Name: 封闭系统中脑切片长期培养中精确定位和重复间歇成像的改进辊筒法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解改进辊筒法用于啮齿动物脑切片的长期培养与重复高分辨率成像。该封闭系统支持病毒安全使用，可在神经元发育和神经退行性疾病研究中精确定位相同细胞群体。

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本文所述的滚管法可用于脑组织切片的长期培养和高分辨率活体成像。在此应用的切片技术中，一个主要问题在于切片的安装与维持。盖玻片涂层虽可促进切片黏附，但会刺激神经突起的外延生长以及细胞从切片中迁移出来，从而导致切片变薄；因此，我们避免使用此类基质。通过3-氨丙基三乙氧基硅烷处理在玻璃表面引入氨基，可改善切片的黏附性，但盖玻片上鸡血浆过多或过少均可能导致黏附不良，进而造成切片丢失。血浆的适宜用量取决于培养脑切片的大小，因此大鼠海马切片所需的血浆量更大，因其面积约为小鼠脑切片的4倍。若切片下方血浆凝固过多，细胞与盖玻片之间的黏附将受到阻碍，此时使用纤溶酶处理会使切片松动，导致其移位或完全脱落。然而，凝块中血浆过少则可能导致切片在培养箱旋转培养的最初几天内丢失。在最近一项涉及39个切片的实验中，有3个切片丢失，但其中部分丢失可能源于切片制备过程中的机械损伤。尽管如此，我们通常会比实验所需数量多准备约50%的切片。培养过程中第二常见的问题是培养液从盖玻片密封处泄漏。若在固定盖玻片后未将其牢固按压至少1分钟，该问题会加剧。用拇指施加压力时产生的热量可能有助于完成密封。发生的泄漏通常源于盖玻片下方微小的气道，可在解剖显微镜下观察到。这类气道通常可通过延...

从啮齿类动物脑区分离神经元进行原代培养，是研究人员用于观察神经元对病理相关刺激反应的重要工具。然而，这类研究存在局限性，即只能在二维条件下观察神经元，且缺乏胶质细胞的支持系统。此外，除非在极高密度（640个神经元/mm2，约占表面积的16%）条件下培养，否则在距离胞体较远的位置难以追踪树突或轴突的随机生长过程；而在这种高密度之外，海马神经元在培养4周后的存活率会显著下降1，从而限制了原代培养体系在衰老相关病理长期研究中的应用。相比之下，将啮齿类动物脑组织制备成脑片进行培养是一种更具吸引力的选择，该方法能够维持细胞的有序结构，并在数周甚至数月内保持良好的细胞活性，从而克服上述局限。已有研究报道了多种啮齿类动物脑区脑片培养的适宜条件2。
目前广泛用于脑片长期培养的两种主要方法是：在膜上进行气液界面培养3，或在密封管内的盖玻片上培养，并将管子置于滚筒式培养箱中旋转以提供通气4。在膜上培养的脑片可直接使用直立显微镜和水浸物镜通过高分辨率荧光显微镜进行成像5。此外，也可将膜上培养的脑片转移至玻璃底培养皿中，利用倒置显微镜实现树突棘的高分辨率观察6。然而，这两种在膜上成像的方法均为开放式系统，需要定期更换培养基，且常需添加抗真菌剂和/或抗生素以预防或减少污染5,6。处于气液界面膜上的脑片能保持良好的形态结构和细胞存活率，但在高倍镜下重复成像时，若需返回精确的同一位置，则极为困难，除非实验仅追踪表达荧光标记的小群细胞。尽管膜上培养的脑片已用于病毒介导的外源基因表达5,6，但根据生物安全规范，某些用于表达荧光标记蛋白及细胞生理报告分子的病毒载体可能需要采用封闭式培养系统。此外，浸液物镜在连续追踪不同样本时，需在样本之间进行去污染处理5。膜界面培养的一个重要应用是将高分辨率成像与单时间点的电生理记录相结合7。
在塑料管内放置盖玻片的滚管法，若不取出盖玻片，则无法进行电生理记录或高分辨率成像。因此，该方法最常用于长期研究，且通常在固定后进行观察8。本文所述方法采用滚管培养技术，但使用经过钻孔处理的培养管，将组织切片置于盖玻片上，可在培养维持期间反复成像。该封闭系统在成像过程中无需更换培养基，并采用光刻蚀盖玻片提供定位标记，使得在数天甚至数周后仍能在高倍镜下准确重现先前成像的特定视野。
我们应用该方法来研究啮齿类动物海马体中的变化，海马体是参与记忆和学习的主要脑区。啮齿类动物海马体常被用作研究认知功能障碍（如阿尔茨海默病，AD）发展过程中所出现的病理或与年龄相关变化的模型9。我们的方法特别适用于研究单一片段内随着时间推移、在环境变化（例如Aβ肽水平升高，这是AD的特征之一8）诱导下发生的病理改变。人类和啮齿类动物AD脑组织中的一种病理特征是存在cofilin-actin聚集体和棒状结构（rods），后者包含成束的丝状结构，其中cofilin与actin的摩尔比为1:110,11,12。在经Aβ处理的大鼠海马固定切片中，以及在表达cofilin-GFP并经受缺氧处理的活体啮齿类动物脑片中，均已观察到棒状结构8，这些结构可能与AD和脑卒中中所见的突触功能障碍有关。本文中，我们利用这种新的培养方法，观察由不同病毒导入的外源性嵌合荧光蛋白在脑片内的表达时间进程及其分布情况。随后，我们利用神经元特异性表达的cofilin报告基因构建体，追踪可溶性Aβ寡聚体（Aβo）处理后海马脑片中cofilin棒状结构和聚集体病理的形成过程。

