Name: 生活成像的脑皮层细胞使用二维培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 了解使用延时显微成像技术对原代大脑皮层细胞进行活细胞成像的方法，以观察神经干细胞向神经元或胶质细胞分化的谱系进程。该技术有助于研究神经发育过程中的细胞行为动态变化。

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本工作由巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）、高等教育人员改进协调委员会（CAPES）和北里奥格兰德研究支持基金会（FAPERN）资助。

本方案中所述所有涉及活体动物的实验均依照国家及国际法律法规进行，并已获得当地大学动物护理与使用委员会（CEUA/UFRN）的批准，许可号为009/2014。以下实验步骤均在无菌环境中进行。操作者需具备基本的细胞培养经验。
1. 背外侧端脑显微解剖
<ol>
	<li>制备解剖培养基（100 mL）：98.5 mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS），0.5 mL 5 M HEPES（pH 7.4），1 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。</li>
	<li>对解剖培养基进行过滤除菌。</li>
	<li>在异氟烷麻醉下，从怀孕的 C57/Bl6 小鼠（Mus musculus）中取出胚胎第14天（E14）的胚胎。 
	注意：以检测到阴道栓的当天为 E0。从怀孕小鼠取出后，解剖操作应在 1 小时内完成。本方案也适用于 E11–E17 胚胎。</li>
	<li>在无菌条件下通过子宫切除术取出胚胎。</li>
	<li>将胚胎转移至含有冷解剖培养基（4 °C）的培养皿中。</li>
	<li>沿大脑纵裂剪开，从颅骨中取出脑组织。通常每次实验可获得五至十个胚胎。每个 E14 脑组织可获得约 2 × 106 个细胞，包括前体细胞和终末分裂后神经元（比例为 1:1）。 
	注意：后续步骤请使用体视显微镜。</li>
	<li>使用解剖镊去除脑膜。从中间切开端脑以分离左右半球。使用解剖镊沿背内侧曲线及皮层-亚皮层边界剪切，以分离背外侧端脑。将分离出的背外侧端脑转移至含有冷解剖培养基（4 °C）的 2 mL 离心管中，直至完成所有脑组织的解剖。</li>
</ol>
2. 细胞解离与接种
<ol>
	<li>制备增殖培养基（50 mL DMEM+10% FCS）：44 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），5 mL 胎牛血清（FCS），0.5 mL 40% 葡萄糖，0.5 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。使用滤器对增殖培养基进行过滤除菌。</li>
	<li>制备分化培养基（50 mL DMEM+2% B27）：48 mL DMEM，1 mL B27，0.5 mL 40% 葡萄糖，0.5 mL 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 和 10,000 µg/mL）。使用滤器对分化培养基进行过滤除菌。</li>
	<li>从 E14 小鼠中分离出端脑背外侧部后，将含有收集组织和冷解剖液的离心管在 4 °C 条件下以 340 × g 离心 5 分钟，使组织沉淀。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，加入 1 mL 预热（37 °C）的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液进行化学消化。在 37 °C 下孵育 15 分钟。加入 2 mL 增殖培养基以终止胰蛋白酶活性。</li>
	<li>将玻璃巴斯德吸管的尖端在气体燃烧器或本生灯上灼烧数秒，使其开口略微缩小。通过吸取 FCS 清洗吸管，使管尖内壁被 FCS 涂覆。避免产生气泡，使用经火焰抛光并涂有 FCS 的巴斯德吸管对细胞进行机械性解离。</li>
	<li>将细胞在 4 °C 条件下以 340 × g 离心 5 分钟。用移液器吸除上清液，加入 1 mL 增殖培养基，用移液器重悬细胞。重复此步骤一次。</li>
	<li>用 0.4% 台盼蓝溶液将细胞悬液稀释至 1:1。死细胞将被染成蓝色。使用血细胞计数板（Neubauer 计数室）计数未染色的活细胞数量。</li>
	<li>用增殖培养基将细胞稀释至 106 个细胞/mL。向 24 孔组织培养板的每孔中加入 500 µL 细胞悬液（约 2.5 × 105&#160;个细胞/cm2）。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育。 
