生活成像的脑皮层细胞使用二维培养系统

本实验的总体目标是观察从神经干细胞到神经元或神经胶质细胞的谱系过程中的细胞行为。这种方法可以帮助回答神经发育领域的问题，例如对称和不对称细胞分裂的作用、细胞周期延长和细胞生长速率。该技术的主要优点是它允许长时间观察细胞谱系。

这允许在单个谱系内观察到从神经发生到神经胶质发生的转变，以及亚线性神经和神经胶质祖细胞的直接组合。首先在带有冷解剖培养基的培养皿中取出 5 到 10 个 e14 胚胎的大脑。使用镊子小心地拉出皮肤和颅骨，并隔离大脑。

在体视显微镜下工作时，使用解剖钳去除脑膜。然后，将端脑从中间分开以分离半球。为了隔离背外侧端脑，沿背内侧曲线和钯部和钯下边界切开。

将背外侧端脑转移到装有冰上解剖培养基的 2mL 管中，直到解剖所有大脑。背外侧端脑显微解剖后，将组织放入 15mL 锥形管中。然后将含有收集组织的试管在冷解剖培养基中以 4 摄氏度和 340 倍 G 离心 5 分钟，以沉淀组织。

离心后，用移液管除去上清液，加入 1mL 37 摄氏度 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 进行化学消化。在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育后，加入 2 mL 增殖培养基以抑制胰蛋白酶活性。

接下来，将玻璃巴斯德移液管的尖端在燃气燃烧器或本生灯上抛光几秒钟，以略微缩小孔径。Asperify FCS 以涂覆移液器的尖端。然后通过上下移液，用火焰抛光和 FCS 涂层的巴斯德移液器机械解离细胞，同时小心避免产生气泡。

解离的细胞在 4 摄氏度下以 340 倍 G 离心 5 分钟，用移液管去除上清液，然后加入 1 毫米增殖培养基，并使用移液管重悬细胞。从含有 Poly-D-赖氨酸的预处理板中取出 PBS。然后在板的底部画一个符号，可以作为确定零点的参考。

增殖培养基中第二次重悬细胞后，使用 0.4% 台盼蓝溶液制备细胞悬液的 1：1 稀释液。加载到计数室载玻片中，并计数未染色的活细胞的数量。无活力细胞将为蓝色。

在增殖培养基中稀释细胞，使每毫米 10 到 6 个细胞。向 24 孔组织培养板的每个孔中加入 500 微升细胞悬液，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。为了对逆转录病毒转导的细胞进行成像，将组织培养板放入连接到温度和二氧化碳控制器的成像室中，以将细胞保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的恒定条件下。

在 xy 轴上选择一个位置作为零点并校准零点。选择每孔 10 到 15 个位置，以 10 倍放大倍率成像。将软件设置为每 5 分钟需要相位对比图像，每 3 小时需要一次荧光图像，以减少光毒性。

在实验的前三个小时内检查并调整焦点，因为它可能会在温度平衡时发生变化。7 天后，停止采集并继续进行影像学后免疫细胞化学。启动细胞跟踪软件并选择一个用户名。

单击选择您的用户名并继续。浏览并选择 tTt 工作文件夹以保存世系树、统计数据和导出的图像。接下来，选择要分析和加载的实验。

如果图像之前是通过 tTt 转换器转换的，请单击日志文件转换器，并在日志文件转换器窗口中指定两个连续时间点之间的秒数。单击 convert log files for whole experiment（转换整个实验的日志文件）。手动选择并加载所需的图像，或使用程序中显示的选项。

选择 file（文件）、open（打开）、new colony（新菌落）。单击 tracking，然后单击 start tracking 以在所选位置开始跟踪。将出现一个电影窗口。

使用跟踪圆圈选择单元格，然后按零键。软件将进入下一帧。使用鼠标将跟踪圆定位在轨道单元周围，然后单击每帧中的 0 以在单元上添加轨道标记。

使用关键点 1 和 3 移动到上一帧或下一帧。要删除轨道标记，只需单击要标记的正确位置，然后按 0。如果单元格已分裂，请选择 "跟踪"、"停止原因"、" 分割 "，并通过在单元格编辑器窗口中选择其中一个单元格来继续跟踪一个子单元格，然后选择 "跟踪"、"开始跟踪"。

要跟踪第二个子单元格，请在单元格编辑器中选择它，然后按 F2。如果细胞在视频显微镜检查期间死亡，请选择细胞凋亡。如果像元离开观察区域或与相邻像元混合而无法进行跟踪，请选择 lost （丢失）。要停止跟踪并稍后继续，请单击 interrupt。

在 cell 编辑器窗口中，跟踪期间将生成一棵树。要保存世系树，请在单元格编辑器窗口中选择 file （文件）、save （保存）、current tree （当前树）。要导出包含跟踪数据的影片，请关闭跟踪模式，然后在影片窗口中选择导出影片。

设置帧的格式范围、每秒帧数和比特率。单击 Start export（开始导出）。以下显微照片显示了原代大脑皮层细胞培养物的 GFP 荧光图像中的相差。

在成像的最初几个小时内不存在 GFP 表达。表达 GFP 的细胞数量随着时间的推移而增加，GFP 荧光的强度增加，如这些图像中的黄色箭头所示。前一图像的方框区域中的这个更高放大倍率的图像详细显示了表达 GFP 的细胞。

这些相差图像显示了细胞分裂的示例。这里可以看到祖细胞的聚集，然后是细胞膜收缩，最后是有丝分裂完成。这是单个细胞谱系树的示例。

彩色箭头表示不同的细胞分裂模式，对称增殖分裂由黄色箭头表示。不对称划分由蓝色箭头指示。对称的末端分裂由红色箭头表示，X 表示细胞死亡。

数字表示祖细胞的细胞周期长度。如果执行得当，这项技术可以在一到两个小时内完成。观看此视频后，您应该对干细胞向神经元或神经胶质细胞的细胞谱系进程中的细胞行为有很好的了解。