Name: 从人体二尖瓣提取蛋白质的优化方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学习从人体二尖瓣高效提取蛋白质的方法，用于蛋白质组学分析。该方案有助于识别心脏瓣膜病的新型诊断标志物和治疗靶点，同时适用于猪二尖瓣等实验模型。

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本研究得到意大利卫生部的支持（RC 2013-BIO 15）。我们感谢 Barbara Micheli 提供出色的技术协助。

在本方案中，人类心脏在多器官移植摘取期间收集（冷缺血时间为4-12小时，平均6 &#177; 2 小时）内来自因技术或功能原因被排除在器官移植之外的多器官捐献者，尽管其超声心动图参数正常。这些组织被送往意大利米兰莫津诺心脏中心（Milan, Italy）的心血管组织库，用于保存主动脉瓣和肺动脉瓣。二尖瓣后叶未用于临床用途，因此在获得捐献者家属知情同意后，于主动脉瓣和肺动脉瓣分离过程中收集。用于移植和研究的组织仅在获得家属同意后采集；在知情同意书中，家属授权（或拒绝）在心脏组织不适合临床应用时，将其用于科研目的。即， 微生物学、功能及血清学问题），遵循Monzino心脏中心伦理委员会的指南。
1. 二尖瓣制备
<ol>
	<li>在器官摘除后尽快获取人二尖瓣（冷缺血时间为4-12小时）。</li>
	<li>在洁净室中，从盛有冷（4 &#176;C) 溶液 (即， 生理盐水或平衡液（Eurocollins 或 Wisconsin）。将其放入容器中，并置于生物安全柜（A 级垂直气流，符合药品生产质量管理规范（GMP）标准）内，以进行瓣膜制备。</li>
	<li>将心脏置于超净台内的无菌一次性铺巾上。使用无菌一次性手术刀，在左心室和右心室水平、距心尖约4 cm处，沿与心脏长轴垂直的方向将心脏完全切开。</li>
	<li>移动升主动脉和肺动脉以显露左心房顶部。</li>
	<li>使用无菌可高压灭菌的镊子和解剖针，在左心房顶部围绕左心耳进行剪切，使二尖瓣暴露，以便识别较大的二尖瓣前叶和较小的二尖瓣后叶。 
	注：前外侧交界和后内侧交界定义了前叶与后区的边界。</li>
	<li>使用无菌可高压灭菌剪刀和无创伤镊子，解剖左心房及整个二尖瓣周围的心室壁厚度.</li>
	<li>识别二尖瓣-主动脉瓣连续性。 
	注意：左心室包含完整的二尖瓣及其腱索。</li>
	<li>将前叶与后叶分离，沿后叶与心室连接处（交界处）进行切割。</li>
	<li>用生理盐水冲洗后瓣膜。将瓣膜切成小块（&#60;1 cm2）并用铝箔单独包裹，用液氮速冻。 
	注意：使用液氮时，请遵循机构的安全操作规程。
	<ol>
		<li>实验结束后，使用70%异丙醇溶液和6%过氧化氢溶液对柜内台面进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 蛋白质提取
<ol>
	<li>使用镊子夹取保存在液氮中的样品，并在仍包裹着铝箔的情况下立即置于干冰上。在任何转移过程中均不得让样品解冻。</li>
	<li>研磨前，将研磨系统中的瓷/氧化锆研钵和研杵预冷例如， CryoGrinder) 及样品一起放入盛有液氮（约 500 mL）的杜瓦瓶中。 
	注意：使用液氮时，请遵循机构的安全操作规程。</li>
	<li>将研钵和研杵放入装有干冰的聚苯乙烯盒中。将样品从铝箔中取出，放入研钵中。</li>
	<li>用研钵和大研杵研磨样品15-20次，使用螺丝刀旋转研杵。研磨过程中，用预冷的刮勺尖端混合样品。
	<ol>
		<li>用小研杵重复上述操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将研磨后的样品转移至预先称重的离心管中（例如， 将15 mL离心管倒置，置于研钵上方，然后将两者一同翻转，使样品转移至离心管中。使用预冷的刮勺回收研钵中全部材料。
	<ol>
		<li>将装有样品的离心管置于干冰上，以避免转移过程中样品解冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算样品的净重。</li>
	<li>每次样品处理后清洁研钵和研杵，并通过高压灭菌或加热对其进行去污染处理 200 &#176;C 2小时。</li>
	<li>将离心管中的粉末样品通过倒置转移至匀浆器的玻璃管中。</li>
	<li>加入过滤的尿素缓冲液（8 M 尿素，2 M 硫脲，4% w/v CHAPS，20 mM Tris，55 mM 二硫苏糖醇）至玻璃管中， 200 &#181;L 每10 mg粉末组织加入尿素缓冲液 
	注意：可使用计算体积的部分尿素缓冲液回收离心管中残留的粉末样品。</li>
	<li>使用配备有硼硅酸盐玻璃研钵和聚四氟乙烯（PTFE）研杵的搅拌器匀浆样品。以扭转动作（1,500 rpm）缓慢将研杵压向样品，重复10次。</li>
	<li>收集上清液并转移至一支洁净的1.7 mL离心管中。再次用新鲜的尿素缓冲液提取剩余样品，加入体积为第一次提取所用体积的一半。</li>
	<li>重复步骤 2.10。</li>
	<li>回收上清液，并与步骤 2.11 中的上清液合并。将合并后的上清液置于管式旋转仪上旋转 30 分钟。</li>
	<li>将离心管在13,000 x g条件下离心30分钟 4 &#176;C.</li>
	<li>回收上清液，按照 Bradford 蛋白质测定试剂盒说明书的方法测定蛋白浓度。将样品于 -80 &#176;C 直至使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方案的一个关键步骤是使用液氮冷冻样品并冷却研磨系统。液氮可防止生物降解并实现有效的样品粉碎，但其操作需要经过专门培训以确保安全使用。
本方案采用研磨仪系统进行样品研磨，因为小样品难以从标准的研钵和研杵中完全回收。在这种情况下，小样品会以细粉形式散落在研钵表面，导致收集困难。另一个优点是研磨仪为电动驱动，可更高效、可重复地处理更多样品，且避免操作者疲劳。然而，使用研磨仪的一个限制是样品尺寸必须较小（100 mg 或更少），以便研杵能够有效压紧研钵中的样品。此外，研磨仪的组件在每次使用之间必须恢复至室温以便清洁。因此，该过程耗时较长，若每日需处理大量样品，则需要配备多套研磨组件。
另一个关键步骤是提取缓冲液的配制。盐浓度，特别是尿素（8 M）和硫脲（2 M）的浓度相当高，因此盐的体积几乎占溶液总体积的一半。此外，溶解过程较为困难，因为必须避免加热，因为在超过 37 °C 时，尿素可导致蛋白质/多肽的 N 末端以及赖氨酸和精氨酸残基侧链氨基发生蛋白质氨甲酰化17。尿素缓冲液溶解后必须...