<table><tbody><tr><td>15 cm 培养皿底部</td><td>VWR Scientific</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>十字头机械螺钉（#10-32）</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>2.5&quot; 长，3/16&quot; 直径</td></tr><tr><td>#10 平垫圈</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>机械螺母（#10-32）</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡胶护圈&amp;nbsp;</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>5/16&quot; 厚；5/8&quot; 孔径；1.125&quot; 外径</td></tr><tr><td>聚乙烯管（5/16&quot; 外径，3/16&quot; 内径）</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td>切成 1.8&quot; 长度</td></tr><tr><td>#10 弹簧垫圈</td><td>ACE Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式钻床，5 速&amp;nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>ProTech Model 1201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 平壁管</td><td>VWR</td><td>62407-076</td><td></td></tr><tr><td>钻头，3 mm、6 mm 和 15 mm&amp;nbsp;</td><td>Ace Hardware</td><td>Diablo freud 品牌</td><td>用于切割塑料的钻头。</td></tr><tr><td>木工钻头，1.5 cm 和 1 mm</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; 圆形木工锉</td><td>Ace Harware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹簧夹，16 mm 卡扣式</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>万向头去毛刺工具，5&quot;</td><td>Ace Hardware</td><td>26307</td><td></td></tr><tr><td>粘性硅胶片（Secure Seal）</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>666581</td><td>厚度 0.5 mm</td></tr><tr><td>6 mm 打孔器</td><td>Office Max</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm 打孔器</td><td>thepunchbunch.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光刻法盖玻片，直径 12 mm</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>1916-91012</td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-氨基丙基三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>VWR</td><td>28450-182</td><td>裁成直径 5.8 cm 的圆片</td></tr><tr><td>聚氯三氟乙烯（Aclar）</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10501-10</td><td>裁成直径 5.8 cm 的圆片</td></tr><tr><td>#21 外科刀片</td><td>VWR Scientific</td><td>25860-144</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢刮勺，尖端渐细</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td></td></tr><tr><td>Gey's 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;葡萄糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) 溶液，经 0.2 mm 滤膜过滤除菌</td></tr><tr><td>鸡血浆</td><td>Cocalico Biologicals</td><td>30-0300-5L</td><td>用无菌水重悬，4 &amp;deg;C 下以 2500 × g 离心 30 分钟，分装后迅速在液氮中冷冻，并于&amp;nbsp; -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>外用凝血酶（牛源）</td><td>Pfizer</td><td>Thrombin-JMI</td><td>用提供的稀释液配制成 1,000 国际单位/mL，分装后迅速在液氮中冷冻，并于 -80&amp;deg;C 保存。使用时稀释至 250 单位/mL。</td></tr><tr><td>细胞滚瓶系统</td><td>Bellco Biotech</td><td>SciERA</td><td></td></tr><tr><td>滚筒式培养箱</td><td>Forma</td><td>Model 3956</td><td></td></tr><tr><td>N21-MAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AR008</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100X）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>200 mM 谷氨酰胺</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15023-021</td><td>25% (w/v) 溶液，经 0.2 mm 滤膜过滤除菌</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888-022&amp;nbsp;</td><td>完全培养基：48 mL Neurobasal A，1 mL N21-MAX，0.625 mL 200 mM 谷氨酰胺，0.180 mL 25% 葡萄糖，0.250 mL 100 倍青霉素/链霉素。</td></tr><tr><td>第三代慢病毒包装系统</td><td>Life Technologies</td><td>K4975-00</td><td></td></tr><tr><td>159 K 截留分子量离心过滤器（Centricon）</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>慢病毒克隆系统（InFusion）</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒 30323、50856、51279</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>神经元细胞活力染料（NeuO）</td><td>Stemcell technologies</td><td>1801</td><td>仅解冻一次，分装为 4 &amp;micro;L 每份并迅速冷冻。-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>Olympus</td><td>空气镜：4X、20X；油镜：40X、60X</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦系统</td><td>Yokagawa</td><td>CSU22</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 EMCCD 相机</td><td>Photometrics</td><td>Cascade II</td><td></td></tr><tr><td>线性编码（x,y）、压电 z 轴平顶载物台</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜激光器及集成系统</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>人纤溶酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1867</td><td>0.002 U/mL 溶于含 0.1% 牛血清白蛋白的溶液中（经 0.2 mm 滤膜过滤除菌），分装后迅速在液氮中冷冻，并于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr></tbody></table>

