Name: 解剖学启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建，调制和建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 了解微组织工程神经网络（micro-TENNs）的制备方法，利用水凝胶微柱和神经元聚集体构建三维对齐轴突束。该技术为中枢神经系统重建和神经生物学研究提供仿生体外模型。

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资金支持来自美国国立卫生研究院 U01-NS094340（Cullen）、T32-NS043126（Harris）和 F31-NS090746（Katiyar），迈克尔·J·福克斯基金会（治疗管线项目 #9998（Cullen）），宾夕法尼亚大学医学神经科学中心试点奖（Cullen），美国国家科学基金会（研究生研究奖学金 DGE-1321851（Struzyna 和 Adewole）），美国退伍军人事务部（RR&amp;美国退伍军人事务部#38;D杰出评审#B1097-I（Cullen），美国神经外科医师协会与神经外科医师大会（2015-2016年Codman神经创伤与重症监护研究奖学金（Petrov）），以及美国陆军医学研究与物资司令部（#W81XWH-13-207004（Cullen）和W81XWH-15-1-0466（Cullen））。

作者无任何利益冲突需要披露。

中枢神经系统（CNS）损伤和疾病通常导致构成脑连接组的长距离轴突通路丧失或功能障碍，无论是否伴随神经元退变。由于中枢神经系统促进神经发生和再生的能力有限，这一问题进一步加剧。尽管已有多种修复策略被探索，例如单独或联合应用生长因子、细胞移植和生物材料递送，但这些技术均未能同时解决神经元细胞退化和轴突连接丢失的问题14,22。现有技术的这些不足限制了对神经网络进行可控且持久的修复、调控和探测能力。因此，微组织工程神经网络（micro-TENN）技术应运而生，旨在提供一种不同于现有方法的神经修复策略，能够同时实现神经元替代和长距离轴突连接的重建。micro-TENNs 是可植入的活体支架，具有预先形成的细胞架构，接近脑连接组在系统层面的基本结构单元，专门设计&#160;用于靶向重建、替换和调控宿主神经环路。这些支架由微型圆柱形琼脂糖水凝胶的腔体构成，腔内含有细胞外基质（ECM），其内部包含一个或多个神经元群体，并通过长轴突束相互连接。这类结构可能具备作为突触中继的功能，以替代丢失的神经通路，并动态调节内源性神经回路。此外，在局...