最近的研究证据改变了人们对 mRNA 合成后多种调控机制作用的理解。实际上，翻译、转录后及蛋白水解过程均可调节蛋白质的丰度与功能。过去认为 mRNA 浓度可作为相应蛋白质浓度的替代指标，即转录水平是蛋白质丰度的主要决定因素——这一教条已得到部分修正。事实上，转录本水平仅能部分预测蛋白质丰度，表明细胞内存在转录后事件对蛋白质进行调控1,2。
此外，蛋白质最终决定细胞的功能，从而决定其表型，而表型可因自分泌、旁分泌和内分泌因子、血液传播介质、温度、药物处理以及疾病发展等因素发生动态变化。因此，针对蛋白质水平的表达分析有助于表征蛋白质组，并揭示疾病发病机制中发生的关键性改变3。
因此，尽管目前仍存在技术挑战，蛋白质组学在阐明健康与疾病状态方面所展现出的潜力极为巨大。蛋白质组学可贡献的特别有前景的研究领域包括：在任何水平上鉴定异常的蛋白质表达（即， 完整的细胞或组织、亚细胞结构以及生物流体；用于疾病诊断和预后的新生物标志物的鉴定、验证与确认；以及有望发现可用于治疗目的的新蛋白质靶点，同时用于评估药物的有效性与毒性4.
解析蛋白质组的复杂性是一项技术挑战。当前的蛋白质组学工具能够对蛋白质水平的变化进行大规模、高通量的分析，实现蛋白质的鉴定、定量和验证。此外，通过引入分级和富集技术，可避免高丰度蛋白质的干扰，从而有助于检测低丰度蛋白质，提高蛋白质的鉴定能力。最后，蛋白质组学还结合了翻译后修饰的分析，这类修饰正逐步被认识到是调控蛋白质功能的重要因素。
然而，待分析生物样本的样品制备与蛋白质回收仍是蛋白质组学工作流程中的限制性步骤，并增加了出现潜在偏差的可能性5。事实上，在大多数需要优化的分子生物学技术中，最初的步骤是组织匀浆和细胞裂解，尤其是在分析无扩增方法可用的低丰度蛋白质时尤为关键。此外，蛋白质的化学性质可能影响其自身的回收效率。例如，高疏水性蛋白质的分析极具挑战性，因其在等电聚焦过程中极易发生沉淀；而跨膜蛋白质则几乎不溶（详见参考文献5）。此外，组织成分的差异性为建立通用提取方法带来了显著障碍。最后，由于几乎所有临床样本的量均有限，因此必须能够在最小样本量的基础上实现蛋白质制备的最大回收率与可重复性6。
本研究描述了一种从正常人的心脏二尖瓣中提取蛋白质的优化方案，而正常二尖瓣是蛋白质组学分析中极具挑战性的样本。正常二尖瓣是一种复杂的结构，位于心脏左心房与左心室之间（图1）。它在调控血液从心房流向心室的过程中发挥重要作用，防止血液反流，并确保向全身提供充足的氧气供应，从而维持适当的心输出量。然而，该组织常被视为一种“非活跃”组织，细胞含量较低，主要成分为细胞外基质。这是因为在正常状态下，瓣膜间质细胞（valvular interstitial cells, VICs）呈现静息表型，其蛋白质合成速率较低7。
然而，已有研究表明，在病理状态下，间质层中的心内膜瓣膜间质细胞（VIC）数量增加，其蛋白质合成被激活，并伴随其他功能和表型的改变8。因此，文献中现有的少量数据主要集中于对病变二尖瓣的分析9,10，其中增多的活化VIC可能解释了所鉴定出的蛋白质数量相对较多的现象。
总之，本方案可通过研究二尖瓣的蛋白质组分，有助于加深对二尖瓣疾病致病机制的理解。实际上，对潜在病理过程的更深入认识，可能有助于改善瓣膜疾病的临床管理，而目前干预措施的指征在很大程度上依赖于血流动力学因素。

