Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System
2017年8月9日
Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.
本实验的总体目标是观察从神经干细胞到神经元或神经胶质细胞的谱系过程中的细胞行为。这种方法可以帮助回答神经发育领域的问题，例如对称和不对称细胞分裂的作用、细胞周期延长和细胞生长速率。该技术的主要优点是它允许长时间观察细胞谱系。
这允许在单个谱系内观察到从神经发生到神经胶质发生的转变，以及亚线性神经和神经胶质祖细胞的直接组合。首先在带有冷解剖培养基的培养皿中取出 5 到 10 个 e14 胚胎的大脑。使用镊子小心地拉出皮肤和颅骨，并隔离大脑。
在体视显微镜下工作时，使用解剖钳去除脑膜。然后，将端脑从中间分开以分离半球。为了隔离背外侧端脑，沿背内侧曲线和钯部和钯下边界切开。
将背外侧端脑转移到装有冰上解剖培养基的 2mL 管中，直到解剖所有大脑。背外侧端脑显微解剖后，将组织放入 15mL 锥形管中。然后将含有收集组织的试管在冷解剖培养基中以 4 摄氏度和 340 倍 G 离心 5 分钟，以沉淀组织。
离心后，用移液管除去上清液，加入 1mL 37 摄氏度 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 进行化学消化。在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育后，加入 2 mL 增殖培养基以抑制胰蛋白酶活性。
接下来，将玻璃巴斯德移液管的尖端在燃气燃烧器或本生灯上抛光几秒钟，以略微缩小孔径。Asperify FCS 以涂覆移液器的尖端。然后通过上下移液，用火焰抛光和 FCS 涂层的巴斯德移液器机械解离细胞，同时小心避免产生气泡。
将解离的细胞在 4 摄氏度下以 340 倍 G 离心 5 分钟，用移液管去除上清液，然后加入 1 毫米增殖培养基，并使用移液管重悬细胞。从含有 Poly-D-赖氨酸的预处理板中取出 PBS。然后在板的底部画一个符号，可以作为确定零点的参考。
在增殖培养基中第二次重悬细胞后，使用 0.4% 台盼蓝溶液制备细胞悬液的 1：1 稀释液。加载到计数室载玻片中，并计数未染色的活细胞的数量。无活力细胞将为蓝色。
在增殖培养基中稀释细胞，使每毫米 10 到 6 个细胞。向 24 孔组织培养板的每个孔中加入 500 微升细胞悬液，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。为了对逆转录病毒转导的细胞进行成像，将组织培养板放入连接到温度和二氧化碳控制器的成像室中，以将细胞保持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的恒定条件下。
在 xy 轴上选择一个位置作为零点并校准零点。选择每孔 10 到 15 个位置，以 10 倍放大倍率成像。将软件设置为每 5 分钟需要相位对比图像，每 3 小时需要一次荧光图像，以减少光毒性。
在实验的前三个小时内检查并调整焦点，因为它可能会在温度平衡时发生变化。7 天后，停止采集并继续进行影像学后免疫细胞化学。启动细胞跟踪软件并选择一个用户名。
单击选择您的用户名并继续。浏览并选择 tTt 工作文件夹以保存世系树、统计数据和导出的图像。接下来，选择要分析和加载的实验。
如果图像之前是通过 tTt 转换器转换的，请单击日志文件转换器，并在日志文件转换器窗口中指定两个连续时间点之间的秒数。单击 convert log files for whole experiment（转换整个实验的日志文件）。手动选择并加载所需的图像，或使用程序中显示的选项。
选择 file（文件）、open（打开）、new colony（新菌落）。单击 tracking，然后单击 start tracking 以在所选位置开始跟踪。将出现一个电影窗口。
使用跟踪圆圈选择单元格，然后按零键。软件将进入下一帧。使用鼠标将跟踪圆定位在轨道单元周围，然后单击每帧中的 0 以在单元上添加轨道标记。
使用关键点 1 和 3 移动到上一帧或下一帧。要删除轨道标记，只需单击要标记的正确位置，然后按 0。如果单元格已分裂，请选择 "跟踪"、"停止原因"、" 分割 "，并通过在单元格编辑器窗口中选择其中一个单元格来继续跟踪一个子单元格，然后选择 "跟踪"、"开始跟踪"。
要跟踪第二个子单元格，请在单元格编辑器中选择它，然后按 F2。如果细胞在视频显微镜检查期间死亡，请选择细胞凋亡。如果像元离开观察区域或与相邻像元混合而无法进行跟踪，请选择 lost （丢失）。要停止跟踪并稍后继续，请单击 interrupt。
在 cell 编辑器窗口中，跟踪期间将生成一棵树。要保存世系树，请在单元格编辑器窗口中选择 file （文件）、save （保存）、current tree （当前树）。要导出包含跟踪数据的影片，请关闭跟踪模式，然后在影片窗口中选择导出影片。
设置帧的格式范围、每秒帧数和比特率。单击 Start export（开始导出）。以下显微照片显示了原代大脑皮层细胞培养物的 GFP 荧光图像中的相差。
在成像的最初几个小时内不存在 GFP 表达。表达 GFP 的细胞数量随着时间的推移而增加，GFP 荧光的强度增加，如这些图像中的黄色箭头所示。前一图像的方框区域中的这个更高放大倍率的图像详细显示了表达 GFP 的细胞。
这些相差图像显示了细胞分裂的示例。这里可以看到祖细胞的聚集，然后是细胞膜收缩，最后是有丝分裂完成。这是单个细胞谱系树的示例。