	注意：请勿使用玻璃盖玻片，因其在实验过程中可能发生移动，从而改变观察视野。建议使用底部为玻璃的组织培养板。 
	注意：若未使用经细胞培养处理的多孔板，务必在使用前用聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysin，50 µg/mL）在 37 °C 预处理 2 小时。聚-D-赖氨酸处理后的培养板经蒸馏水洗涤后可于 4 °C 保存。</li>
</ol>
3. 逆转录病毒介导的转染
注意：这是一种仅转染前体细胞的简单方法。然而，也可使用其他病毒载体或化学/电穿孔转染方法将目的基因导入培养细胞中。
<ol>
	<li>为了调控基因表达并用荧光报告蛋白标记细胞，在细胞接种后2小时加入携带目的基因质粒的逆转录病毒。 
	注意：逆转录病毒载体仅能整合到正在分裂的细胞基因组中。因此，应在细胞增殖活跃时进行感染。 
	注意：我们使用了一种包含β-肌动蛋白/巨细胞病毒融合序列（CAG）以及内部核糖体进入位点（IRES）的质粒，其后接绿色荧光蛋白（GFP）的编码序列，命名为pCAG-IRES-GFP44。目的基因可克隆至CAG启动子与IRES序列之间37。</li>
	<li>将逆转录病毒用分化培养基稀释，以获得每毫升所需的病毒颗粒数。向每个孔中加入500 µL含逆转录病毒的分化培养基。 
	注意：所用逆转录病毒的用量取决于其滴度，应计算至每孔感染50至100个细胞为宜。此滴度有助于识别孤立的GFP表达克隆，其谱系关系可通过连续相差显微图像追踪进一步确认（见第6节）。逆转录病毒滴度测定应使用相同的细胞群体进行45。</li>
</ol>
4. 时间序列视频显微镜
注意：此步骤需要配备培养箱的倒置荧光显微镜（参见材料表）。
<ol>
	<li>逆转录病毒感染后，将组织培养板放入与温度和 CO2 控制器连接的培养箱中。 
	注意：在开始成像前预先加热培养室 3 小时，有助于在采集过程中最大限度减少漂移和失焦。 
	注意：培养室应维持细胞处于恒定的 37 °C 和 5% CO2 条件下。</li>
	<li>在 XY 轴上选择一个位置作为零点（XY = 0），以便将来可再次定位这些位置，例如在成像后的免疫细胞化学染色后（见第 5 节）。 
	注意：建议在培养板上绘制一个标记，用作确定零点的参考。</li>
	<li>在 10X 放大倍数下选择待成像的位置。 
	注意：每孔选择 10–15 个位置，以提高观察到逆转录病毒转染细胞的可能性。 
	注意：可使用长工作距离的高倍物镜（20X 或 40X）以获得更高分辨率的图像。根据物镜的工作距离，可能需要使用玻璃底培养板。</li>
	<li>每 5 分钟采集一次相差图像，每 3 小时采集一次荧光图像，以减少光毒性。在实验开始的前 3 小时内检查并调整焦距，因为温度平衡过程中焦距可能发生变化。每天检查并调整一次焦距。 
	注意：我们观察到焦距在前 24 小时后趋于稳定。但建议持续监测焦距。&#160;或者，可使用基于软件的自动对焦系统。</li>
	<li>7 天后停止图像采集，并进行成像后的免疫细胞化学染色（见第 5 节）。</li>
	<li>免疫细胞化学染色后，将培养板重新放回显微镜培养箱中，找到零点，重置 XYZ = 0，并加载保存的位置信息以重新运行实验。使用适当的荧光滤光片采集每个位置的荧光图像。</li>
</ol>
5. 成像后免疫细胞化学
<ol>
	<li>培养 7 天后，在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定液固定细胞培养物 15 分钟。 
	注意：PFA 具有毒性，应在化学通风橱中操作。</li>
	<li>用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>在 4 °C 下，使用含 0.5% 曲拉通和 10% 正常山羊血清的 0.1 M PBS 溶液，与一抗共同孵育过夜。 
	注：使用抗微管相关蛋白 2（MAP2）抗体确认神经元表型（小鼠 IgG1，1:1,000），使用抗 GFP 抗体标记转导细胞（鸡抗体，1:500）。也可使用其他抗体检测前体细胞或胶质细胞。</li>
	<li>用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>将二抗稀释于含 0.5% 曲拉通和 10% 正常山羊血清的 0.1 M PBS 溶液中，室温孵育 2 小时。推荐稀释比例：1:1,000。</li>
	<li>用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>进行细胞核染色时，使用含 0.1 µg/mL 4′6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的 0.1 M PBS 溶液孵育细胞 5 分钟。</li>