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

培养的啮齿类动物脑片可用于研究神经元和胶质细胞在保持其多数正常特性的环境中所表现出的细胞与分子行为 体内 相互作用。利用多种转基因小鼠品系制备脑片，或在野生型脑片中使用病毒载体表达荧光标记蛋白或报告分子，可实现荧光显微镜下的高分辨率成像。尽管已有多种脑片成像方法被开发出来，但将脑片培养与对活体脑片中特定细胞进行长期、重复的高分辨率成像相结合仍存在挑战。当使用病毒载体表达外源蛋白时，这一问题尤为突出，因为此类操作最好在封闭系统中进行，以保护操作者并防止交叉污染。本文报道了对滚管式脑片培养方法进行的简单改进，可在封闭系统中实现脑片持续数周的重复高分辨率成像。将脑片培养在光刻蚀盖玻片上，可利用定位标记快速而精确地重新定位载物台，从而在不同处理前后对同一视野进行长时间追踪成像。本文展示了该方法结合特异性神经元染色与表达，用于观察海马脑片结构的变化、病毒介导的神经元荧光蛋白表达，以及cofilin病理的发育过程——后者此前已在阿尔茨海默病（AD）模型中被观察到，即在脑片经淀粉样β肽（Aβ）寡聚体处理后，海马区出现cofilin病理改变。

为了确定标志点在随时间推移后重新定位同一视野中相同细胞的准确性，我们检测了生长在光蚀刻盖玻片上的脑片（图6A）。通过使用活细胞染料（100 nM，孵育2小时；不染色非神经元细胞）对神经元进行标记可视化，该染料会随着时间在不损伤细胞的情况下从神经元中逐渐消失25。我们在单个网格方格内识别出一个标志点（图6A, B），在标记后24小时找到一片被活细胞染料标记的神经元区域，记录该区域相对于标志点的x和y方向偏移位置（图6B），并使用60倍物镜连续4天重复采集该区域的共聚焦图像堆栈。图中展示了在相同位置采集的30 µm图像堆栈的最大投影图像（图6C–F）。尽管在4...