彩色箭头表示不同的细胞分裂模式，对称增殖分裂由黄色箭头表示。不对称划分由蓝色箭头指示。对称的末端分裂由红色箭头表示，X 表示细胞死亡。
数字表示祖细胞的细胞周期长度。如果执行得当，这项技术可以在一到两个小时内完成。观看此视频后，您应该对干细胞向神经元或神经胶质细胞的细胞谱系进程中的细胞行为有很好的了解。
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概述
本文概述了一种用于观察原代大脑皮层细胞中细胞行为的延时视频显微镜详细实验方案。该方法使研究人员能够研究从神经干细胞到分化神经元和胶质细胞的谱系发育过程，从而深入了解神经发育机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经发育
- 细胞行为
- 成像技术
背景
- 活体成像是研究细胞动态的有效方法。
- 该研究聚焦于神经干细胞向不同类型细胞的转变过程。
- 该方法可实现对细胞谱系的长期观察。
- 有助于解答有关细胞分裂和生长速率的关键问题。
研究目的
- 观察神经干细胞向神经元或胶质细胞谱系分化过程中的细胞行为。
- 研究对称性与不对称性细胞分裂的意义。
- 实现对神经发生和胶质发生过程的详细追踪。
使用的方法
- 所使用的平台是对原代大脑皮层细胞进行延时视频显微观察。
- 原代神经干细胞从胚胎第14天（e14）小鼠中分离，分离过程遵循详细的解剖操作方案。
- 细胞在成像过程中于受控的温度和CO2条件下进行培养与观察。
- 图像在设定的时间间隔内采集，以尽量减少光毒性，同时利用软件辅助追踪细胞谱系。
主要结果
- 细胞谱系追踪揭示了随时间从神经发生向胶质发生转变的过程。
- 提供了有关细胞存活率和追踪结果的定量数据。
- GFP表达细胞的增加表明谱系追踪和分化观察成功。
- 实验全程捕捉到了有关细胞分裂、死亡及谱系追踪的机制性见解。
结论
- 本研究展示了一种用于活体成像以研究神经谱系发育的可靠方法。
- 该方案使研究人员能够回答神经发育领域的关键问题，有望促进对相关疾病机制的理解。
- 本研究的结果可为未来神经系统细胞分化过程的研究提供参考。
常见问题
行业应用价值
在二维培养系统中对原代大脑皮层细胞进行活体成像，可实现对神经前体细胞命运决定的高分辨率追踪，有助于在神经发育相关靶点验证中进行机制性风险评估。该方法可提供有关细胞分裂模式和谱系进展的单细胞定量数据，为早期发现及转化研究提供支持。该技术通过调控基因表达并可视化其结果，增强了在中枢神经系统（CNS）聚焦的研发项目组合筛选中的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单细胞分辨率下直接观察前体细胞的命运决定和谱系承诺。
- 通过区分对称性与不对称性分裂结果，支持机制层面的风险评估。
- 通过基因操作和活细胞结果追踪，实现对神经发育靶点的功能验证。
- 提供定量的细胞周期和分裂数据，用于基于假设的靶点筛选。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证且可重复的二维培养体系，用于下游表型筛选。
- 提供标准化的成像与追踪方案，支持稳健的检测方法开发。
- 生成关于细胞活力、分裂和分化等方面的定量数据，用于化合物评估。
- 实现可扩展、适用于平台化运行的中枢神经系统细胞检测工作流程。
转化与临床前研究
- 将体外谱系追踪与疾病相关的神经发育过程相整合。
- 通过将细胞命运与分子干预相联系，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供与中枢神经系统疾病模型相关的神经发生和胶质发生机制的深入见解。
- 基于可预测的谱系结果，实现风险调整后的研发推进决策。
流程与工作流整合
这种活体成像方法通过在神经谱系研究中实现假设验证、靶点确证和机制性风险排除，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：支持对神经前体细胞的细胞分裂模式和命运决定进行研究。
- Screening：提供可重复、定量的成像输出，用于检测准备和化合物测试。
- Analytics：生成谱系树、细胞周期参数以及分裂模式统计结果，用于比较分析。
- Translational Research：将体外谱系结果与疾病相关的神经发育通路相连接。
- Enterprise Reuse：提供可重复使用的平台，支持在中枢神经系统研究项目中进行基因操作和活细胞追踪。
运营与企业影响
- 科学价值：提高神经发育靶点验证的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化活体成像与追踪流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：支持在中枢神经系统（CNS）发现中做出有依据的“推进/终止”决策，实现资本高效的项目组合管理。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的神经发育项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备神经细胞分离、活体成像及谱系追踪软件操作的专业知识。
- 需要具备可控成像腔室和荧光显微镜基础设施的使用条件。
- 需要跨团队对成像时间间隔和追踪标准进行统一。
- 通过调整组织来源和培养条件等实验方案，可适用于其他前体细胞系统。
- 可能的局限性包括原代细胞制备的变异性以及成像过程中光毒性的影响。