	<li>用 0.5 mL 0.1 M PBS 洗涤 5 分钟，重复 3 次。</li>
	<li>将细胞保存在 0.1 M PBS 中，并避光保存（例如，用铝箔包裹培养板）。</li>
</ol>
6. 细胞追踪
注意：此处简要描述使用软件 The Tracking Tool (tTt) 分析延时视频显微数据的主要步骤，该软件可通过材料表中提供的链接获取。
注意：如果图像采集使用其他软件完成，请使用 tTt 安装程序中提供的 tTt Converter（链接见原文）导入图像数据 材料表）。仅接受 png、tif 或 jpg 图像格式。请按照以下所示步骤操作： 图1 A - B 启动 tTt 转换器后。
<ol>
	<li>启动软件 tTt 并选择一个用户名。点击 &#34;添加用户&#34; 和 &#34;继续&#34; 按钮（图 2A）。浏览并选择 &#34;TTTWorkFolder&#34;（图 2B）。谱系树、统计结果和导出的图像将保存在此文件夹中。接下来，选择要分析的实验并加载它（图 2B）。</li>
	<li>如果图像之前已由 tTt Converter 转换，请点击 &#34;LogFileConverter&#34;（图 3A），并在 LogFileConverter 窗口中指定连续两个时间点之间的秒数。点击 &#34;为整个实验转换日志文件&#34;（图 1C）。</li>
	<li>在 tTt 窗口中出现的图像列表中，选择所需图像，可通过手动加载或使用程序中显示的选项进行加载。加载图像（图 3）。</li>
	<li>选择 文件 &#62; 打开 &#62; 新菌落。点击 &#34;追踪&#34;，然后点击 &#34;开始追踪&#34;，以在选定位置开始追踪。</li>
	<li>将出现一个视频窗口（图 4）。使用追踪圆圈选中细胞，然后按下数字键 0。软件将跳转至下一帧。继续使用鼠标将追踪圆圈定位在被追踪细胞周围，并在每一帧中按下 0 键，以在细胞上添加追踪标记。</li>
	<li>使用数字键 1 和 3 分别跳转到前一帧或后一帧。若要删除一个追踪标记，只需点击正确的标记位置并按下 0 键。</li>
	<li>如果细胞发生分裂，请选择 &#34;分裂&#34; 按钮（图 4 中的红色矩形）。通过按下 Shift+D 继续追踪其中一个子代细胞。要追踪第二个子代细胞，请在细胞编辑器中选中该细胞并按下 F2。</li>
	<li>如果细胞在显微视频过程中死亡，请选择 &#34;凋亡&#34;（图 4 中的蓝色矩形）。 
	注意：尽管软件将该事件标记为 &#34;凋亡&#34;，但细胞死亡可能由其他机制引起。</li>
	<li>如果细胞移出观察视野或与邻近细胞混杂而无法继续追踪，请选择 &#34;丢失&#34;（图 4 中的绿色矩形）。</li>
	<li>若要暂停追踪并稍后继续，请点击 &#34;中断&#34;（图 4 中的紫色矩形）。 
	注意：在细胞编辑器窗口中，追踪过程中将生成一棵谱系树。要保存该谱系树，请在细胞编辑器窗口中选择 文件 &#62; 保存 &#62; 当前谱系树。</li>
	<li>若要开始追踪另一个细胞，请使用鼠标右键点击该细胞，或使用鼠标左键选中该细胞，然后点击 追踪 &#62; 开始追踪。</li>
	<li>要导出包含追踪数据的视频，软件不应处于 &#34;追踪模式&#34;。要关闭追踪模式，请执行步骤 6.10。在视频窗口中选择 导出 &#62; 视频。设置格式、帧范围、每秒帧数和比特率。点击 &#34;开始导出&#34;。</li>
</ol>
7. 定量分析
注意：可以使用视频显微镜数据进行多种测量46。本文将介绍三种测量方法，后续在&#34;代表性结果&#34;部分将给出具体示例。
<ol>
	<li>通过将不同时间点存活的细胞数量除以各单个克隆在达到这些时间点之前产生的细胞总数，来量化每种细胞谱系的细胞存活率37。</li>
	<li>量化对称性前体细胞（SP，两个子细胞均继续增殖）、不对称分裂（A，一个子细胞继续增殖，另一个子细胞进入有丝分裂后状态）或对称性终末分裂（ST，两个子细胞均进入有丝分裂后状态）的比例15,38。</li>
	<li>通过计算增殖细胞从生成到分裂所经历的时间间隔，测量细胞周期长度15。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对大脑皮层原代细胞进行实时观察，可分析细胞增殖、细胞分裂方式、细胞周期长度、细胞分化及细胞存活情况3,14,15,37。更重要的是，该方法可用于研究单个细胞的谱系，从而识别神经干细胞（NSCs）向神经元分化过程中经历的中间阶段3。最后，将该培养系统与调控基因表达的生物工程技术相结合，是一种研究特定靶基因细胞自主性效应的有力手段5。本文所述方法可经修改后用于研究在不同发育阶段分离的大脑皮层前体细胞的谱系14，以及来源于其他组织的神经干细胞38,42。类似方法也已被用于研究发育中视网膜的细胞谱系...

