应用 ImageJ 对免疫组化制备组织显微照片小胶质细胞形态学的定量研究

这些骨骼和分形分析方法的总体目标是使用 IHC 制备的组织测量小胶质细胞形态，使用本质上既高通量又对检测细胞形状的微小差异敏感的定量方法。这种方法可以通过定义健康和疾病期间小胶质细胞形式和功能的细微差别来帮助回答神经炎领域的关键问题。该技术的主要优点是它使用连续变量而不是分类变量来量化小胶质细胞形态。

此处描述的方法不需要专有软件，可用于筛选脑区或逐个细胞分析。演示该程序的是我实验室的技术人员 Kimberly Young。在开始之前，请确保 AnalayzeSkeleton 插件已下载到 ImageJ 或 Fiji。

然后打开一个 30 微米的 Z 堆栈，显示 Iba1 免疫染色的大脑。如果使用荧光显微照片，请确保图像为 8 位，并转换为灰度以最好地显示所有阳性染色。使用工具栏并单击 Image （图像）、Lookup Tables （查找表）、Grays （灰色）。

如果使用 DAB 明场照片，请首先使用具有默认设置的 FFT 带通滤波器插件。单击 Process（处理）、FFT（FFT）、Bandpass Filter（带通滤波器），然后转换为 Gray scale（转换为灰度）。如果图像太暗而无法可视化小胶质细胞的过程，请使用工具栏并单击 Image（图像）、Adjust（调整）、Brightness/Contrast（亮度/对比度）。

根据需要调整最小或最大滑块，直到直方图的边缘，但不能再进一步调整。调整亮度在数据分析中产生的可变性最大，因此是最关键的一步。接下来，通过单击"处理"、"滤镜"、"钝化蒙版"来运行"钝化蒙版"滤镜以进一步提高对比度。

执行去斑步骤以去除由钝化蒙版生成的盐和胡椒杂色。使用工具栏并单击 Process、Noise 和 Despeckle。通过选择 Image （图像）、Adjust （调整）、Threshold （阈值） 将图像转换为二进制。

然后将 Despeckle 函数应用于二进制图像，以去除任何剩余的单个像素杂色。然后，通过单击 Process、Binary、Close 来应用 Close 函数，以连接最多由两个像素分隔的暗像素。接下来，通过单击 Process （处理）、Noise （噪声）、Remove Outliers （删除离群值） 来删除离群值。

将图像保存为单独的文件以备将来使用后，通过单击工具栏，单击 Process、Binary、Skeletonize 来简化图像。选择骨架化图像，然后通过单击 Plugins、Skeleton、Analyze Skeleton 并选中分支信息框来运行 AnalyzeSkeleton 插件。从结果和分支信息输出中复制数据，然后将数据粘贴到 Excel 电子表格中。

在 Excel 中，修剪数据以删除 IHC 和图像采集产生的骨架片段。通过在 ImageJ 中打开骨架化图像并选择线条工具，确定将从数据集中修剪多少长度的片段。测量多个片段，记下平均长度，并确定一个截止值，该值应在整个数据集中保持一致。

通过单击 Sort and Filter （排序和筛选）、Custom Sort （自定义排序） 对 Excel 电子表格进行自定义排序。按终端节点体素从最大到最小排序，并在新级别按 Mx 分支 PT 从最大到最小排序。删除包含两个最大分支长度小于截止值的终端节点的每一行。

对 endpoints （终端节点） 列中的数据求和，以计算从映像中收集的终端节点总数。按分支长度排序后，对分支信息数据重复此作。修剪和汇总所有数据后，将每个图像中的数据除以相应图像中小胶质细胞胞体的数量。

将每个细胞数据的最终终点以及细胞和分支长度输入统计软件。确保已下载 FracLac 插件。然后使用矩形工具绘制 ROI。

确保框足够大以捕获整个单元格，并且可以在整个数据集中保持一致。在 ROI 管理器窗口中，选择更新以将 ROI 锁定到显微照片中随机选择的单元格上。打开包含所选单元格的二进制图像。

双击 Paintbrush 工具，将颜色设置为黑色，然后根据需要调整画笔宽度。使用匹配的显微照片作为参考，使用 Paintbrush 去除相邻的细胞过程，连接碎片化的过程，并分离感兴趣的细胞。隔离二进制单元后，保存二进制文件。

使用工具栏通过 Process、Binary、Outline 将二进制单元格转换为轮廓。在工具栏中，使用工具栏打开 FracLac，方法是单击 Plugins、Fractal Analysis、FracLac，然后选择 BC 进行框计数。在 Grid Design 中，将 Num G 设置为 4。

在 Graphics Options （图形选项） 下，选中度量框以分析单元的凸包和边界圆。完成后，选择 Okay （确定），然后选择 Scan （扫描） 按钮以对所选图像运行框计数扫描。在 Hull and Circle Results （外壳和圆形结果） 窗口中，复制所有需要的数据结果。

然后在 Box Count Summary （框数摘要） 窗口中执行相同的作。将复制的数据传输到 Excel 文件或统计软件。该图显示了未受伤和受伤皮质组织中每个细胞的小胶质细胞终点和每个细胞的处理长度的汇总数据。

这是应用方案的分析结果。在这两种情况下，都使用 Students T 检验进行统计分析，并分析 3 张图像。必须注意协议应用中的用户间差异。

此处总结了这些差异，其中两个独立用户应用相同的协议分析了相同的数据集。尽管整个趋势相似，但用户间的可变性会影响数据的显著性。在尝试此过程时，请务必记住，目标是获得代表原始显微照片的骨架或轮廓模型。

这意味着这些步骤可以根据研究者的特定需求进行修改。观看本视频后，您应该对如何使用现成的计算机软件从免疫组织化学组织的显微照片中快速定量小胶质细胞形态有了很好的了解。