<table><tbody><tr><td>生理盐水溶液</td><td></td><td></td><td>0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>Eurocollins A</td><td>SALF</td><td>30874046</td><td>平衡器官运输培养基。将 400 mL Eurocollins A 与 100 mL Eurocollins B 混合，以获得平衡培养基 Eurocollins</td></tr><tr><td>Eurocollins B</td><td>SALF</td><td>30874022</td><td>平衡器官运输培养基。将 400 mL Eurocollins A 与 100 mL Eurocollins B 混合，以获得平衡培养基 Eurocollins</td></tr><tr><td>Wisconsin</td><td>Bridge life</td><td>RM/N 4081</td><td>平衡器官运输培养基</td></tr><tr><td>生物危害垂直气流柜</td><td>Burdinola</td><td></td><td>A 类 GMP 分级</td></tr><tr><td>杜瓦瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nalgene 4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>冷冻研磨系统</td><td>OPS diagnostics</td><td>CG 08-01</td><td>包含研钵、研杵和螺丝刀的研磨系统</td></tr><tr><td>不锈钢镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢刮勺</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌手术刀</td><td>Medisafe</td><td>MS-10</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢剪刀</td><td></td><td></td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>不锈钢取样针</td><td></td><td></td><td>可高压灭菌</td></tr><tr><td>一次性无菌铺巾</td><td>Mon&amp;Tex</td><td>3.307.08</td><td></td></tr><tr><td>含异丙醇的消毒液</td><td></td><td></td><td>70% 异丙醇</td></tr><tr><td>含过氧化氢的消毒液</td><td></td><td></td><td>6% 过氧化氢</td></tr><tr><td>1 mL 微量移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>VWR international</td><td>9278</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 离心管</td><td>VWR international</td><td>PIER90410</td><td></td></tr><tr><td>尿素缓冲液</td><td></td><td></td><td>8 M 尿素，2 M 硫脲，4 % w/v CHAPS，20 mM Trizma，55 mM 二硫苏糖醇</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td>用于配制尿素缓冲液</td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma aldrich</td><td>T8656</td><td>用于配制尿素缓冲液</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma aldrich</td><td>C3023-5GR</td><td>用于配制尿素缓冲液</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma aldrich</td><td>D0632-5G</td><td>用于配制尿素缓冲液</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>PIC</td><td></td><td>用于过滤尿素缓冲液</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>用于过滤尿素缓冲液</td></tr><tr><td>PFTE 研杵，2 mL</td><td>Kartell</td><td>6302</td><td>Potter-Elvehjem 匀浆器的组成部分</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃研钵</td><td>Kartell</td><td>6102</td><td>Potter-Elvehjem 匀浆器的组成部分</td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>VELP scientifica</td><td>Stirrer DLH</td><td>用于 Potter-Elvehjem 法匀浆</td></tr><tr><td>Bradford 蛋白质测定试剂盒</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转混合仪</td><td>Pbi International</td><td>F205</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td></td><td></td><td>用于在 13,000 x g 条件下离心 1.7 mL 离心管</td></tr><tr><td>–80&amp;deg;C 超低温冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td></td><td></td><td>用于灭菌</td></tr><tr><td>液氮用低温防护手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>专业强制通风与自然对流烘箱</td><td></td><td></td><td>用于灭菌</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma aldrich</td><td>P8340-5ML</td><td>100X 溶液</td></tr><tr><td>ProteoExtract 蛋白质沉淀试剂盒</td><td>Calbiochem</td><td>539180</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>www.cytoscape.org</td><td>version 2.7</td><td>用于基因本体分析的软件平台</td></tr><tr><td>BiNGO</td><td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td><td>version 3.0.3</td><td>基因本体分析插件</td></tr><tr><td>AlphaB 晶体蛋白/CRYAB 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97494</td><td>抗 CryAB 的小鼠单克隆抗体</td></tr><tr><td>Septin-11 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-83824</td><td>抗 septin-11 的兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>FHL1 抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP-188745</td><td>抗 FHL-1 的兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>皮肤素抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB110-68135</td><td>抗皮肤素的兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>羊抗小鼠 IgG HRP</td><td>Sigma aldrich</td><td>A4416-0.5ML</td><td>免疫印迹用二抗</td></tr><tr><td>羊抗兔 IgG HRP</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>170-5046</td><td>免疫印迹用二抗</td></tr></tbody></table>

