封闭系统中脑切片长期培养中精确定位和重复间歇成像的改进辊筒法

这种用于脑切片培养的改良滚管方法的总体目标是为切片的长期存活提供封闭的培养系统。具有重复高分辨率荧光成像的能力。这种方法可以帮助回答神经元发育和神经退行性疾病中的关键问题，这些问题需要随着时间的推移观察相同的神经元，例如定位参与突触形成或丢失的关键蛋白质。

该技术的主要优点是全封闭培养系统，允许安全地使用病毒进行蛋白质表达，并使用光刻盖玻片定位相同的细胞进行成像。当我们在辊筒内的盖玻片上培养切片时，我们首先想到了这种方法，但需要一种更好的方法来可视化活切片随时间发生的变化。病毒载体在显微镜成像中表达转基因和特定细胞群的广泛使用促使我们开发了一种封闭系统来保护用户并消除显微镜物镜的污染。

跟踪脑切片内相同细胞群的能力允许研究人类神经系统疾病啮齿动物模型中病理变化和突触改变的发展。首先，准备滚轮管架并制作一个夹具，以帮助在滚轮管上钻孔，如随附的文本协议中所述。使用夹具，将一根平边的 1 厘米塑料培养管固定到位，使平坦的一面朝上。

然后钻一个直径为 6 毫米的孔，中心距底部 1 厘米，并在管子的侧面之间居中。使用旋转去毛刺工具将孔的边缘平滑，并在孔的内侧边缘制作四个凹槽，以方便在旋转过程中排空孔。接下来，用 70% 乙醇冲洗试管，然后在生物安全柜中风干。

在紫外线灯下，将试管放入约 12 毫米的冲孔胶硅胶盘中消毒 40 分钟。20 分钟后，重新定位试管和椎间盘，以便对所有暴露的表面进行消毒。接下来，从胶盘上撕下白色背衬，对齐孔并将硅橡胶固定在管子的外部。

获得切片后，将两微升鸡血浆放在准备好的盖玻片的光刻面的中心。稍微铺展血浆以获得 3 到 4 毫升直径的光斑。然后用无菌的窄头抹刀提起准备好的脑切片。

在提起切片时，使用闭合的镊子将切片保持在刮刀尖端上。用刮刀触摸盖玻片上的血浆点，然后用闭合的镊子将切片推到盖玻片上。在放置切片之前，在盖玻片上添加一层薄薄的鸡血浆，并添加最少量的凝血酶处理的血浆以覆盖切片。

如果切片浮动，则在移除云时它不会保持粘附状态。接下来将 2.5 微升血浆和 2.5 微升凝血酶混合在单独的试管中。在切片上和周围快速加入 2.5 μL 这种混合物，然后轻轻上下移液以混合。

从先前贴在滚轮管上的硅橡胶胶粘剂的外露面上取下透明的塑料覆盖物。然后将带有脑切片的盖玻片放在粘合剂上，使切片在孔内对齐。为确保粘附力，用拇指对盖玻片施加柔和均匀的压力，均匀地按下盖玻片，并保持约一分钟，同时将其转移到生物安全柜中。

玻片上的压力必须恰到好处，以将其粘附到管子上而不会泄漏，并保持足够长的时间以消除突出部的空气通道。压力过大会使盖玻片破裂。在生物安全柜中，向每个试管中加入 0.8 毫升完全 neurobasal a 培养基。

然后将 5% 二氧化碳 95% 空气混合物流经由夹子牢固固定的无菌棉塞巴斯德移液器。使用它来用气体混合物冲洗滚轮管，并在从移液器周围取出时快速盖上管子。接下来，用切片编号和机架编号标记试管。

将试管插入滚轮架;确保它们在几何上是平衡的。如果试管数量为奇数，则添加空试管以平衡。将冻存架置于 35 摄氏度的滚轮培养箱中，滚轮以每小时 10 至 13 转的速度转动滚轮冻存架。

将培养箱的正面抬到板上，将培养箱向后倾斜约 5 度。将带有切片培养物的试管转移到定制的试管架上，如此处所示。然后将试管架放入载物台适配器中，以在成像过程中保持盖玻片垂直于物镜。

接下来，将载物台适配器上的滑块紧紧地推到管子上，以将管子固定到位。在明场透射照明下使用四倍物镜，专注于切片下的光蚀刻网格周期。对于初始成像会话，快速扫描切片以定位并记录需要更高放大倍率成像的各个区域的数量。

确定感兴趣区域后，将舞台移动到包含感兴趣区域的第一个网格方块。然后切换到 20 强度误差目标并找到基准标记。接下来切换到更高功率的目标，定位相同的基准标记，并记录载物台的 x 和 y 位置。

移动舞台以查找附近的其他感兴趣字段，并记录它们与基准标记的 x 和 y 偏移量。偏移位置允许在切片成像时一致地精确定位相同的盖玻片位置，即使当移除和更换试管或载物台适配器时，基准标记的原始 x、y 设置发生了变化。使用显微镜物镜控制或压电载物台控制（如果有）在每个选定视野内捕获图像 Z 轴。

使用神经元活性染料，此处显示的共聚焦图像堆栈突出了神经突和细胞体的 3D 结构，但染色被排除在细胞核之外。为了检查长期培养过程中切片生长切片形态和切片内活力的时间依赖性变化，在成像前 24 小时，每周一次用荧光神经元活性染料标记同一切片。为了证明相同细胞随时间成像的可重复性，在第 14 、 15、 16 和 17 天对第 13 天用神经元活性染料标记的切片的相同区域进行成像。

每天三个细胞的位置由细胞核上的符号表示。除了神经元活性染料外，该系统还可以利用病毒介导的荧光蛋白来标记细胞。在这里，钙敏感报告基因和含丝切蛋白的杆细胞都能够在感染后 10 天清楚地识别出来。

成功实施此程序需要提前准备所有试管、盖玻片和溶液。能够在较短的事后间隔内获得切片对于成功也至关重要，需要大量练习。一旦掌握了这项技术，可以在大约 90 分钟内完成，从小鼠幼崽获得 12-18 个海马切片，包括解剖和铺板的时间。

按照此程序，脑切片可以在不同时间被病毒感染，以实现荧光标记蛋白的细胞类型特异性表达，或者沉默以使用小干扰 RNA 或短发夹 RNA 进行基因表达以探测基因功能。不要忘记，与重组病毒一起工作可能很危险，因此在使用这些试剂时应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜。