动条或修改相应输入框中的数值，审阅并调整 ROI 中心的 X 和 Y 坐标（系统自动计算为物理质心坐标）。参见 图1B.</li>
			<li>根据扫描时需要覆盖物体外部背景区域的范围，通过使用以下方法调整扫描范围 &#34;扫描范围&#34; 滚动条。参见 图1A. 
			注意：扫描限值（scan limit）是指在任意给定方向上，扫描超出物体边界的分数值；默认值为1.20，表示扫描长度将在扫描方向上比物体半径长20%；参见 图1A，外侧虚线）。</li>
			<li>使用插件修改输出 &#34;实际半径&#34;, &#34;减去背景&#34;, &#34;极坐标变换&#34; 和/或 &#34;标准差图&#34; 复选框</li>
			<li>点击 &#34;好的&#34; 以运行该插件。参见 图1C-H. 
			注意：本方案输出结果的示例包括 &#34;标准差图&#34; 和 &#34;极坐标变换&#34; 或 &#34;实际半径&#34; 和 &#34;极坐标变换&#34; 已选选项显示在 图1C 和 1D 和 图1E 和 1F，分别。请注意，计算所得的标准差（SD）值表示对象各次径向像素强度扫描之间的变异情况。同时请注意 &#34;ROI 选择长度&#34; 插件窗口中的线条，显示以像素为单位测量的感兴趣区域（ROI）轮廓长度信息。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在生成的 &#34;时钟扫描轮廓图&#34;，使用 &#34;列表&#34; 用于绘制灰度图像数据中两列（X 和 Y）数值的命令，以及绘制 RGB 图像数据中一列 X 和四列 Y 的数值的命令，其中 Y0、Y1、Y2 和 Y3 列将分别填入整体积分及各个颜色通道（红、绿、蓝）的像素强度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多区域兴趣时钟扫描插件 - 用于处理多个区域兴趣（ROI）图2):
	<ol>
		<li>打开包含多个感兴趣区域（ROI）的图像。</li>
		<li>通过点击打开 ROI 管理器 &#34;分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器&#34;.</li>
		<li>依次勾画（参见步骤 2.1.2）每个 ROI，并通过点击将其添加到 ROI 管理器中 &#34;添加&#34; 在 ROI Manager 窗口中执行此操作；对图像中的所有 ROI 均进行相同处理。使用 &#34;分析｜测量&#34; 如果感兴趣的是感兴趣区域（ROI）的指标，请使用该命令。
		<ol>
			<li>参见 图2A 多段线选择示例 图2E 以查看多个多边形选择的示例。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择 &#34;多时钟扫描&#34; 在 &#34;插件&#34; 打开协议选项弹出窗口的菜单。</li>
		<li>使用协议选项窗口执行以下操作。
		<ol>
			<li>如有需要，按照步骤 2.1.4.2 重置扫描限值；默认值为 1.20。</li>
			<li>如有需要，可通过勾选选项来绘制带有标准差（SD）误差棒的平均时钟扫描曲线 &#34;标准差图&#34; 盒。参见 图2C 和 D. 
			注意：所计算的标准差（SD）值将表示不同对象的整体时钟扫描轮廓之间的变异。同时，注意插件窗口中显示信息的那条线 &#34;选定的 ROI 数量&#34;.</li>
			<li>点击 &#34;好的&#34; 执行该实验方案。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在生成的 &#34;时钟扫描轮廓图&#34;，使用 &#34;列表&#34; 绘制所显示数值的命令 &#34;绘图数值&#34; 窗口。参见 &#34;多时钟扫描轮廓图&#34; 按颜色通道标注柱状图的图例窗口。</li>
		<li>请注意，ROI 已编号，且针对任意给定颜色通道，其时钟扫描轮廓按照 ROI 被勾画并添加到图像中的顺序依次绘制。 &#34;ROI 管理器&#34;.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多区域时钟扫描插件——处理图像堆栈（图3):
	<ol>
		<li>打开感兴趣的图像堆栈。</li>
		<li>通过点击打开 ROI 管理器 &#34;分析 | 工具 | 感兴趣区域管理器&#34;.</li>
		<li>在图像堆栈中勾画出感兴趣区域（ROI），并按照步骤 2.1.2 和 2.2.3 中所述将其添加到 ROI 管理器中。使用 &#34;分析 | 测量&#34; 如果对 ROI 指标感兴趣，请使用该命令。</li>
		<li>选择 &#34;多时钟扫描&#34; 在 &#34;插件&#34; 打开协议选项弹出窗口的菜单。</li>
		<li>使用协议选项窗口执行以下操作。
		<ol>
			<li>按照步骤 2.1.4.2 中所述重置扫描范围；默认值为 1.20。</li>
			<li>选择“绘制标准差图”选项，以绘制带有标准差（SD）误差棒的平均时钟扫描曲线&#34; 盒子 
			注意：所计算的标准差（SD）值将表示图像堆栈中选定对象不同实例之间的变异情况。同时，请注意插件窗口中显示相关信息的行 &#34;图像堆栈中的图像数量&#34;.</li>
			<li>点击 &#34;好的&#34; 执行该实验方案。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 &#34;时钟扫描轮廓图&#34; 窗口，单击 &#34;列表&#34; 绘制所显示的数值 &#34;绘图数值&#34; 窗口中，Y 列编号表示图像在堆栈中的位置减 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).</li>
<li>Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stonin1+mediates+endocytosis+of+the+proteoglycan+NG2+and+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility.</a> Nat Commun. 6, 8535(2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniform+expression+of+alpha+subunit+isoforms+of+the+Na%2B%2FK%2B+pump+in+rat+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons.</a> Brain Res. 821, 212-217 (1999).</li>
<li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li>
<li>Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).</li>
<li>Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+decline+in+density+of+human+nerve+and+spinal+ganglia+neurons+expressing+the+alpha3+isoform+of+Na%2FK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase.</a> Neuroscience. 310, 342-353 (2015).</li>
<li>Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+selective+photoconductive+stimulation+of+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons.</a> Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).</li>
<li>Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4701926/">In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex.</a> Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).</li>
<li>Qiao, M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Method+for+Labeling+Electrically+Coupled+Cells%3A+Application+to+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina.</a> Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