中枢神经系统（CNS）疾病和障碍（如创伤性脑损伤（TBI）、脊髓损伤（SCI）、脑卒中、阿尔茨海默病和帕金森病）的一个共同特征是轴突通路的中断以及神经元细胞的丢失1,2,3,4,5,6。例如，当缺血性脑卒中未得到及时治疗时，据估计每分钟会损失长达7英里的轴突5。以TBI为例，仅在美国每年就有约170万人经历此类损伤，而轴突的退行性变化可能在创伤发生数年后仍持续进行，因为初始损伤会引发长期的神经退行性状态4。更为严重的是，中枢神经系统自身的再生能力极为有限1,7,8,9。损伤后，局部会形成一种抑制性微环境，其特征包括缺乏对远端靶标的定向引导、存在抑制神经突生长的髓鞘相关抑制因子，以及反应性星形胶质细胞形成的胶质瘢痕8,10,11,12。胶质瘢痕构成再生的生化和物理屏障，其中硫酸软骨素蛋白聚糖等分子可阻碍轴突生长8,11。此外，尽管已在成年中枢神经系统中发现神经干细胞，但新神经元的生成极为有限，目前仅有持续证据表明神经发生存在于嗅球、海马齿状回下区、脑室周围区域以及脊髓中央管区域13,14。这些障碍阻碍了损伤或疾病后神经元功能及白质结构的恢复，导致这些疾病常带来终身性且长期的影响。
尽管成年中枢神经系统缺乏再生能力，但已有研究表明，只要向宿主神经元提供适当的环境信号，轴突再生是可能的15,16,17,18研究人员已尝试递送并调控生长因子（例如， 神经生长因子、表皮生长因子、胶质细胞依赖性生长因子和神经营养因子-3，以及其他导向分子，以促进可塑性和轴突再生14,18,19尽管这些研究已证实成年轴突能够对生长因子产生反应，但这些策略受限于血脑屏障的低通透性，以及促进再生所需的特定时空梯度14,18,19. 其他方法依赖于在中枢神经系统神经元中过度激活与再生相关的转录因子。例如，Stat3转录因子的过表达可促进视神经轴突再生20然而，无论是生物分子递送还是转录因子的过表达，均无法替代丢失的神经元群体。基于细胞的策略主要集中于将神经干细胞（NSCs）移植到中枢神经系统（CNS），利用其替代CNS神经元、释放神经营养因子以及支持损伤后神经发生的尝试能力。17尽管如此，该方法仍面临一些亟待解决的挑战，包括移植的神经细胞存活能力受限、与宿主组织整合困难，以及难以在空间上局限于损伤区域等问题。6,14,17,21此外，仅通过细胞递送无法重建受损或缺失的轴突通路的细胞结构。一种可解决细胞及药物/化学物质递送策略所面临问题的替代方法，是将这些策略与生物材料的使用相结合。14,22,23生物材料（如水凝胶）能够模拟细胞外基质（ECM）的生物化学和物理特性，有助于将细胞递送并保留在损伤区域，同时实现生长因子及其他生物活性分子的可控释放22这些基于生物材料策略的优良特性已得到证据支持 体内 损伤区域移植支架后的轴突再生24,25,26,27,28,29,30然而，无细胞生物材料策略无法替代已丢失的神经元群体；当用作神经元、胶质细胞或神经前体细胞的递送载体时，生物材料亦无法重建长距离的轴突网络。目前仍面临挑战，即开发一种能够同时应对中枢神经系统损伤和疾病中轴突通路退化与神经元丢失的策略。31.
我们研究团队先前报道了可植入式微组织工程神经网络（micro-TENNs）的开发，这是一种“活体支架”，由限制在琼脂糖水凝胶-细胞外基质微柱一端或两端的神经元胞体构成，其轴突束沿该三维（3D）包封结构内部定向延伸1,10,31,32. 该技术与以往方法的一个主要区别在于，微组织工程神经网络（micro-TENNs）的细胞架构是完全构建的 体外 随后进行移植33,34,35,36,37,38,39,40,41. 体外 制备技术可对细胞表型与取向、力学/物理特性、生化信号以及外源性因子实现广泛的空间和时间控制，这有利于支架植入后与宿主组织的整合41,42微神经组织移植物（Micro-TENNs）具有解剖学启发性，因其模拟了大脑的神经解剖结构，展现出类似于连接大脑不同功能区域的轴突束图1A)1因此，该策略可能在植入损伤区域后，通过物理方式替代丢失的白质纤维束和神经元。该技术还受到发育机制的启发，在这些机制中，由放射状胶质细胞和先锋轴突形成的“天然活体支架”分别作为细胞从脑室下区迁移和轴突延伸的导向路径。43这些机制在微组织工程神经（micro-TENNs）的定向轴突束中得以重现，后者可通过轴突介导的轴突发芽，为神经细胞迁移和轴突再生提供存活通路。图1C)43此外，该策略利用微组织工程神经元与宿主神经回路之间的突触整合，形成新的神经传导通路，可能有助于功能恢复（图1B)43突触形成的能力还可能使该方法具备根据神经网络反馈调节中枢神经系统并响应宿主组织的功能。例如，可对活体支架中具有光遗传活性的神经元进行刺激，通过突触相互作用来调节宿主神经元（图1D).
此外，基于生物材料的微管状结构为细胞黏附、生长、神经突延伸和信号传导提供了适宜的环境，而该结构的微型尺寸可能有助于实现微创植入，并为逐步整合到脑组织中提供部分隔离的微环境。事实上，近期发表的研究已证明微管状神经组织工程结构（micro-TENNs）在植入大鼠脑内后具有模拟神经通路的潜力。通过立体定位微量注射后，我们先前的研究已报道了micro-TENNs神经元在体内存活至少1个月的证据，同时保留了轴突束结构以及向宿主皮层延伸神经突的现象in vivo10,31。此外，突触素（synapsin）标记提供了micro-TENNs与宿主组织发生突触整合的组织学证据10,31。总体而言，micro-TENNs可能特别适用于修复和调控受损的中枢神经系统，其机制包括替代丢失的神经元、与宿主神经回路形成突触连接、恢复受损的轴突细胞架构，以及在某些情况下为再生的轴突提供正确的导向线索。
<img alt="显示微组织工程神经网络（micro-TENN）突触整合与轴突再生示意图的神经再生示意图。" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：微组织工程神经网络（micro-TENNs）研发的基本原理与设计思路。（A）micro-TENNs 模拟大脑连接组的细胞架构（紫色），其中功能不同的脑区通过长而有序排列的轴突束进行单向（红色、绿色）或双向（蓝色）连接。例如，micro-TENNs 可用于重建皮质-丘脑通路、黑质-纹状体通路，或从内嗅皮层至海马体的穿通通路中已丧失的神经连接（改编自 Struzyna et al., 2015）1。（B）单向（红色）和双向（蓝色）micro-TENN 与宿主神经回路（紫色）发生突触整合的示意图，作为病灶两端之间的功能性中继连接。（C）单向 micro-TENN 的轴突束（绿色）作为引导结构，促进宿主轴突（紫色）沿其路径再生，并导向 micro-TENN 所作用的目标区域。（D）利用光遗传学活性 micro-TENNs 作为神经调节器的概念图，通过与兴奋性或抑制性神经元（底部）的突触整合实现功能调控。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
