自动定量分析细胞计数程序使用ImageJ插件

该方案的总体目标是使用数字分析工具快速对悬浮液中或侵袭测定膜中迁移的细胞进行准确计数。该方案可以帮助研究人员量化常用技术和体外细胞运动测定所需的细胞数量。这种方法的主要优点是它提供快速准确的细胞计数，同时包括多个过滤器和分析工具。

首先，将显微镜照明度设置为最大。切换到 4 倍物镜并确保使用相差滤光片。然后，在显微镜软件中，将图像捕获设置设置为默认值。

现在将标准血细胞计数器放在显微镜载物台上，并捕获图像以进行图像体积校准步骤。根据需要调整曝光时间。在 ImageJ 中，在细胞浓度计算器下，打开图像并单击 Get Image Dimension 按钮。

此作使用图像分辨率（以像素为单位）填充图像宽度和高度文本框。接下来，选择直线工具，然后单击并拖动光标，在血细胞计数器主 p 方的整个长度上绘制一条直线。然后，按下 M 键以显示结果窗口。

现在，在细胞浓度计算器的 p 平方长度文本框中键入 length 列中的值。然后，点击 计算图像体积 按钮将图像体积输出到图像体积文本框中。最后，点击 Save 按钮完成插件的校准。

对于样品分析，将 10 微升细胞加载到血细胞计数器载玻片的两个腔室中，并调整焦点，使细胞内部比细胞膜更暗，从而在细胞的中心横截面内而不是在两极提供焦点。然后，进一步调整曝光度，使细胞不会曝光过度。略微可见的血球计数板线是可以接受的。

现在，捕获血细胞计数器中心区域的 5 到 10 张不重叠的图像。每个图像的分辨率和放大倍数必须与体积校准图像的分辨率和放大倍数相同。接下来，在细胞浓度计算器中，单击"计数细胞"，然后在弹出窗口中选择要计数的文件夹。

接下来，在样品编号输入框中，输入每个腔室拍摄的图像数量，然后单击 OK（确定）。该插件现在将收集数据。有关更多详细信息，请参阅文本。首先，在显微镜软件中，将图像捕获设置设置为默认值。

对于解剖镜的舞台，使用纯白色背景并使用舞台上方的光源，最好是两个灵活的 LED 灯。现在，将完成的迁移测定膜载玻片放在载物台上。查看软件显示的实时图像，手动调整放大倍率，使单个膜的边缘刚好在相机的视野内。

然后，调整光源位置和曝光时间，以尽可能接近地再现理想的图像。它具有最少的背景颜色和均匀照明的膜。细胞计数的准确性取决于高质量的图像采集。

最有效地使用插件，捕获用户相机所能实现的最佳图像非常重要。现在，在显微镜软件中取出载玻片并对图像进行白平衡以完成校准。在成像之前，通过对盖玻片施加压力来压平每个膜，以去除尽可能多的滞留气泡。

现在，在软件中，设置捕获文件夹位置。然后，每个膜捕获一个图像，使用样品 001 的命名约定将图像文件保存为 TIF，并逐渐增加每个图像的数量。插件需要此命名约定才能查找文件。

如果需要平场校正，请为每张幻灯片找到一个空白区域并拍摄一张空白图像。将文件另存为样品名称为空。接下来，在 ImageJ 中，打开 TC 插件。

在 TC 中，单击 Flatfield 按钮，然后从 Choose Directory 对话框中选择保存膜图像的文件夹。现在，打开迁移检测膜图像并选择 Color Threshold。在窗口中，将方法设置为 Shanbhag。

将阈值颜色设置为白色。将色彩空间设置为 RGB 并取消选中深色背景选项。接下来，将顶部滑块调整为 0，将底部滑块调整为 255，以使图像完全白色。

变白后，调整绿色和红色滑块，直到只有细胞核可见。在 TC 插件中，将 RGB 滑块的值复制到关联的配置设置 RGB 阈值文本框中。然后，单击 Add/Modify 按钮并覆盖配置。

在配置设置面板中，单击 Save 将设置写入硬盘驱动器。现在，要使用 TC 插件对图像进行计数，请单击 Count Folder 并选择要计数的文件夹。然后，程序将处理图像并自动将数据添加到主表中。

现在，在主表中，校准？列（如果图像中）根据其与理想量度的相似性标记为需要校准。选择所有标记为校准的样品。

然后，右键单击并选择 Recount 和 Suggested Size （建议大小）。这将重新计算具有建议的最小粒子面积的图像。然后，再次右键单击并选择 Show Plot。

理想的图像将具有类似于长右尾正态分布的图形。如果需要，通过选择样本，右键单击并选择 Recount 和 Manual Settings（重新计数）和 Manual Settings（手动设置）来调整较低的大小范围或 RGB 阈值设置。然后，输入所需的设置并单击 Count 重新计算图像。

要手动调整计数，请选择样本，右键单击表，然后选择 Open image with counts。原始图像将打开，并带有红色标记，这些标记表示插件计数的每个粒子。此外，Show counted binary image 选项可用于检查颜色阈值对单个单元格的解析程度。

要手动添加计数，请按住 Ctrl 键并左键单击。这将在光标位置添加一个标记，该标记将添加到总计数中。要手动删除标记，请右键单击图像，插件将删除最靠近光标的标记。

要删除一组标记，请选择一个感兴趣的区域，然后在按住 Ctrl 键的同时右键单击该区域。细胞浓度计算器的过程取决于 p 方校准图像以及 p 方长度和像素的计算。血球计数器的 p 方体积为 100 纳升，给定此常数，可以在将像素转换为毫米后计算出总图像体积。

对来自不同实验和细胞类型的 57 张图像进行手动和自动计数的比较表明，两种方法之间存在非常紧密的相关性。使用自动化过程准确计数每毫升 500 万至 2， 000 个细胞的浓度。指标 Q 表示基于不同粒径分布的整体图像清晰度。

适当的 Q 大于 0.5。将这些限定符应用于亮度和背景噪声方面适中到优秀的图像选择，校准的图像计数明显更接近手动计数，而不是未校准的图像计数。观看此视频后，您应该对如何使用 CCC 和 TC ImageJ 插件准确有效地对悬浮液中的细胞和细胞运动检测进行计数有很好的了解。

一旦掌握了 TC 插件，就可以在一小时内完成细胞计数的采集、定量和调整。这两个插件都依赖于 ImageJ 的粒子计数功能，可以通过编辑 ImageJ 使用的宏来修改。这为用户提供了更大的灵活性，可以将插件的范围扩展到其他粒子。