时钟扫描方案： 时钟扫描法是一种快速且简单的图像分析工具。与现有的常见图像分析方法（如线性像素强度扫描或感兴趣区域（ROI）的平均像素强度计算）相比，该方法的优势已在先前的出版物中得到详细描述。1,9简而言之，该方案通过量化位于感兴趣区域（ROI）中心不同距离处的像素强度（例如物体边界，或物体外预设位置（背景））来生成完整的径向像素强度分布曲线。由于可对每个ROI的“时钟扫描”（clock scan）曲线进行即时背景校正，因此在生物学应用中，该方法对样本内或样本间标记/染色的不均匀性，以及显微镜光源强度或荧光曝光时间的不稳定性具有较低的依赖性。时钟扫描曲线对物体大小和形状的独立性进一步拓展了该方案的应用范围，使其能够用于不同物体之间的比较，并可通过逐点减去背景曲线的方式进行校正。 &#34;阳性&#34; 和 &#34;阴性&#34; 对照物体
时钟扫描插件： 分发和共享原始方案的主要限制在于其代码...

本研究的目的是提供一种无平台依赖且可自由获取的钟形扫描（Clock Scan）方案，供所有对此类图像分析感兴趣的科研人员使用。钟形扫描方案最初于2006年开发1，旨在改进在凸形感兴趣区域（ROI）内进行像素强度定量的现有方法，该方法具有更强的整合能力以及更高的空间分辨率。在采集过程中，该方案依次收集多条从ROI中心至其边界，或至ROI外预设距离处的径向像素强度分布，以测量位于感兴趣区域外的&#34;背景&#34;像素强度。该方案根据扫描方向上测得的细胞半径对这些分布进行缩放，因此每条径向扫描从中心到ROI边界的距离在X轴上始终为100%。最后，程序将这些单独的分布平均为一条综合的径向像素强度分布曲线。由于进行了缩放处理，由&#34;Clock Scan&#34;方案生成的平均像素强度分布曲线既不受ROI尺寸影响，也在合理范围内不受ROI形状的影响。该方法允许直接比较不同ROI的分布曲线，或在需要时进行平均或相减操作。此外，该方案还允许通过简单减去位于对象外部像素的平均强度，对任意对象的综合像素强度分布进行背景噪声校正。尽管目前仅在生物样本中进行了测试，但本方案为研究围绕某一起始点组织的物理或化学过程图像（例如物质从点源扩散）所使用的其他现有图像分析工具提供了有价值的补充1。
然而，原始图像分析方法的主要局限性在于该方案是基于 Visual Basic 6 (VB6) 编写的（代码），因此具有平台依赖性，且分发困难（需要 VB6 环境）。为解决这一问题，并响应其他研究者近期开展的类似工作2，我们将 VB6 版本的 Clock Scan 程序代码转换为两个基于 Java 的插件，可兼容由美国国立卫生研究院（NIH）支持的、免费开源且跨平台的图像分析软件 ImageJ3 和 Fiji ImageJ4。此外，这些插件还新增了多项功能，扩展了原始方案处理多个感兴趣区域（ROI）和图像堆栈的能力。许多图像分析应用在对多个对象进行统计分析时并不友好，因此通常仅展示代表性数据。借助多对象 Clock Scan ImageJ 插件，可实现对多个对象的同步分析。现在利用该插件扩展，即可对显微图像数据进行可靠的统计评估，特别是针对单个细胞/对象内信号强度分布的分析。本文将介绍 Clock Scan 插件，并展示其在图像分析中的应用实例。

