解剖学启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建，调制和建模
May 31st, 2017
该手稿详细描述了微组织工程神经网络的制造:三维微米大小的构建体，包括跨越聚集的神经元群体的长比例的轴突区域，其包裹在管状水凝胶中。这些生活支架可以作为功能性继电器来重建或调节神经回路，或者作为模拟灰白色神经解剖学的生物学检验床。
该协议描述了微组织工程神经网络或微 TENN 的制造，微 TENN 是微型三维结构，由长对齐的轴突束组成，跨越管状水凝胶腔内的离散神经元群。Micro-TENN 复制了大脑连接组的一般系统水平解剖结构，具体来说，由长轴突束连接的功能相似的神经元组。因为它们是预先生长的以模拟脑通路的细胞结构，所以 micro-TENN 可用于靶向重建因创伤或神经退行性疾病而丢失的神经回路，并作为神经生物学研究的生物交织模型。
该协议最具挑战性的方面之一是使用微米级的外形尺寸，这对于允许微创输送到大脑最终是必需的。首先手动将玻璃毛细管掰成 2 至 2.5 厘米的碎片，然后将一根针灸针插入每个碎片中。将 DPBS 中的 1 毫升 3% 琼脂糖转移到空培养皿的表面。
将毛细管固定在引入的针头中，将管的一端与液体琼脂糖池接触，以通过毛细管作用填充它。当液体停止上升时，从池中取出毛细管，并将其水平放置在培养皿的表面上。接下来，将拇指和食指放在管子的两侧并紧紧抓住。
用另一只手快速拉出针头，同时用拇指和食指防止微柱本身从管中滑出。然后将 30 号针头插入毛细管中，将微柱缓慢推出到含有 DPBS 的培养皿中。使用细镊子小心地将一根微柱从 DPBS 转移到空培养皿中。
用微量移液管将 10 μL DPBS 添加到微量柱顶部以防止干燥。在立体显微镜下工作时，用微型手术刀将微柱绊倒，将其缩短到所需的长度。然后使用细镊子将修剪的微柱转移到含有 DBPS 的不同培养皿中。
在紫外光下对含 DPBS 的培养皿中的微柱消毒 30 分钟。用钻头在 10 厘米培养皿的盖子上以 4 厘米 4 x 4 的阵列方式刺出 16 个孔，间隔 1 厘米。在化学通风橱内，使用培养皿的底部称量 27 克 PDMS 和 3 克固化剂。
用微刮刀搅拌，使试剂均匀分布。然后用刺破的盖子盖住 PDMS 固化剂。将软管的一端连接到通风橱的真空端口，然后将另一端插入适当大小的漏斗的杆中。
将 1 毫升移液器吸头上的 1 毫升移液器吸头放入软管中，然后向上拉软管，直到吸球将软管密封到漏斗的杆中。接下来，将漏斗放在刺破的培养皿盖上，并用可用的坚固支架固定软管。打开真空阀 5 分钟以吸取气泡并将气泡带到表面。
五分钟后，关闭阀门，取下漏斗，将培养皿与通风橱表面敲打几次，以爆破任何残留的气泡。将金字塔形孔 3D 打印模具放入 12 孔培养板中的每个孔中，金字塔朝上。然后将 PDMS 固化剂倒在模具顶部，直到板的每个孔都填满。
将带盖的板子转移到 60 摄氏度的烤箱中 1 小时晾干。通过高压灭菌对 PDMS 阵列进行灭菌并在生物安全柜中工作后，将一个微孔阵列插入无菌 12 孔板的每个孔中。为了形成神经元聚集体，使用微量移液管将 12 μL 细胞悬液添加到 PDMS 阵列的每个微孔中。
将板以 200 x g 离心 5 分钟，以迫使细胞聚集在微孔底部。然后小心地将大约 2 毫升的培养基添加到每个 PDMS 阵列的顶部，以覆盖所有接种的微孔。将板在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育 12 至 24 小时。
要开始 CEM 核心制备，请将 1 型胶原蛋白、层粘连蛋白和培养基混合在微量离心管中，并将 pH 值调节至 7.2 至 7.4。然后将含有 CEM 的试管置于冰上。使用无菌镊子转移微柱以清空 35 或 60 毫米的培养皿。
然后，在立体显微镜下工作时，使用连接到 1000 微升尖端的 10 微升尖端从管腔中提取残留的 DPBS 和气泡。在微量移液器中快速吸取 4 至 5 μL CEM，然后将微量移液器的尖端放在微量移液器的一端，并排出足够的 CEM 以填充管腔。为防止脱水，请在每个微柱周围添加 2 μL CEM。
将水凝胶 CEM 微柱置于培养皿中，在 37 °C 的 5% 二氧化碳中孵育 15 分钟。孵育后立即进行细胞接种。将大约 10 至 20 μL 的培养基转移到装有微柱的培养皿中的两个自由区域。
使用微量移液器单独收集神经元聚集体，并将它们转移到含有构建体的培养皿中。用镊子将聚集体移动到一个小培养基池中，以保持细胞健康。在立体显微镜下观察时，使用镊子在微柱的一端插入聚集体（用于单向微 TEN），或在两端插入聚集体（用于双向架构）。
然后将接种的微柱移动到另一个小培养基池中，以避免脱水并保持聚集体健康。加载完所有微柱后，在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳中孵育 45 分钟，以使聚集体粘附在 CEM 上。孵育后，使用立体显微镜验证聚集体是否保留在微柱的末端。
最后，使用移液管小心地用培养基淹没含有 micro-TENNs 的培养皿。将培养皿置于 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中进行长期培养。这些相差图像显示了单向 2 毫升长的微 TENNs，可在体外长达 8 天。
在这些图像中，请注意微柱末端的神经元聚集体，而对齐的轴突束投射到管腔中。如图所示，轴突束在体外几乎延伸了微柱的整个长度 5 天。对于 5 毫米双向微 TEN，轴突束在体外 5 天时填充微柱的长度，并且这种结构至少在体外保持 10 天。
以下两个图像可帮助解决该过程的问题。该图显示了在制造过程中完全去除和/或蒸发 DPBS、CEM 或培养基后完全脱水的干燥水凝胶微柱。这张图片显示了一个微柱，由于针灸针与毛细管没有同心对准，管腔内衬在外壁。
最后，该共聚焦图像显示了体外 28 天的双向微 TENN，用蓝色的 Hoechst 对细胞核进行染色，用红色的 tudge One 标记的轴突，用绿色的突触蛋白 1 标记突触前钮扣。如图所示，在突触前末梢存在的情况下可以看到细胞沿轴突束聚集体的迁移。Micro-TENNs 是自包含的、受解剖学启发的构建体，可模拟连接组细胞结构的关键方面;因此，micro-TENNs 可能提供了一种在植入大脑后替代丢失的神经通路的方法。
该方法的关键组成部分包括允许纵向轴突生长的管状生物材料包裹方案，以及确保获得仅限于沿内部轴突束末端的细胞体的正确细胞结构的聚集体。在掌握了这些方法之后，根据具体应用，该技术的原理可用于构建具有其他细胞表型和生物材料成分的微 TENN。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本手稿详细介绍了微组织工程神经网络（微-TENN）的制造，这是一种在水凝胶中具有排列整齐的轴突束和集合神经元群的三维构造。这些活体支架可以重建或调节神经回路，并可用作神经生物学研究的模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 组织工程
- 神经生物学
背景
- 微-TENN复制了大脑连接组解剖学。
- 它们由长的轴突束连接神经元群组成。
- 这些构造设计用于微创输送到大脑中。
- 它们可以帮助重建由于创伤或疾病而丢失的神经回路。
研究目的
- 制造微-TENN以重建神经回路。
- 创建用于神经生物学研究的生物学模型。
- 模拟大脑通路的细胞构架。
使用的方法
- 手动将玻璃毛细管破碎成碎片。
- 将针灸针插入碎片中。
- 为构造准备琼脂溶液。
- 利用管状水凝胶进行神经元聚集。
主要结果
- 成功制造了模仿大脑结构的微-TENN。
- 展示了重建神经通路的潜力。
- 建立了创建用于研究的活体支架的方法。
- 突出了在微米级构造上工作的挑战。
结论
- 微-TENN是神经科学研究的有前景的工具。
- 它们可以促进神经回路和大脑功能的研究。