神经干细胞（NSC）在大脑皮层发育过程中产生神经元和大胶质细胞。在皮层发生的早期阶段，神经干细胞经历多轮对称性细胞分裂，扩增前体细胞池；随后，神经干细胞通过不对称分裂直接或间接地生成神经元，后者可经由中间前体细胞实现1只有在皮质发生的中期至晚期，前体细胞才转变为生成星形胶质细胞和少突胶质细胞2,3,4然而，调控细胞增殖与分化的完整机制，以及命运受限的前体细胞在生成特定类型神经元或大胶质细胞过程中的作用，仍是激烈争论的焦点。4,5,6单个皮层神经干细胞生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能已被广泛研究 体外 和 在体 使用多种技术，例如：单细胞培养中的活体成像7,8,9,10,11,12,13高密度培养物中的活体成像3,14,15活体成像在脑片培养中的应用16,17,18利用病毒载体介导的遗传标记在高密度培养中进行克隆分析14,15,19,20,21；克隆分析 体内 使用逆转录病毒22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33；以及克隆分析 体内 使用转基因动物34.
这些技术各自具有优缺点。例如，体内谱系示踪易受到归并和分裂误差的影响3，从而导致关于单个大脑皮层前体细胞潜能的结论相互矛盾。此外，基于在早期时间点标记前体细胞并随后分析细胞谱系的体外和体内研究，可能受到谱系进展过程中未被检测到的细胞死亡事件的影响35。因此，一个合适的系统必须能够识别出单个神经干细胞（NSC）所产生的所有细胞，并对谱系内细胞命运进行准确表征。原代细胞培养与活细胞成像的结合为此提供了理想的条件。通过单细胞培养和延时视频显微技术，Temple 等已证明单个大脑皮层前体细胞的谱系会从神经发生转变为胶质发生11。随后，他们利用相同的系统进一步证明，单个皮层前体细胞可产生多种类型的神经元12。然而，该系统存在一个重要局限：在皮层发育早期分离的皮层前体细胞中，仅有1%能够生成包含4个或更多子代细胞的克隆9。加入FGF2后，产生4个或更多子代细胞的前体细胞比例上升至8–10%9。尽管如此，考虑到在此发育阶段几乎所有皮层前体细胞都具有增殖能力，这一比例仍然过低。此外，不能排除FGF2对细胞命运决定的潜在影响36。为了克服这些限制，我们采用了高密度细胞培养体系，该体系可支持室管膜区（表达Pax6）和室下区（表达Tbr2）皮层前体细胞的增殖15。此外，对这些培养物的实时观察表明，在该条件下可重现NSC谱系进展的多个特征，包括细胞分裂方式、细胞周期延长、单个细胞生成神经元和胶质细胞的潜能等3,15。最近，我们还利用该系统证明了CREB信号通路影响小鼠未成熟大脑皮层神经元的细胞存活37。因此，我们认为，对高密度培养的原代小鼠大脑皮层细胞进行延时视频显微观察，是一种强大且易于实现的工具，可用于研究细胞周期进展、细胞分裂方式、细胞存活以及细胞命运决定的细胞与分子机制。后者可通过使用转基因动物实现实时识别特定细胞命运38,39,40，或结合成像后的免疫细胞化学染色来完成3,38,41,42。
本文提供了一种逐步操作方案，用于制备支持神经干细胞（NSCs）增殖以及后续神经元和大胶质细胞生成的原代大脑皮层细胞培养体系。我们还讨论了利用逆转录病毒介导的转染技术来调控单个细胞的基因表达，并可通过延时视频显微镜在单细胞水平上对这些细胞进行识别和追踪。该方案可用于研究从皮层发生开始至结束各个阶段分离自啮齿类动物的原代大脑皮层细胞，但可能需要根据发育阶段进行一些调整14。来源于其他组织的神经干细胞也可通过二维培养的延时视频显微镜进行研究，但应通过比较细胞在体外（in vitro）和体内（in vivo）的行为来确定合适的培养系统38,43。