优化的人类二尖瓣蛋白质提取方案

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

由于技术的发展使得能够在复杂的生物系统中大规模鉴定和定量存在的蛋白质，因此对细胞蛋白质组的分析有助于阐明疾病背后的分子机制。通过蛋白质组学方法获得的知识有望加深对疾病致病机制的理解，从而有助于发现新的诊断和预后标志物，并有望发现治疗靶点。然而，心脏二尖瓣因其富含蛋白聚糖和胶原的细胞外基质中细胞含量极低，成为蛋白质组学分析中极具挑战性的样本。这使得提取用于全局蛋白质组学分析的蛋白质变得困难。本研究描述了一种适用于后续蛋白质分析（如定量蛋白质组学和免疫印迹）的实验方案。该方法可实现蛋白质表达数据与定量mRNA表达数据以及非定量免疫组织化学分析数据之间的关联。事实上，当这些方法联合使用时，将有助于从mRNA到翻译后蛋白质修饰，更全面地理解疾病背后的分子机制。因此，该方法对于致力于心脏瓣膜生理病理学研究的研究人员具有重要意义。

在尿素缓冲液中提取并溶解蛋白质，可直接适用于基于等电聚焦的蛋白质组学方法（双向电泳（2-DE）11 和液相等电聚焦（IEF）12），以及在含有蛋白酶抑制剂混合物14的Laemmli缓冲液中稀释后进行的免疫印迹分析13。
对于基于质谱的无凝胶方法（即， 液相色谱联合数据非依赖型质谱分析（LC/MS）E）以及二维液相色谱-质谱联用（LC/MS）E 二维液相色谱-质谱联用技术E))15，使用所述尿素缓冲液提取的样品需要进一步处理以去除可能干扰后续蛋白质消化和液相色谱分离的尿素和硫脲。此脱盐步骤可使用商用蛋白质沉淀试剂盒完成，按照制造商说明书...

