优化的人类二尖瓣蛋白质提取方案

本实验的主要目标是从人心脏二尖瓣中高效提取适用于蛋白质组学分析的蛋白质。该方法有望揭示心脏瓣膜疾病领域的致病机制，从而鉴定出新的诊断和预后标志物，并有望发现治疗靶点。本方案的主要优势在于提供了一种高效的提取流程，可兼容多种分析应用。

结果将实现对心脏二尖瓣蛋白质组更全面的表征。此外，该方案还可应用于其他系统，例如与人类二尖瓣高度相似的猪二尖瓣，后者常用于瓣膜功能评估的实验模型。本次实验操作的示范由本实验室的技术员 Stefania Ghilardi 完成。

准备人二尖瓣时，首先获取一个已处于4至12小时冷缺血状态的移植后心脏。在洁净室中，将心脏从转运袋中取出，并放入一个已灭菌的容器内。随后，将心脏转移至生物安全柜中。

在此处，使用一次性手术刀，在左右心室水平、距心尖约4厘米处，垂直于心脏长轴进行切割。然后将心脏置于无菌手术单上。接着，移开升主动脉和肺动脉，以暴露左心房顶部。

在左心房顶部，使用镊子和解剖针围绕左心耳进行剪切，以暴露二尖瓣。二尖瓣完全位于左心室内，因此需暴露前叶（大瓣叶）和后叶（小瓣叶）。

前外侧和后内侧交界处界定了前区和后区的边界。现在，使用剪刀和无创镊子解剖左心房以及围绕二尖瓣的室壁厚度。在解剖过程中，辨认二尖瓣与主动脉瓣的连续结构。

接下来，沿后叶侧的交界处剪开，将二尖瓣前叶与二尖瓣后叶分离。操作完成后，使用70%异丙醇溶液和6%过氧化氢溶液对柜内台面进行消毒。随后，用生理盐水清洗二尖瓣的后叶。

然后，将瓣膜切成小块，每块小于1平方厘米。用铝箔单独包裹各组织块，并用液氮速冻。开始蛋白质提取时，用镊子从液氮中取出一个样品，并立即置于干冰上。

切勿让样品解冻。接下来，将研钵、配套的研杵以及样品放入装有液氮的杜瓦瓶中。必须使用液氮冻结样品并对研磨系统进行预冷。

此步骤可防止生物降解并实现高效研磨，但需要经过技术培训以确保安全操作。速冻完成后，将研钵和研杵放入装有干冰的聚苯乙烯盒中。同时，将一把刮勺也置于干冰上。

接下来，将样品从铝箔上取下并装入研钵中。将较大的研杵置于其上方。使用螺丝刀旋转研杵，研磨样品15至20次。

研磨过程中，使用预冷的刮勺尖端混合样品。使用大研杵研磨后，换用较小的研杵重复研磨过程。获得细粉对高效的蛋白质提取至关重要。

现在，将粉末样品倒入已知质量的15毫升离心管中。然后用冷却的刮刀将残留的材料刷入研钵中。将装有样品的离心管置于干冰上，并迅速测定样品的质量。

接下来，将样品倒入玻璃匀浆管中。然后，每10毫克样品加入200微升尿素缓冲液。在此过程中，用尿素缓冲液冲洗并回收残留在管中的样品残留物。

现在使用以1,500 rpm转速运行的电动PTFE研杵匀浆样品。缓慢将研杵以扭转动作压入样品中，重复10次。接着，用玻璃移液管将黏稠的黄色上清液转移至一支洁净的1.7毫升离心管中。

现在使用一半量的尿素对剩余样品重复匀浆步骤。收集上清液，并与前次收集的上清液合并。接着，将离心管置于旋转混合仪上旋转30分钟。

30 分钟后，将离心管放入预冷的离心机中，在 13,000 G 条件下离心 30 分钟。然后收集上清液，并使用 Bradford 蛋白质定量法测定蛋白浓度。

在完成规定的实验方案后，经过一些额外处理，采用多种方法对蛋白质提取物进行了研究。通过二维电泳、液相等电聚焦、液相色谱-质谱联用以及二维液相色谱-质谱联用技术，在二尖瓣组织中鉴定出共计422种蛋白质。利用基因本体论分析对这422种蛋白质进行了分类。

细胞外区域包含多种预期的蛋白质，以及其他细胞内和细胞表面蛋白质，其中许多蛋白质为首次在二尖瓣中鉴定到。通过抗体在三个独立样本中证实了四种此前未在二尖瓣中发现的蛋白质的存在。

这些蛋白质包括Septin-11、含四个半LIM结构域的蛋白1（Four and a half LIM domains protein one）、皮肤桥蛋白（Dermatoponin）和α晶状体蛋白B（alpha crystalline B）。观看本视频后，您应能够充分理解如何从心脏二尖瓣中提取蛋白质，以进行其鉴定与定量分析。一旦掌握该方法，若操作得当，整个流程可在近两小时内完成。在实施该实验过程中，为获得最大蛋白质得率并保持蛋白质完整性，至关重要的是样品在任何转移步骤中均不得解冻。