本文详细描述了利用胚胎来源的大脑皮层神经元制备微尺度组织工程神经网络（micro-TENNs）的方法。值得注意的是，micro-TENN 也可由其他类型的神经细胞制备。例如，早期关于 micro-TENN 成功构建的报道中即采用了背根神经节（DRG）神经元。32。水凝胶微柱可被制备（图 2A通过将液态琼脂糖加入含有排列整齐的针灸针的定制激光切割圆柱形通道阵列或毛细管中来制备。针灸针形成微柱的管腔并决定其内径（ID），而毛细管的内径以及激光切割装置中圆柱体的直径则决定了构建物的外径（OD）。通过选择不同直径的装置/毛细管和针灸针，可分别根据所需应用灵活选择微柱的外径和内径。微柱的长度也可调节；迄今为止，我们已报道了长达20 mm的微-TENNs的构建10 并正在积极追求更长的长度。在去除琼脂糖凝胶和针灸针后，通常将含有I型胶原和层粘连蛋白的细胞外基质溶液加入构建物的管腔内（图2C）。细胞外基质核心为神经元细胞黏附和轴突生长提供了支撑支架。首先，将原代大鼠皮层神经元通过解离的细胞悬液接种至微柱结构中10,31,32然而，这种方法并非在所有情况下都能产生目标细胞结构，目标细胞结构定义为神经元胞体局限于微柱的两端，中央管腔完全由排列整齐的轴突束构成。此后，采用了强制性神经元聚集法（基于改编自Ungrin的方案） 等.) 使得微-TENNs 能够以理想结构进行更可靠、更一致的制备（图2B)44除了描述当前的方法学外，本文还将展示微组织工程神经网络（micro-TENN）的代表性相差显微图像和共聚焦图像，以显示随时间推移轴突束的形成过程以及最终形成的靶向细胞结构。本论文还将进一步探讨该实验方案中值得注意的方面，以及微组织工程神经网络技术目前面临的挑战和未来发展方向。
<img alt="琼脂糖水凝胶制备、神经元培养、细胞外基质核心、细胞接种示意图用于研究流程。" src="/files/ftp_upload/55609/55609fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：三阶段微-TENN制造过程的示意图。 (A琼脂糖水凝胶的制备：（i）首先，使用一根细小的针灸针（例如, 180-350 µm 直径）插入定制的激光切割模具的圆柱形通道或毛细管中（例如, 380-700 µm （直径）。下一步，将溶解的琼脂糖加入DPBS中，并注入圆柱形通道或毛细管内。（ii）琼脂糖凝固后，取出针头并拆卸模具，得到中空琼脂糖微柱。（iii）随后对这些结构进行灭菌，并保存于DPBS中。B) 原代神经元培养与聚集体方法：(i) 神经元聚集体在锥形微孔阵列中形成，该阵列由3D打印模具制备而成，并可置于12孔培养板的孔内。(ii) 微型组织工程神经网络（Micro-TENNs）包含从胚胎第18天大鼠胎儿脑组织中分离的原代大鼠神经元。在使用胰蛋白酶-EDTA和DNase I进行组织解离后，将细胞重悬于密度为1.0–2.0 × 106 细胞/mL 被制备。(iii) 12 µL 将该溶液转移至锥形微孔阵列的每个孔中。将含有这些微孔的板进行离心，以形成细胞聚集体。（iv）随后在接种至微柱前，将其过夜培养。CECM核心制备与细胞接种：（i）在细胞接种前，将含有1 mg/mL I型胶原和1 mg/mL层粘连蛋白的ECM溶液注入micro-TENNs内部，并使其聚合。（ii）根据制备的是单向还是双向micro-TENNs，分别在微柱的一端或两端放置细胞聚集体。（iii）经一段时间孵育以促进细胞黏附后，将micro-TENNs置于盛有添加补充物的胚胎神经元基础培养基的培养皿中进行培养。（iv）培养3–5天后，最终的micro-TENN结构应在微柱两端显示出细胞聚集体，并有轴突束贯穿其全长。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55609/55609fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>激光切割机</td><td>Universal Laser Systems</td><td>PLS4.75</td><td>用于制作激光切割微通道模具。</td></tr><tr><td>激光切割微柱制备装置</td><td>定制</td><td>--------------</td><td>如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和蓝图已在论文中提供。</td></tr><tr><td>螺丝</td><td>--------------</td><td>--------------</td><td>#4-40，螺纹直径为3.05 mm</td></tr><tr><td>螺母</td><td>--------------</td><td>--------------</td><td>#4-40，螺纹直径为3.05 mm</td></tr><tr><td>针灸针（180 &amp;micro;m 直径）</td><td>Lhasa Medical</td><td>sj.16X40</td><td>可根据所需微柱管腔尺寸调整直径。</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>08772B</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>一次性聚苯乙烯血清移液管</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>毛细管（398 &amp;micro;m 直径）</td><td>Fisher</td><td>21170D</td><td>可根据所需微柱外壳尺寸调整直径。</td></tr><tr><td>加热板</td><td>Fisher</td><td>SP88857200</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>Fisher</td><td>1451352</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Sigma</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 规格针头</td><td>Fisher</td><td>14-826-49</td><td></td></tr><tr><td>显微手术刀</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6270</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Sigma</td><td>Z378550-1EA</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>用于所有解剖步骤及微-TENN 的制备。</td></tr><tr><td>大鼠尾部 I 型胶原蛋白</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>保存于 4 &amp;ordm;C，仅在需要时取出。&amp;nbsp; 使用时用冰保持其温度。</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher</td><td>02-681-256</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白</td><td>Corning</td><td>354232</td><td>保存于 4 &amp;ordm;C，仅在需要时取出。&amp;nbsp; 使用时用冰保持其温度。</td></tr><tr><td>神经基础培养基</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>用于胎前和胚胎神经元细胞培养的基础培养基。