<table><tbody><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2，小鼠</td><td>Sigma</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP鸡</td><td>鸟纲</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡 Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>苏黎世联邦理工学院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞观察显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>追踪工具（tTt）软件</td><td></td><td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td><td>下载链接</td></tr></tbody></table>

利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

在大脑皮层发育过程中，前体细胞会经历多轮对称和不对称细胞分裂，以产生新的前体细胞或终末分裂后的神经元。随后，部分前体细胞会转变为胶质细胞发生命运，补充星形胶质细胞和少突胶质细胞的数量。通过对外源性大脑皮层原代细胞培养物进行延时视频显微成像，可以研究调控前体细胞分裂模式及细胞周期参数的细胞与分子机制。同样，也可利用细胞特异性的荧光报告蛋白或成像后的免疫细胞化学方法，检测终末分裂后细胞的命运。更重要的是，这些特征均可在单细胞水平上进行分析，从而识别出承诺生成特定细胞类型的前体细胞。此外，还可通过病毒介导的转染技术操控基因表达，以研究细胞自主性与非细胞自主性现象。最后，利用荧光蛋白融合技术，可研究特定蛋白在细胞分裂过程中对称或不对称的分布情况，并分析其与子代细胞命运之间的关联。本文中，我们描述了延时视频显微成像方法，用于对小鼠原代大脑皮层细胞进行持续数天的活细胞成像，以分析细胞分裂模式、细胞周期长度以及新生细胞的命运。我们还介绍了一种简单的前体细胞转染方法，可用于操控目的基因，或仅用报告蛋白对细胞进行标记。

从胚胎E14分离的大脑皮层细胞原代培养物中包含神经前体细胞和神经元细胞。在成像期间，前体细胞经历多轮细胞分裂，使细胞数量增加（图5 和 视频图1）。
通过逆转录病毒介导的少数前体细胞转染，可实现细胞克隆的鉴定（图6）。请注意，GFP 表达在 24 小时后即可被检测到。在此时间点，可在相差图像中识别表达 GFP 的细胞，并追溯其来源以完成谱系分析。此处提供的 GFP 图像对比度较差，原因如下：1）内源性 GFP 表达在逆转录病毒感染数天后才出现；2）图像是通过 24 孔板的塑料底部使用 10X 长工作距离物镜拍摄的；3）荧光曝光时间被设定为在不损伤细胞（光毒性）的前提下可检测到 GFP 信号的最低水平。
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

活体成像是一种用于实时研究细胞行为的强大工具。本文中，我们描述了一种对原代大脑皮层细胞进行延时视频显微镜观察的实验方案，该方法可详细检测从原代神经干细胞向分化神经元和胶质细胞谱系发育过程中各阶段的动态变化。

在大脑皮层发育过程中，前体细胞会经历多轮对称和不对称细胞分裂，以产生新的前体细胞或……

本实验的总体目标是观察细胞在从神经干细胞向神经元或胶质细胞谱系发育过程中的行为。该方法有助于回答神经发育领域中的诸多问题，例如对称性与不对称性细胞分裂的作用、细胞周期延长以及细胞生长速率等。该技术的主要优势在于能够长时间观察细胞谱系的演变过程。这允许在单个谱系中观察到从神经发生向胶质发生转变的过程，并可直接比较亚线性神经和胶质前体细胞。首先，在含有冷解剖液的培养皿中取出5至10个e14胚胎的脑组织。使用镊子小心地移除皮肤和颅骨，分离出脑组织。在体视显微镜下操作，使用解剖镊去除脑膜。随后沿中线切开端脑以分离两侧半球。为分离背外侧端脑，沿背内侧弯曲处以及皮层与亚皮层边界进行切割。将背外侧端脑转移至含有冰上解剖液的2 mL离心管中，直至所有脑组织完成解剖。背外侧端脑显微解剖完成后，将组织置于15 mL锥形管中。随后，在4°C条件下，以340 × g离心5分钟，使含有组织的管子在冷解剖液中离心沉淀组织。离心后，用移液器吸除上清液，并加入1 mL 37摄氏度的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液进行化学消化。在37摄氏度下孵育15分钟。孵育结束后，加入2 mL增殖培养基以抑制胰蛋白酶活性。接下来，将玻璃巴斯德移液管的尖端在燃气灯或本生灯上灼烧数秒，以略微缩小其开口。用胎牛血清（FCS）润洗移液管尖端，使其表面覆盖一层FCS。随后，使用经火焰抛光并涂有FCS的巴斯德移液管，通过反复吹打进行机械解离细胞，注意避免产生气泡。将离散的细胞在4°C、340 ×g条件下离心五分钟。用移液器吸去上清液，然后加入一毫升增殖培养基，使用移液器重悬细胞。用移液器吸去经多聚-D-赖氨酸预处理的培养板中的PBS。然后在培养板底部画一个标记，作为确定零点位置的参考。第二次用增殖培养基重悬细胞后，使用0.4%台盼蓝溶液对细胞悬液进行1:1稀释。将稀释后的悬液加入计数板中，计数未染色的活细胞数量。死细胞会被染成蓝色。将细胞用增殖培养基稀释至每毫升含10的6次方个细胞。向24孔组织培养板的每个孔中加入500微升细胞悬液，并在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养细胞。为成像逆转录病毒转导的细胞，将组织培养板放入与温度和二氧化碳控制器相连的成像腔室中，以维持细胞处于37摄氏度和5%二氧化碳的恒定条件。选择 xy 轴上的一个位置作为零点并校准该零点。每个孔选择 10 至 15 个位置，在 10 倍放大倍数下进行成像。设置软件每 5 分钟采集一次相差图像，每 3 小时采集一次荧光图像，以降低光毒性。在实验的前三个小时内检查并调整焦距，因为在温度平衡过程中焦距可能会发生变化。七天后，停止图像采集，进行成像后的免疫细胞化学染色。启动细胞追踪软件并选择用户名。单击“选择您的用户名”并继续。浏览并选择 tTt 工作文件夹，以保存谱系树、统计结果和导出的图像。接下来，选择要分析和加载的实验。如果图像先前已通过 tTt 转换器转换，请点击日志文件转换器，并在日志文件转换器窗口中指定日志文件中两个连续时间点之间的秒数。点击转换整个实验的日志文件。手动或使用程序中显示的选项选择并加载所需的图像。选择文件、打开、新建菌落。点击追踪，然后点击开始追踪，以在选定位置启动追踪。视频窗口将出现。使用追踪圆圈选中细胞，然后按下数字零键。软件将跳转至下一帧。继续使用鼠标将追踪圆圈定位在目标细胞周围，并在每一帧中点击零键，以在细胞上添加追踪标记。使用键1和键3可分别移动到前一帧或下一帧。要删除轨迹标记，只需单击正确位置进行标记，然后按0键。如果细胞已发生分裂，请选择跟踪、停止原因、分裂，然后在细胞编辑窗口中选择其中一个子细胞，继续对该子细胞进行跟踪：选择跟踪，开始跟踪。为了追踪第二个子细胞，在细胞编辑器中选择该细胞并按 F2 键。如果该细胞在显微视频过程中死亡，请选择“apoptosis”（凋亡）。如果细胞离开观察视野或与邻近细胞混杂而无法继续追踪，请选择“lost”（丢失）。如需暂停追踪并稍后继续，请点击“interrupt”（中断）。在细胞编辑器窗口中，追踪过程中将生成一棵谱系树。要保存谱系树，请在细胞编辑器窗口中选择文件、保存、当前树。要导出包含追踪数据的视频，请关闭追踪模式，然后在视频窗口中选择导出视频。设置帧的格式范围、每秒帧数和比特率，然后点击开始导出。以下显微照片显示了原代大脑皮层细胞培养物的GFP荧光图像中的相差图像。成像开始的最初几小时内未见GFP表达。随着时间推移，表达GFP的细胞数量逐渐增加，GFP荧光强度也随之增强，如图中黄色箭头所示。此高倍放大图像显示了前一张图中框选区域的细节，可清晰观察到表达GFP的细胞。这些相差图像展示了一个细胞分裂的实例。此处可见前体细胞变圆，随后细胞膜收缩，最后完成有丝分裂。这是一个单细胞谱系树的示例。彩色箭头表示不同的细胞分裂模式，黄色箭头表示对称增殖性分裂，蓝色箭头表示不对称分裂，红色箭头表示对称终末分裂，X 表示细胞死亡。数字表示前体细胞的细胞周期长度。如果操作得当，该技术可在一至两小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何展示干细胞向神经元或胶质细胞分化过程中细胞谱系进展的细胞行为。