<table><tbody><tr><td>计算机</td><td>任意</td><td></td><td>与下文所列软件兼容</td></tr><tr><td>ImageJ 或 Fiji ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/ 或 https://fiji.sc/</td><td>需捆绑 Java 1.8 或更高版本</td></tr><tr><td>Clock-scan 插件</td><td>免费软件</td><td>https://sourceforge.net/projects/clockscan/</td><td>Clock_Scan-1.0.1 jar 和 Multi_Clock_Scan-1.0.1/jar</td></tr><tr><td>Origin 9.0</td><td>OriginLab</td><td>Northampton, MA, USA</td><td>本程序用于生成原始 Clock Scan 数据的部分图表。其他任意图形软件也可用于实现此功能</td></tr></tbody></table>

用于图像分析的时钟扫描方案：imagej 插件

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

用于图像分析的时钟扫描协议是一种高效工具，可量化封闭或分割的凸形感兴趣区域内部、边界处以及外部（背景）的平均像素强度，从而生成平均积分径向像素强度分布曲线。该协议最初于2006年以Visual Basic 6脚本形式开发，但由于其形式所限，传播范围较小。为解决此问题，并响应其他研究者近年来的类似努力，我们将原始的时钟扫描协议代码转换为两个基于Java的插件，可兼容由NIH支持且免费提供的图像分析软件，如ImageJ或Fiji ImageJ。此外，这些插件还新增了多项功能，进一步扩展了原始协议的功能范围，例如可对多个感兴趣区域和图像堆栈进行分析。程序的后一特性在需要确定与时间和空间相关变化的应用中尤为有用。因此，对生物图像堆栈进行时钟扫描分析，可能适用于研究单个细胞内Na+或Ca++的扩散过程，也可用于分析突触连接或间隙连接细胞群体中的扩散性活动（例如，Ca++波）。本文中，我们描述了这些新的时钟扫描插件，并展示了其在图像分析中的一些应用实例。

本文用于说明目的的图像来自我们先前的细胞和组织生物学研究中创建的数据库5,6,7，以及来自艾伦小鼠脑图谱数据库8。这两个插件已在 ImageJ 1.50i/Java 1.8.0_77、ImageJ 2.0.0-rc-44/1.50e/Java 1.8.9_66 和 Fiji ImageJ 2.0.0-rc54/1.51g/Java 1.8.0_66 程序环境中成功测试。
图1展示了使用标准 Clock Scan 插件进行图像分析的代表性结果。对于这两个插件，时钟扫描程序的基本代码和主要步骤与原始方案中描述的基本相同1</sup...