- 进一步发展可能会增强其在再生医学中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs) offer a reproducible platform for reconstructing lost neural pathways and modeling brain connectome architecture in vitro. This technology addresses a critical gap in CNS repair and provides a scalable system for studying neurobiological mechanisms relevant to neurodegeneration and trauma. The approach enables predictive confidence in translational research and supports risk-adjusted portfolio decisions in neurotherapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal connectivity and pathway-specific mechanisms in a controlled 3D environment.
- Supports biological de-risking by recapitulating brain cytoarchitecture for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in selecting disease-relevant neural circuits for intervention.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible constructs for quantitative assessment of neuronal and axonal responses.
- Enables assay development with aligned axonal tracts and defined neuronal populations for compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse for high-content screening of neuroactive agents.
Translational & Preclinical Research
- Offers biofidelic models for studying synaptic integration, network modulation, and regenerative processes.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in vitro modeling of CNS circuitry and repair.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of neuroregenerative interventions.
Pipeline & Workflow Integration
Micro-TENNs integrate into the discovery-to-preclinical continuum by providing a modular system for hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative analytics in neural tissue engineering.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of neuronal aggregation, axonal growth, and synaptic formation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing neuroactive conditions and interventions.
- Analytics: Enables measurement of axonal extension, synaptic distribution, and intrinsic electrical activity.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical strategies for CNS reconstruction and modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a flexible platform adaptable to various cell types and biomaterials for diverse R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS pathway studies.
- Operational Value: Standardizes fabrication and culture of neural constructs for reproducible results.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in neuroregenerative portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS repair and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue engineering and microscale fabrication techniques.
- Demands access to stereomicroscopy, cell culture, and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for construct preparation and analysis.
- Adaptable to different neuronal phenotypes and biomaterial compositions as supported by application needs.
- Practical limitations include handling at micron scale and maintaining construct hydration and alignment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:51
Conclusion
8:14
Results: Observation of Axonal Growth in Micro-TENNs by Phase-contrast Imaging and Cytoarchitecture by Confocal Microscopy
0:58
Micro-column Fabrication Using Capillary Tubes
2:04
Micro-column Trimming and Sterilization
2:48
Preparation of the Pyramidal Micro-well Array
4:46
Formation of Neuronal Aggretates
5:27
ECM Core Fabrication
6:42
Neuronal Aggregate Seeding of Micro-columns