储存于 4&amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher</td><td>SS2661</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Fisher</td><td>SA48-1</td><td></td></tr><tr><td>石蕊试纸</td><td>Fisher</td><td>09-876-18</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Invitrogen</td><td>14170112</td><td>储存于 4 &amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase）I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>B-27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>添加至神经基础培养基中，用于海马和皮层神经元的培养。储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>储存于 -20 &amp;ordm;C，使用前在 37 &amp;ordm;C 预热。</td></tr><tr><td>Sprague Dawley 胚胎第18天大鼠</td><td>Charles River</td><td>Strain 001</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>EMESCO</td><td>1194-352099</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Fisher</td><td>05-413-115</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Objet30 3D 打印机</td><td>Stratasys&amp;nbsp;</td><td>--------------</td><td>用于制作锥形微孔模具。</td></tr><tr><td>3D 打印锥形孔模具</td><td>定制</td><td>--------------</td><td>如有兴趣，请联系我们的研究团队。尺寸和蓝图已在论文中提供。</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）及固化剂</td><td>Fisher</td><td>NC9285739</td><td>以试剂盒形式提供，包含弹性体和固化剂。需在化学通风橱中使用。</td></tr><tr><td>漏斗</td><td>Fisher</td><td>10-348C</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 移液球</td><td>Sigma</td><td>Z509035</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺</td><td>Fisher</td><td>S50821</td><td></td></tr><tr><td>12 孔培养板</td><td>EMESCO</td><td>1194-353043</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Fisher</td><td>11-475-154</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Fisher</td><td>13 998 076</td><td></td></tr><tr><td>AAV1.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>UPenn Vector Core</td><td>36373</td><td>储存于 -80&amp;ordm;C。为商业可得的携带 GCaMP6f 钙指示剂的腺相关病毒（AAV）。</td></tr><tr><td>40% 甲醛</td><td>Fisher</td><td>F77P-4</td><td>甲醛是一种已知的致癌性有毒化合物，必须单独容器收集处理。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>用于细胞膜通透的非离子型表面活性剂。</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Tuj-1/β-III 微管蛋白一抗</td><td>Sigma</td><td>T8578-200UL</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>兔抗突触素 1 一抗</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-001</td><td>储存于 -20&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 568 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>驴抗兔 488 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 三盐酸盐</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>储存于 4&amp;ordm;C。&amp;nbsp; Hoechst 是一种已知的致突变剂，应视为致癌物处理。&amp;nbsp; 因此，必须单独容器收集处理。</td></tr><tr><td>A1RSI 激光扫描共聚焦显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>--------------</td><td>用于获取免疫标记结构的共聚焦重建图像。</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-S 显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>--------------</td><td>用于获取相差图像。&amp;nbsp; 配备 QiClick 相机，并通过 Nikon Elements Basic Research 软件（4.10.01）进行数字图像采集。</td></tr><tr><td>高速荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>--------------</td><td>配备 ANDOR Neo/Zyla 相机的 Nikon Eclipse Ti 显微镜，用于钙成像。</td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.50.00 软件</td><td>Nikon Instruments</td><td>--------------</td><td>用于从高速荧光显微镜记录的数据中识别钙瞬变。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

