用于图像分析的时钟扫描方案：ImageJ 插件

这些时钟扫描方案的总体目标是快速表征选定感兴趣区域内部、边界沿线和/或外部的平均像素强度。该方法有助于解答关键问题，并指导图像分析人员了解特定感兴趣区域内的平均像素强度。此处时钟扫描技术的主要优势在于，可快速表征单个或多个感兴趣区域内来自轨道的平均像素强度。

对于标准的时钟扫描分析，在适当的 ImageJ 程序中，点击“文件”菜单，选择“打开”以打开感兴趣的图像文件。例如，此处将分析一张神经元标记了目标蛋白的组织切片。选择合适的绘图工具，并勾画出感兴趣区域。

从“文件”菜单中选择“插件”和“时钟扫描”，以打开标准的时钟扫描协议弹出选项窗口。兴趣区域管理器窗口也将同时打开，并自动添加轮廓。在插件选项窗口中，根据需要使用滚动条调整兴趣区域中心的 x 和 y 坐标。

根据扫描范围需要覆盖物体外部背景区域的程度，使用扫描限制滚动条来调整扫描边界。根据实验需求，选择实际半径、减去背景、极坐标变换和/或带标准差的绘图选项。然后，单击“确定”以运行插件。

分析完成后，使用列表命令访问数值数据以进行进一步分析。对于多个区域的时钟扫描分析，请打开包含多个感兴趣区域的图像文件。例如，此处将分析在同一组织切片内采集的一组图像帧，如刚才所示。

单击“分析”，然后选择“工具”，再选择“感兴趣区域管理器”，使用适当的绘图工具勾勒出每个感兴趣区域。断续线工具适用于选择不对称的感兴趣区域以及排除背景标记。在“感兴趣区域管理器”窗口中单击“添加”，以将每个选定的感兴趣区域添加至管理器中。

在“插件”菜单中，选择“多时钟扫描”以打开协议选项弹出窗口，并根据需要重置扫描限制。根据实验需求，勾选标准差绘图和/或减去背景选项。然后，点击“确定”运行协议，系统将生成两个输出绘图窗口。

对于图像堆栈的时钟扫描分析，打开感兴趣的图像堆栈。此处将分析一个分离的背根神经节的图像堆栈，该样本经钙离子敏感型荧光染料标记，并在细胞内电极刺激前后进行了成像。在图像堆栈中标注出感兴趣的区域。

将选定的图像序列添加到兴趣区域管理器中（方法如前所述），然后选择多时钟扫描以打开协议选项弹窗。根据需要重置扫描范围，并根据实验需求勾选显示标准差的曲线图和/或减去背景区域框。随后，点击“确定”运行该协议，生成两个输出曲线图窗口。

在此对荧光标记神经元组织切片的代表性分析中，通过目标蛋白强信号区域绘制了一个感兴趣区域，并进行了标准的钟形扫描分析，以收集从该区域中心至扫描边界范围内的径向像素强度扫描数据。径向扫描结果沿扫描方向被归一化至感兴趣区域的半径长度。通过计算平均值生成积分径向像素强度分布曲线，结果显示大部分目标蛋白定位于细胞的质膜上。

由于本分析选择了带标准差的图，垂直的标准差线表示在距扫描原点给定距离处，各个径向扫描轮廓的像素强度之间的差异。在本分析中，如刚才所示，对神经组织样本内的多个感兴趣区域进行了扫描，从而为按顺序添加到感兴趣区域管理器中的每个扫描对象生成了积分像素强度轮廓，以及为每个选定的感兴趣区域生成了平均像素强度轮廓。

因此，这些标准差条形图代表了不同图像中单个目标对象整体扫描之间的变异性，而非单次径向扫描的变异性。此处对一个分离的背根神经节神经元在刺激前后通过细胞内电极记录的不同时间点所采集的图像序列进行了图像堆栈分析。分析结束时，展示了该目标对象在堆栈中不同图像上的各个实例的整体像素强度分布曲线，以及所有实例的平均像素强度分布曲线。

此外，对时钟扫描图像序列进行标准差分析，可展示整幅图像序列中各次积分扫描之间的数据变异性。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用时钟扫描插件测量像素强度。我们开发这些插件的目的是让所有研究人员都能免费使用此类图像分析方法。

我们认为，时钟扫描协议将应用于多个研究领域，包括但不限于生物、化学和物理成像应用。随着我们持续开发和运行这些时钟扫描插件，我们非常欢迎各方就如何改进这些工具提出反馈意见和建议。