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生活成像的脑皮层细胞使用二维培养系统

活细胞成像在研究细胞器运输动态时具有特别重要的应用价值。本文描述了一种利用宽场荧光显微镜对培养神经元中致密核心囊泡进行活体成像的实验方案。该方案具有良好的灵活性，可经适当调整用于成像其他细胞器，如线粒体、内体和过氧化物酶体。...

活体成像原代培养的海马神经元中的致密核心囊泡

本文提供了一种在胶质细胞饲养层存在下培养大鼠皮层神经元的实验方案。培养的神经元可建立极性并形成突触，且可将神经元与胶质细胞分离，用于多种实验应用，如电生理学、钙成像、细胞存活率检测、免疫细胞化学以及RNA/DNA/蛋白质提取。...

原代大鼠皮层神经元与胶质细胞的双层共培养

长时间实时成像胚胎组织具有挑战性。本文介绍一种可在较长时间内以高空间和时间分辨率监测鸡胚脊髓中细胞及亚细胞水平变化的检测方法。该技术可适用于神经系统及其他胚胎发育区域的研究。...

发育中的神经上皮内细胞行为的高分辨率活体成像

本视频演示了一种从小鼠胚胎端脑背外侧区域分离和培养原代大脑皮层细胞的实验方案。...

从小鼠胚胎背外侧端脑中分离与培养细胞

来源： Gómez-Villafuertes, R., et. al., 通过活体成像结合单细胞追踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学特性及谱系进展. J. Vis. Exp. (2017)...

活体成像与单细胞追踪监测成年神经干细胞中的神经谱系

来源：Landeira, B. S.,et al., 利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像。J. Vis. Exp.

转染小鼠原代大脑皮层细胞的延时成像

通过将脑组织切片与癌细胞进行器官型共培养，可以在癌细胞侵袭脑组织的过程中，利用荧光显微镜以及明场（视频）显微镜观察其形态学变化。该模型系统还支持细胞交换与补充操作，并可进行多种实验干预和分析。...

具有类器官脑切片与癌细胞三维球体的共培养系统

关键词：共培养系统，类器官脑切片，癌细胞，三维球体，肿瘤微环境，脑转移，体外模型

本文介绍了一种通过延时视频显微镜监测神经细胞群体，并结合基于软件的后期处理的稳健方案。该方法是一种强大的工具，可用于在活体成像实验中识别特定细胞群体内的生物学事件。...

活体成像联合单细胞示踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学与谱系进展

本文介绍了一种改良的滚管法，可用于对啮齿类动物脑片进行长期培养，并在光刻蚀盖玻片上实现精确复位的间歇性高分辨率成像。该方法能良好维持神经元的存活率和脑片的形态结构。文中还展示了利用该完全封闭系统，结合病毒实现细胞类型特异性表达的应用实例。...

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

本方案描述了一种在丘脑与大脑皮层的器官型共培养物中，同时成像丘脑-皮层轴突分支及突触形成的实验方法。通过使用DsRed和GFP标记的突触素进行单细胞电穿孔技术，可对单个丘脑-皮层轴突及其突触前终末进行可视化观察。...

在器官型共培养物中观察丘脑皮层轴突分支与突触形成

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

了解使用延时显微成像技术对原代大脑皮层细胞进行活细胞成像的方法，以观察神经干细胞向神经元或胶质细胞分化的谱系进程。该技术有助于研究神经发育过程中的细胞行为动态变化。

利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像

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