由于中枢神经系统（CNS）内存在抑制性环境以及神经发生能力有限，损伤或疾病导致的神经退行性病变后极少出现功能恢复&#160;。我们正在开发&#160;一种可同时应对&#160;受损中枢神经系统中神经元和轴突通路丧失的策略&#160;。本文介绍了微组织工程神经网络（micro-TENNs）的制备方案，该结构为可植入式构建体，由神经元及沿预成型水凝胶圆柱体腔内细胞外基质（ECM）排列延伸的轴突束组成，其直径为数百微米，长度可达厘米级。神经元聚集体被限定在三维包封结构的两端，并由轴突投射连接。micro-TENNs作为一种中枢神经系统重建策略具有独特优势，可模拟脑连接组的部分细胞架构特征，并有望实现神经网络的替代。神经元聚集体可与宿主组织形成突触连接，建立新的功能性中继通路，以恢复和/或调节缺失或受损的神经回路。这些构建体还可作为促再生的“活体支架&#34;，利用发育过程中的细胞迁移和轴突导向机制，根据再生状态提供协同性的结构和可溶性信号线索。micro-TENNs的制备方法是将液态水凝胶倒入含有纵向居中针头的圆柱形模具中。待水凝胶凝固后，移除针头，形成中空的微柱结构。向腔内加入ECM溶液，以提供适合神经元黏附和轴突延伸的环境。将解离的神经元进行机械聚合并精确接种至微柱的一端或两端。该方法可稳定地生成具有长距离轴突投射的自包含微型构建体，可重现脑神经解剖学的某些特征。突触免疫标记和基因编码的钙指示剂结果显示，micro-TENNs具有广泛的突触分布和内在电活动。因此，micro-TENNs为靶向性神经外科脑通路重建提供了一种有前景的策略，也可作为高保真生物模型用于体外研究神经生物学现象in vitro。