本文介绍了一种改良的滚管法，可用于对啮齿类动物脑片进行长期培养，并在光刻蚀盖玻片上实现精确复位的间歇性高分辨率成像。该方法能良好维持神经元的存活率和脑片的形态结构。文中还展示了利用该完全封闭系统，结合病毒实现细胞类型特异性表达的应用实例。

培养的啮齿类动物脑切片可用于研究神经元和胶质细胞在保持许多体内特征的环境中其细胞和分子水平的行为。

改进的滚筒管法用于脑片培养的总体目标是提供一个封闭的培养系统，以实现脑片的长期存活，并能够进行重复的高分辨率荧光成像。该方法有助于回答神经元发育和神经退行性疾病研究中的关键问题，例如通过长期观察同一神经元，定位突触形成或丢失过程中涉及的关键蛋白。该技术的主要优势在于其完全封闭的培养系统，可安全地利用病毒进行蛋白表达，以及采用光刻蚀盖玻片实现对同一细胞在成像过程中的精确定位。我们最初在滚管内将脑片培养于盖玻片上时萌生了该方法的构想，但当时亟需一种更优的方法来观察活体脑片随时间发生的变化。由于病毒载体被广泛用于在特定细胞群体中表达外源基因并进行显微成像，这促使我们开发出一种封闭系统，以保护操作人员并避免显微镜物镜受到污染。能够在一段时间内持续观察脑切片中同一群细胞，有助于研究人类神经系统疾病啮齿类动物模型中病理变化的发展以及突触的改变。首先，准备滚筒培养管架，并按照随附的文字版实验方案所述，制作一个辅助工具，用于在滚筒培养管上钻孔。使用该辅助工具将一个带平面的一厘米长塑料培养管固定在适当位置，使平面朝上。然后，在管壁侧面之间居中、距底部1厘米处钻一个直径为6毫米的孔。使用旋转去毛刺工具将孔的边缘打磨光滑，并在孔的内侧边缘加工出四个凹槽，以利于旋转过程中孔内液体的排出。接着，用70%乙醇冲洗管子，然后在生物安全柜中将其空气干燥。在紫外灯下对装有直径12毫米打孔粘性硅胶垫的试管进行40分钟灭菌处理。20分钟后，重新调整试管和硅胶垫的位置，以确保所有暴露表面均得到灭菌。随后，撕去粘性垫片的白色背衬，对齐孔位，并将硅胶垫粘附在试管外侧。获得切片后，取两微升鸡血浆置于已制备的盖玻片光刻面中央。轻轻涂抹血浆，使其形成直径为三到四毫米的斑点。然后使用无菌的细头刮铲挑起一块已制备的脑切片。使用闭合的镊子在提起组织切片时将其固定在抹刀尖端。将抹刀接触盖玻片上的血浆斑点，并用闭合的镊子将组织切片推至盖玻片上。在放置组织切片前，先在盖玻片上添加一层薄薄的鸡血浆，然后加入少量经凝血酶处理的血浆，以完全覆盖组织切片。如果组织切片漂浮，则在移除液滴后无法保持附着状态。接下来，在另一支离心管中混合2.5 µL血浆和2.5 µL凝血酶。迅速将2.5 µL该混合液滴加至切片上方及周围，并轻轻吹打混匀。移除之前固定在滚管上的硅橡胶粘合剂暴露侧的透明塑料覆盖层。然后将带有脑切片的盖玻片放置在粘合剂上，使切片对准孔洞位置。为确保粘附牢固，在将盖玻片转移至生物安全柜的过程中，用拇指均匀轻压盖玻片表面，施加均匀压力并持续按压约一分钟。盖玻片压紧至与管壁贴合且不漏液时，压力必须恰到好处，并维持足够长时间，以消除突起部分中的气道。压力过大将导致盖玻片破裂。在生物安全柜中，向每根试管中加入 0.8 毫升完全神经基础培养基 A 培养液。然后，用夹子牢固固定一支带有无菌棉塞的巴斯德移液管，将含5%二氧化碳和95%空气的混合气体通过该移液管通入。用此方法以气体混合物冲洗滚管，并在将移液管抽出时迅速盖紧管帽。接下来，用切片编号和架子编号标记各管。将试管插入滚轴架中，确保其几何平衡。若试管数量为奇数，则添加空试管以达到平衡。将装有试管的滚轴架放入35°C滚轴培养箱中，调节滚轴转速为每小时10至13转。通过将培养箱前端抬升至一块木板上，使其向后倾斜约5度。将装有脑片培养物的试管转移至如图所示的定制试管架中，然后将试管架放入载物台适配器中，以确保成像过程中盖玻片与物镜保持垂直。接下来，将载物台适配器上的滑块紧贴试管，以固定试管位置。在明场透射照明下，使用4倍物镜聚焦于切片下方的光刻网格周期。在初次成像过程中，快速扫描切片周围区域，定位并记录需要高倍成像的不同区域编号。确定感兴趣区域后，移动载物台至包含感兴趣区域的第一个网格方格。然后切换到20倍物镜，找到一个基准标记。接着换用更高倍数的物镜，定位同一基准标记，并记录载物台的x和y位置。