封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

改进的滚筒管法用于脑片培养的总体目标是提供一个封闭的培养系统，以实现脑片的长期存活，并能够进行重复的高分辨率荧光成像。该方法有助于回答神经元发育和神经退行性疾病研究中的关键问题，例如通过长期观察同一神经元，定位突触形成或丢失过程中涉及的关键蛋白。

该技术的主要优势在于其完全封闭的培养系统，可安全地利用病毒进行蛋白表达，以及采用光刻蚀盖玻片实现对同一细胞在成像过程中的精确定位。我们最初在滚管内将脑片培养于盖玻片上时萌生了该方法的构想，但当时亟需一种更优的方法来观察活体脑片随时间发生的变化。由于病毒载体被广泛用于在特定细胞群体中表达外源基因并进行显微成像，这促使我们开发出一种封闭系统，以保护操作人员并避免显微镜物镜受到污染。

能够在一段时间内持续观察脑切片中同一群细胞，有助于研究人类神经系统疾病啮齿类动物模型中病理变化的发展以及突触的改变。首先，准备滚筒培养管架，并按照随附的文字版实验方案所述，制作一个辅助工具，用于在滚筒培养管上钻孔。使用该辅助工具将一个带平面的一厘米长塑料培养管固定在适当位置，使平面朝上。

然后，在管壁侧面之间居中、距底部1厘米处钻一个直径为6毫米的孔。使用旋转去毛刺工具将孔的边缘打磨光滑，并在孔的内侧边缘加工出四个凹槽，以利于旋转过程中孔内液体的排出。接着，用70%乙醇冲洗管子，然后在生物安全柜中将其空气干燥。

在紫外灯下对装有直径12毫米打孔粘性硅胶垫的试管进行40分钟灭菌处理。20分钟后，重新调整试管和硅胶垫的位置，以确保所有暴露表面均得到灭菌。随后，撕去粘性垫片的白色背衬，对齐孔位，并将硅胶垫粘附在试管外侧。

获得切片后，取两微升鸡血浆置于已制备的盖玻片光刻面中央。轻轻涂抹血浆，使其形成直径为三到四毫米的斑点。然后使用无菌的细头刮铲挑起一块已制备的脑切片。

使用闭合的镊子在提起组织切片时将其固定在抹刀尖端。将抹刀接触盖玻片上的血浆斑点，并用闭合的镊子将组织切片推至盖玻片上。在放置组织切片前，先在盖玻片上添加一层薄薄的鸡血浆，然后加入少量经凝血酶处理的血浆，以完全覆盖组织切片。

如果组织切片漂浮，则在移除液滴后无法保持附着状态。接下来，在另一支离心管中混合2.5 µL血浆和2.5 µL凝血酶。迅速将2.5 µL该混合液滴加至切片上方及周围，并轻轻吹打混匀。

移除之前固定在滚管上的硅橡胶粘合剂暴露侧的透明塑料覆盖层。然后将带有脑切片的盖玻片放置在粘合剂上，使切片对准孔洞位置。为确保粘附牢固，在将盖玻片转移至生物安全柜的过程中，用拇指均匀轻压盖玻片表面，施加均匀压力并持续按压约一分钟。

盖玻片压紧至与管壁贴合且不漏液时，压力必须恰到好处，并维持足够长时间，以消除突起部分中的气道。压力过大将导致盖玻片破裂。在生物安全柜中，向每根试管中加入 0.8 毫升完全神经基础培养基 A 培养液。

然后，用夹子牢固固定一支带有无菌棉塞的巴斯德移液管，将含5%二氧化碳和95%空气的混合气体通过该移液管通入。用此方法以气体混合物冲洗滚管，并在将移液管抽出时迅速盖紧管帽。接下来，用切片编号和架子编号标记各管。

将试管插入滚轴架中，确保其几何平衡。若试管数量为奇数，则添加空试管以达到平衡。将装有试管的滚轴架放入35°C滚轴培养箱中，调节滚轴转速为每小时10至13转。

通过将培养箱前端抬升至一块木板上，使其向后倾斜约5度。将装有脑片培养物的试管转移至如图所示的定制试管架中，然后将试管架放入载物台适配器中，以确保成像过程中盖玻片与物镜保持垂直。

接下来，将载物台适配器上的滑块紧贴试管，以固定试管位置。在明场透射照明下，使用4倍物镜聚焦于切片下方的光刻网格周期。在初次成像过程中，快速扫描切片周围区域，定位并记录需要高倍成像的不同区域编号。

确定感兴趣区域后，移动载物台至包含感兴趣区域的第一个网格方格。然后切换到20倍物镜，找到一个基准标记。接着换用更高倍数的物镜，定位同一基准标记，并记录载物台的x和y位置。

移动载物台，找到附近其他感兴趣的视野，并记录它们相对于基准标记的 x 和 y 偏移量。这些偏移位置能够在切片成像时精确定位到盖玻片的相同位置，即使在移除和重新安装管子或载物台适配器后，基准标记的原始 x、y 设置发生变化。使用显微镜物镜控制或若有条件则使用压电载物台控制，在每个选定视野内采集 Z 轴堆栈图像。

利用神经元活体染料，此处展示的共聚焦图像序列突出了神经突和细胞体的三维结构，但染色剂不进入细胞核。为了观察长期培养过程中脑片形态和脑片内细胞活力随时间变化的情况，每周使用荧光神经元活体染料标记同一切片一次，并在成像前24小时进行染色。为证明对同一细胞进行随时间推移成像的可重复性，对第13天用神经元活体染料标记的切片同一视野，分别在第14、15、16和17天进行了成像。

每天三个细胞的位置通过细胞核上方的符号表示。除了神经元活性染料外，该系统还可利用病毒介导的荧光蛋白来标记细胞。在此，感染后10天可清晰识别出钙敏感报告分子和含Cofilin的杆状结构。

成功实施该操作需要提前准备好所有离心管、盖玻片和溶液。在动物死亡后短时间内获取脑片对于实验成功也至关重要，这需要大量练习。一旦掌握，该技术可在约90分钟内完成，包括解剖和铺板时间，可从小鼠幼崽中获得12至18个海马脑片。

通过该操作步骤，可在不同时间点用病毒转染脑切片，以实现荧光标记蛋白的细胞类型特异性表达，或利用小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）沉默基因表达，从而探究基因功能。请注意，操作重组病毒可能存在生物安全风险，因此在使用此类试剂时，必须采取防护措施，例如佩戴护目镜。