使用相差显微镜监测微神经组织工程神经（Micro-TENNs），以评估其细胞架构和轴突生长情况（图4）。在单向、2 mm 长的微神经组织（micro-TENNs）中，神经元聚集体局限于微柱的一端，并通过内部核心延伸出一束轴突。轴突在5天内贯穿整个微柱长度 体外 （体外培养天数）（图4A）。在双向性2 mm长的微TENN中，轴突初始生长速度更快，轴突在3天体外培养（DIV）时已跨越整个微柱图4B）。到第5天体外培养（DIV）时，双向微组织工程神经网络（micro-TENNs）已形成致密的轴突束，连接位于微柱两端的神经球。在5 mm长的micro-TENNs中也观察到类似的细胞架构，轴突在第5天体外培养（DIV）时已跨越整个微柱。图4C如在所有情况下所观察到的，腔内细胞外基质以及琼脂糖所提供的几何限制共同赋予了轴突束形成所需的方向性，从而在结构上模拟了天然神经解剖学的特征。
<p class="jove_conten...

本文详细描述了微组织工程神经网络的构建方法：这是一种三维微米级结构，由长而有序的轴突束组成，连接被包裹在管状水凝胶内的聚集性神经元群体。这些活体支架可作为功能性中继装置，用于重建或调节神经回路，也可作为高度仿生的实验平台，模拟大脑灰质-白质的神经解剖结构。