由于人类二尖瓣的细胞含量较低，因而蛋白质合成水平较低，这使得其分析变得复杂，目前人类二尖瓣的蛋白质组成仍部分未知。本研究提供了一种高效提取蛋白质的方案，可用于二尖瓣蛋白质组的分析。

细胞蛋白质组的分析有助于阐明疾病潜在的分子机制，这得益于能够实现复杂生物系统中大量蛋白质鉴定与定量的技术发展。通过蛋白质组学方法获得的知识，有望加深对疾病发病机制的理解，从而识别出新的诊断和预后标志物，并可能发现治疗靶点。然而，心脏二尖瓣由于细胞含量稀少，且富含蛋白聚糖和胶原蛋白的细胞外基质，因此在蛋白质组分析中构成极具挑战性的样本，使得蛋白质提取以进行全局蛋白质组分析变得困难。本研究描述了一种适用于后续蛋白质分析（如定量蛋白质组学和免疫印迹）的实验方案。该方法可实现蛋白质表达数据与定量mRNA表达数据以及非定量免疫组织化学分析结果之间的关联。事实上，当这些方法联合使用时，将有助于从mRNA到翻译后蛋白质修饰，全面理解疾病相关的分子机制。因此，该方法对于从事心脏瓣膜生理病理学研究的研究人员具有重要意义。

本实验的主要目标是从人心脏二尖瓣中高效提取适用于蛋白质组学分析的蛋白质。该方法有望揭示心脏瓣膜疾病领域的致病机制，从而鉴定出新的诊断和预后标志物，并有望发现治疗靶点。本方案的主要优势在于提供了一种高效的提取流程，可兼容多种分析应用。结果将实现对心脏二尖瓣蛋白质组更全面的表征。此外，该方案还可应用于其他系统，例如与人类二尖瓣高度相似的猪二尖瓣，后者常用于瓣膜功能评估的实验模型。本次实验操作的示范由本实验室的技术员 Stefania Ghilardi 完成。准备人二尖瓣时，首先获取一个已处于4至12小时冷缺血状态的移植后心脏。在洁净室中，将心脏从转运袋中取出，并放入一个已灭菌的容器内。随后，将心脏转移至生物安全柜中。在此处，使用一次性手术刀，在左右心室水平、距心尖约4厘米处，垂直于心脏长轴进行切割。然后将心脏置于无菌手术单上。接着，移开升主动脉和肺动脉，以暴露左心房顶部。在左心房顶部，使用镊子和解剖针围绕左心耳进行剪切，以暴露二尖瓣。二尖瓣完全位于左心室内，因此需暴露前叶（大瓣叶）和后叶（小瓣叶）。前外侧和后内侧交界处界定了前区和后区的边界。现在，使用剪刀和无创镊子解剖左心房以及围绕二尖瓣的室壁厚度。在解剖过程中，辨认二尖瓣与主动脉瓣的连续结构。接下来，沿后叶侧的交界处剪开，将二尖瓣前叶与二尖瓣后叶分离。操作完成后，使用70%异丙醇溶液和6%过氧化氢溶液对柜内台面进行消毒。随后，用生理盐水清洗二尖瓣的后叶。然后，将瓣膜切成小块，每块小于1平方厘米。用铝箔单独包裹各组织块，并用液氮速冻。开始蛋白质提取时，用镊子从液氮中取出一个样品，并立即置于干冰上。切勿让样品解冻。接下来，将研钵、配套的研杵以及样品放入装有液氮的杜瓦瓶中。必须使用液氮冻结样品并对研磨系统进行预冷。此步骤可防止生物降解并实现高效研磨，但需要经过技术培训以确保安全操作。速冻完成后，将研钵和研杵放入装有干冰的聚苯乙烯盒中。同时，将一把刮勺也置于干冰上。接下来，将样品从铝箔上取下并装入研钵中。将较大的研杵置于其上方。使用螺丝刀旋转研杵，研磨样品15至20次。研磨过程中，使用预冷的刮勺尖端混合样品。使用大研杵研磨后，换用较小的研杵重复研磨过程。获得细粉对高效的蛋白质提取至关重要。现在，将粉末样品倒入已知质量的15毫升离心管中。然后用冷却的刮刀将残留的材料刷入研钵中。将装有样品的离心管置于干冰上，并迅速测定样品的质量。接下来，将样品倒入玻璃匀浆管中。然后，每10毫克样品加入200微升尿素缓冲液。在此过程中，用尿素缓冲液冲洗并回收残留在管中的样品残留物。现在使用以1,500 rpm转速运行的电动PTFE研杵匀浆样品。缓慢将研杵以扭转动作压入样品中，重复10次。接着，用玻璃移液管将黏稠的黄色上清液转移至一支洁净的1.7毫升离心管中。现在使用一半量的尿素对剩余样品重复匀浆步骤。收集上清液，并与前次收集的上清液合并。接着，将离心管置于旋转混合仪上旋转30分钟。30 分钟后，将离心管放入预冷的离心机中，在 13,000 G 条件下离心 30 分钟。然后收集上清液，并使用 Bradford 蛋白质定量法测定蛋白浓度。在完成规定的实验方案后，经过一些额外处理，采用多种方法对蛋白质提取物进行了研究。通过二维电泳、液相等电聚焦、液相色谱-质谱联用以及二维液相色谱-质谱联用技术，在二尖瓣组织中鉴定出共计422种蛋白质。利用基因本体论分析对这422种蛋白质进行了分类。细胞外区域包含多种预期的蛋白质，以及其他细胞内和细胞表面蛋白质，其中许多蛋白质为首次在二尖瓣中鉴定到。通过抗体在三个独立样本中证实了四种此前未在二尖瓣中发现的蛋白质的存在。这些蛋白质包括Septin-11、含四个半LIM结构域的蛋白1（Four and a half LIM domains protein one）、皮肤桥蛋白（Dermatoponin）和α晶状体蛋白B（alpha crystalline B）。观看本视频后，您应能够充分理解如何从心脏二尖瓣中提取蛋白质，以进行其鉴定与定量分析。一旦掌握该方法，若操作得当，整个流程可在近两小时内完成。在实施该实验过程中，为获得最大蛋白质得率并保持蛋白质完整性，至关重要的是样品在任何转移步骤中均不得解冻。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