本文介绍了两种用于“时钟扫描”图像分析的新型 ImageJ 插件。这些插件扩展了原始 Visual Basic 6 程序的功能，更重要的是，通过将其集成到免费的图像分析软件包 ImageJ 中，使该程序能够被广大的科研群体所使用。

用于图像分析的时钟扫描方案：ImageJ 插件

时钟扫描图像分析协议是一种用于量化目标区域内、边界处及外部（背景）平均像素强度的高效工具……

这些时钟扫描方案的总体目标是快速表征选定感兴趣区域内部、边界沿线和/或外部的平均像素强度。该方法有助于解答关键问题，并指导图像分析人员了解特定感兴趣区域内的平均像素强度。此处时钟扫描技术的主要优势在于，可快速表征单个或多个感兴趣区域内来自轨道的平均像素强度。对于标准的时钟扫描分析，在适当的 ImageJ 程序中，点击“文件”菜单，选择“打开”以打开感兴趣的图像文件。例如，此处将分析一张神经元标记了目标蛋白的组织切片。选择合适的绘图工具，并勾画出感兴趣区域。从“文件”菜单中选择“插件”和“时钟扫描”，以打开标准的时钟扫描协议弹出选项窗口。兴趣区域管理器窗口也将同时打开，并自动添加轮廓。在插件选项窗口中，根据需要使用滚动条调整兴趣区域中心的 x 和 y 坐标。根据扫描范围需要覆盖物体外部背景区域的程度，使用扫描限制滚动条来调整扫描边界。根据实验需求，选择实际半径、减去背景、极坐标变换和/或带标准差的绘图选项。然后，单击“确定”以运行插件。分析完成后，使用列表命令访问数值数据以进行进一步分析。对于多个区域的时钟扫描分析，请打开包含多个感兴趣区域的图像文件。例如，此处将分析在同一组织切片内采集的一组图像帧，如刚才所示。单击“分析”，然后选择“工具”，再选择“感兴趣区域管理器”，使用适当的绘图工具勾勒出每个感兴趣区域。断续线工具适用于选择不对称的感兴趣区域以及排除背景标记。在“感兴趣区域管理器”窗口中单击“添加”，以将每个选定的感兴趣区域添加至管理器中。在“插件”菜单中，选择“多时钟扫描”以打开协议选项弹出窗口，并根据需要重置扫描限制。根据实验需求，勾选标准差绘图和/或减去背景选项。然后，点击“确定”运行协议，系统将生成两个输出绘图窗口。对于图像堆栈的时钟扫描分析，打开感兴趣的图像堆栈。此处将分析一个分离的背根神经节的图像堆栈，该样本经钙离子敏感型荧光染料标记，并在细胞内电极刺激前后进行了成像。在图像堆栈中标注出感兴趣的区域。将选定的图像序列添加到兴趣区域管理器中（方法如前所述），然后选择多时钟扫描以打开协议选项弹窗。根据需要重置扫描范围，并根据实验需求勾选显示标准差的曲线图和/或减去背景区域框。随后，点击“确定”运行该协议，生成两个输出曲线图窗口。在此对荧光标记神经元组织切片的代表性分析中，通过目标蛋白强信号区域绘制了一个感兴趣区域，并进行了标准的钟形扫描分析，以收集从该区域中心至扫描边界范围内的径向像素强度扫描数据。径向扫描结果沿扫描方向被归一化至感兴趣区域的半径长度。通过计算平均值生成积分径向像素强度分布曲线，结果显示大部分目标蛋白定位于细胞的质膜上。由于本分析选择了带标准差的图，垂直的标准差线表示在距扫描原点给定距离处，各个径向扫描轮廓的像素强度之间的差异。在本分析中，如刚才所示，对神经组织样本内的多个感兴趣区域进行了扫描，从而为按顺序添加到感兴趣区域管理器中的每个扫描对象生成了积分像素强度轮廓，以及为每个选定的感兴趣区域生成了平均像素强度轮廓。因此，这些标准差条形图代表了不同图像中单个目标对象整体扫描之间的变异性，而非单次径向扫描的变异性。此处对一个分离的背根神经节神经元在刺激前后通过细胞内电极记录的不同时间点所采集的图像序列进行了图像堆栈分析。分析结束时，展示了该目标对象在堆栈中不同图像上的各个实例的整体像素强度分布曲线，以及所有实例的平均像素强度分布曲线。此外，对时钟扫描图像序列进行标准差分析，可展示整幅图像序列中各次积分扫描之间的数据变异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用时钟扫描插件测量像素强度。我们开发这些插件的目的是让所有研究人员都能免费使用此类图像分析方法。我们认为，时钟扫描协议将应用于多个研究领域，包括但不限于生物、化学和物理成像应用。随着我们持续开发和运行这些时钟扫描插件，我们非常欢迎各方就如何改进这些工具提出反馈意见和建议。

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