中枢神经系统（CNS）在受到损伤或疾病导致的退行性变后，由于抑制性环境的存在，功能恢复极为罕见……

本方案描述了微组织工程神经网络（micro-TENNs）的制备方法，micro-TENNs 是一种微型三维结构，由管状水凝胶腔内跨越分离神经元群体的长轴突束组成。micro-TENNs 模拟了脑连接组在系统层面的一般解剖结构，特别是通过长轴突束连接的功能相似的神经元群。由于其预先培养以模拟脑通路的细胞架构，micro-TENNs 可用于因创伤或神经退行性疾病导致的神经环路损伤的靶向重建，也可作为神经生物学研究的高保真生物模型。该方案最具挑战性的方面之一是处理微米级的尺寸规格，而这对于实现最小侵入性脑部递送至关重要。首先，手动将玻璃毛细管折断为 2 至 2.5 厘米长的片段，并将一根针灸针插入每个片段中。将 1 毫升 3% 的琼脂糖溶液转移至空培养皿表面。将毛细管插入已准备好的针头中，使毛细管一端接触液态琼脂糖液滴，通过毛细作用使液体充满毛细管。当液体停止上升时，将毛细管从液滴中取出，并水平放置于培养皿表面。接着，用拇指和食指分别从毛细管两侧捏紧固定。用另一只手快速拔出针头，同时用拇指和食指固定微柱，防止其随针头滑出管外。然后将一根30号针头插入毛细管中，缓慢将微柱推出至含有DPBS的培养皿中。使用精细镊子小心地将一根微柱从DPBS转移至另一个空培养皿中。用微量移液器向微柱顶部加入 10 微升 DPBS，以防止干燥。在体视显微镜下操作，用微型手术刀切割微柱，将其缩短至所需长度。然后使用精细镊子将修整后的微柱转移至另一个含有 DPBS 的培养皿中。在超净工作台中，将含有 DPBS 的培养皿内的微柱在紫外线下灭菌 30 分钟。使用钻头在直径 10 厘米培养皿的盖子上穿刺 16 个孔，排列成 4 厘米 × 4 厘米的 4×4 阵列，孔间距为 1 厘米。在化学通风橱内，使用培养皿的底部称取 27 克 PDMS 和 3 克固化剂。使用微型刮刀搅拌，使试剂均匀分布。然后用带孔的盖子盖住PDMS固化剂。将一根软管的一端连接到通风橱的真空口，另一端插入适当大小漏斗的茎部。将1毫升移液器吸头安装到1毫升移液球上，插入软管中，并向上拉动软管，直至移液球将软管密封于漏斗茎部。接着，将漏斗置于已穿孔的培养皿盖上，并用合适的坚固支架固定软管。打开真空阀持续5分钟，以抽吸并使气泡上升至液面。五分钟后，关闭阀门，取下漏斗，并将培养皿在通风橱表面轻敲数次，以消除残留的气泡。将3D打印的锥形井模具放入12孔细胞培养板的每个孔中，确保锥体朝上。然后将PDMS固化剂倒入模具上方，直至填满培养板的每个孔。将盖好的培养板放入60摄氏度的烘箱中干燥一小时。将PDMS阵列经高压灭菌后，在生物安全柜中操作，将每个微孔阵列插入一个无菌的12孔板的孔中。为形成神经元聚集体，使用移液器向PDMS阵列的每个微孔中加入12 µL细胞悬液。将培养板在200 × g条件下离心5分钟，使细胞聚集到微孔底部。然后小心地向每个PDMS阵列顶部加入约2毫升培养基，以覆盖所有接种的微孔。将培养板置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育12至24小时。开始CEM核心制备时，在微量离心管中混合I型胶原蛋白、层粘连蛋白和培养基，并将pH值调节至7.2至7.4。然后将装有CEM的离心管置于冰上。使用无菌镊子将微柱转移至空的35或60毫米培养皿中。然后，在体视显微镜下操作，使用连接在1000微升枪头上的10微升枪头吸出管腔内的残留DPBS和气泡。迅速用微量移液器吸取4至5微升CEM，将移液器枪头置于微柱的一端，挤出足量CEM以充满管腔。为防止脱水，在每个微柱周围各加入2微升CEM。将水凝胶CEM微柱置于培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15分钟。孵育结束后立即进行细胞接种。向含有微柱的培养皿中的两个空白区域各转移约10至20微升培养基。使用微量移液器单独收集神经元聚集体，并将其转移至含有构建物的培养皿中。用镊子将聚集体移至培养基的小液滴中，以维持细胞活性。在体视显微镜下观察，用镊子将聚集体插入微柱的一端，用于构建单向微神经组织（micro-TENNs），或在两端分别插入聚集体以构建双向结构。然后将接种后的微柱转移至另一小池培养基中，以避免脱水并维持类聚体的健康状态。当所有微柱均完成接种后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育45分钟，使类聚体能够黏附于CEM上。孵育结束后，使用体视显微镜检查确认类聚体仍位于微柱末端。最后，使用移液器小心地将培养基加入含有微尺度组织工程神经网络（micro-TENNs）的培养皿中。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中进行长期培养。这些相差显微图像显示了体外培养长达八天的单向2毫升长微尺度组织工程神经网络。在这些图像中，注意微柱两端的神经元聚集体，而排列整齐的轴突束则跨越管腔延伸。如图所示，在体外培养5天时，轴突束已几乎延伸至微柱的全长。对于5毫米长的双向微型组织工程神经网络（micro-TENNs），在体外培养5天时轴突束已占据微柱的整个长度，该结构至少可维持至体外培养10天。以下两张图片有助于排查该实验步骤中的问题。此图片显示，由于在制备过程中完全去除了DPBS、CEM或培养基，或其发生蒸发，导致水凝胶微柱完全脱水干燥。此图片显示，由于针灸针与毛细管未实现同心对齐，微柱的管腔紧贴外壁。最后，这张共聚焦图像显示了体外培养28天的双向微神经组织（micro-TENN），细胞核用Hoechst染成蓝色，轴突用tudge one标记为红色，突触前小泡用synapsin 1标记为绿色。如预期所示，可见细胞从神经球沿轴突通路迁移，并伴随突触前终末的存在。微神经组织是一种自包含的、受解剖结构启发的构建物，可模拟连接组细胞结构的关键特征；因此，微神经组织在植入大脑后可能为替代丢失的神经通路提供一种手段。该方法的关键组分包括管状生物材料包埋方案，该方案可支持轴突沿纵向生长，以及聚集体方法，该方法可确保获得适当的细胞体胞体结构，使细胞体局限于管腔内部轴突束的两端。在熟练掌握这些方法后，可根据特定应用，将该技术的原理应用于构建含有其他细胞表型和生物材料组分的微尺度组织工程神经网络（micro-TENNs）。