从人体二尖瓣提取蛋白质的优化方案

由于可获取的组织量有限，对早期胚胎小鼠瓣膜中蛋白质表达的分析一直受到阻碍。本论文提供了一种从发育中的胚胎小鼠瓣膜区域提取蛋白质以进行蛋白质印迹分析的实验方案。...

从小鼠胚胎心脏瓣膜发育区域分离蛋白质

我们已建立一种利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统纯化共调节相互作用蛋白的方法。...

一种用于通过LC-MS/MS分析高通量鉴定与核辅因子相互作用蛋白的蛋白质制备方法

本文介绍了一种应用于Arabidopsis...

植物原生质体mRNA相互作用组捕获

由于线粒体仅占植物细胞的一小部分，因此需要对其进行纯化以开展多种研究。可通过匀浆处理，随后进行差速离心和密度梯度离心，从多种植物器官中分离得到高度纯化的线粒体组分。...

线粒体的分离与呼吸功能测定 拟南芥

线粒体具有特化的核糖体，这些核糖体与其细菌和细胞质中的对应物存在差异。本文展示了如何从HEK细胞的天然区室中获取线粒体核糖体。该方法包括从悬浮细胞中分离线粒体，进而纯化线粒体核糖体。...

快速分离HEK细胞中的线粒体核糖体

本文介绍了一种在离体灌注小鼠心脏上进行多聚核糖体分析的实验方案。我们描述了心脏灌注、多聚核糖体分析的方法，以及针对多聚核糖体组分中mRNA、miRNA和多聚核糖体蛋白质组的分析方法。...

离体小鼠心脏Langendorff灌注后多聚核糖体的动态蛋白质组学与miRNA分析

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

本文介绍一种提取、分离和鉴定线粒体超复合体的方案，该方案最大限度地减少了去垢剂和考马斯亮蓝的使用。此方法在分辨率与酶活性保持之间实现了最佳平衡，同时降低了不稳定蛋白质-蛋白质相互作用丢失的风险。...

用于分离与分析线粒体呼吸链超复合物的混合型透明/蓝色天然电泳

我们提出了一种两步法高纯度线粒体分离方案，适用于蛋白质组水平的蛋白质鉴定与定量分析。该方案无需基因工程操作，因此适用于从任何原代细胞和组织中提取线粒体进行研究。...

无标记两步法分离线粒体以提升蛋白质发现与定量

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。...

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

线粒体的生物能量学和代谢组学研究揭示了其在多种疾病中的多重作用，但这些细胞器的分离方法各不相同。本文详述的方法能够从多种组织来源中纯化出高质量的线粒体。其质量通过高分辨率呼吸测定法评估的呼吸控制比及其他指标来确定。...

从啮齿类动物心脏组织中稳健分离线粒体

学习从人体二尖瓣高效提取蛋白质的方法，用于蛋白质组学分析。该方案有助于识别心脏瓣膜病的新型诊断标志物和治疗靶点，同时适用于猪二尖瓣等实验模型。

优化的人类二尖瓣蛋白质提取方案

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