移动载物台，找到附近其他感兴趣的视野，并记录它们相对于基准标记的 x 和 y 偏移量。这些偏移位置能够在切片成像时精确定位到盖玻片的相同位置，即使在移除和重新安装管子或载物台适配器后，基准标记的原始 x、y 设置发生变化。使用显微镜物镜控制或若有条件则使用压电载物台控制，在每个选定视野内采集 Z 轴堆栈图像。利用神经元活体染料，此处展示的共聚焦图像序列突出了神经突和细胞体的三维结构，但染色剂不进入细胞核。为了观察长期培养过程中脑片形态和脑片内细胞活力随时间变化的情况，每周使用荧光神经元活体染料标记同一切片一次，并在成像前24小时进行染色。为证明对同一细胞进行随时间推移成像的可重复性，对第13天用神经元活体染料标记的切片同一视野，分别在第14、15、16和17天进行了成像。每天三个细胞的位置通过细胞核上方的符号表示。除了神经元活性染料外，该系统还可利用病毒介导的荧光蛋白来标记细胞。在此，感染后10天可清晰识别出钙敏感报告分子和含Cofilin的杆状结构。成功实施该操作需要提前准备好所有离心管、盖玻片和溶液。在动物死亡后短时间内获取脑片对于实验成功也至关重要，这需要大量练习。一旦掌握，该技术可在约90分钟内完成，包括解剖和铺板时间，可从小鼠幼崽中获得12至18个海马脑片。通过该操作步骤，可在不同时间点用病毒转染脑切片，以实现荧光标记蛋白的细胞类型特异性表达，或利用小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）沉默基因表达，从而探究基因功能。请注意，操作重组病毒可能存在生物安全风险，因此在使用此类试剂时，必须采取防护措施，例如佩戴护目镜。

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封闭系统中脑切片长期培养中精确定位和重复间歇成像的改进辊筒法

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。...

一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

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对下丘脑小鼠脑切片中GFP标记神经元的钙反应进行成像

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一种改良的滚筒管法用于啮齿类动物脑切片的长期培养

来源： Wiegreffe, C., 等  利用胚胎小鼠脑组织切片培养进行迁移神经元的延时共聚焦成像 子宫内 电穿孔 J. Vis. Exp. (2017)...

转导小鼠胚胎脑切片中皮层神经元径向迁移的延时成像

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。...

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小鼠上丘-丘脑-皮层脑片的改良制备，结合 chamber 部件的 3D 打印与多尺度光学成像

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In Utero 电穿孔法结合脑片培养对小鼠胚胎脑中迁移神经元进行延时共聚焦成像

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双光子成像技术观察急性脑切片中小胶质细胞突起对ATP或5-羟色胺的趋化反应

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胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解改进辊筒法用于啮齿动物脑切片的长期培养与重复高分辨率成像。该封闭系统支持病毒安全使用，可在神经元发育和神经退行性疾病研究中精确定位相同细胞群体。

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

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