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解剖学启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建，调制和建模

本视频展示了利用海马神经元构建三维神经元培养物并与平面微电极阵列耦合的方法。分离的神经元在微电极阵列的活性区域上形成二维网络，并附着于带有膜插件的多孔板中的玻璃微珠上。当将这些带有神经元的微珠转移至电极上时，它们会自组织成相互连接的三维神经网络。...

构建耦合微电极阵列的三维神经元网络

本视频展示了利用丝素-胶原蛋白支架构建三维极化神经组织模型的过程。详细介绍了在多孔丝素支架上接种神经细胞、孵育以促进细胞贴附、用胶原蛋白包埋支架的操作步骤，并强调了支持性胶原基质在形成三维极化神经组织模型中的重要作用。...

开发一种基于工程化丝素蛋白-胶原的极化神经组织三维模型

来源：Struzyna, L. A. et. al.，基于解剖学启发的三维微组织工程化神经网络用于神经系统重建、调控与建模。J. Vis. Exp.

利用基于水凝胶的微柱开发微组织工程化神经网络

本文描述了一种培养 体外 由空间上受限、功能上相互连接的神经元回路组成的模块化网络。使用聚合物掩模在培养基底上构图蛋白层，以促进细胞在特定区域的黏附。接种的神经元在包被区域生长，形成自发连接并表现出电生理活性.

由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞接种与培养

深入了解大脑复杂的活动需要先进的研究工具。在此，我们展示了一种基于丝素-胶原蛋白的新型三维神经组织工程模型，其结构类似于大脑组织。该模型可用于研究神经元网络的组装、轴突导向、细胞间相互作用以及电活动。...

基于丝素蛋白-胶原的极化神经组织工程化三维模型

本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。...

将三维工程化神经元培养物与微电极阵列连接：一种创新方法 体外 实验模型

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

在本论文中，我们展示了含有石墨烯的生物杂化水凝胶生物墨水的制备方法，用于外周组织工程。利用这种3D生物杂化材料，实施干细胞的神经分化方案。这可能是将类似生物材料推向临床应用的重要一步。...

基于石墨烯的三维生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征及其在外周神经工程中的应用

本研究描述了一种在自愈性可退火颗粒-细胞外基质复合材料内进行神经干细胞自由成型嵌入式3D打印的实验方案。该方案能够高保真地程序化构建相互连接的人类神经组织结构。...

微凝胶-细胞外基质复合支撑材料用于人源神经组织嵌入式三维打印

了解微组织工程神经网络（micro-TENNs）的制备方法，利用水凝胶微柱和神经元聚集体构建三维对齐轴突束。该技术为中枢神经系统重建和神经生物学研究提供仿生体外模型。

受解剖结构启发的三维微组织工程神经网络用于神经系统重建、调控与建模

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