从人体二尖瓣提取蛋白质的优化方案
June 14th, 2017
人二尖瓣的蛋白质组成仍然是部分未知的，因为其分析由于细胞数量低，因此通过低蛋白质生物合成而复杂化。这项工作提供了有效提取蛋白质用于二尖瓣蛋白质组分析的方案。
该程序的总体目标是有效地从人心脏二尖瓣中提取蛋白质，适用于蛋白质组学分析。这种方法可能有助于揭示心脏瓣膜病领域的致病机制，从而可以识别新的诊断和预后疾病标志物，并有望识别治疗靶点。该方案的主要优点是它提供了与许多分析应用兼容的高效提取工作流程。
结果是对心脏二尖瓣蛋白质的更详尽的描述。此外，该协议还可以应用于其他系统，例如猪二尖瓣，它与人类瓣膜非常相似，用于瓣膜功能评估的实验模型。演示实验程序的是我实验室的技术人员 Stefania Ghilardi。
要准备人类二尖瓣，首先要使心脏外植，该心脏已经处于冷缺血状态 4 到 12 小时。在洁净室中，从运输袋中取出心脏，然后将其放入消毒桶中。接下来，将心脏转移到生物安全柜中。
在那里，使用一次性手术刀，在左心室和右心室水平上垂直于长轴切割，距心尖约 4 厘米。然后将心脏放在无菌窗帘上。然后，将升主动脉和肺动脉移到一边，进入左心房顶部。
在左心房顶部，使用镊子和镐子在左耳廓周围切开，露出二尖瓣。二尖瓣完全包含在左心室中。因此，暴露二尖瓣大叶和小二尖瓣叶。
前外侧和后内侧连合定义了前区和后区的边界。现在，用剪刀和非创伤镊子解剖左心房和围绕二尖瓣的脑室壁厚度。在解剖过程中，确定二尖瓣主动脉瓣的连续性。
接下来，通过沿着后瓣叶周围的连合切开，将二尖瓣前瓣叶与二尖瓣后瓣叶分开。程序完成后，用 70% 异丙醇溶液和 6% 过氧化氢溶液对柜子的桌子进行消毒。现在，用盐水清洗二尖瓣的后叶。
然后，将阀门切成小块，每块小于一平方厘米。用铝箔单独包裹这些碎片，然后用液氮快速冷冻。要开始蛋白质提取，请使用镊子从液氮中取出样品，并立即将其放在干冰上。
不要让样品解冻。接下来，将研钵、相关研杵和样品放入装满液氮的杜瓦瓶中。使用液氮冷冻样品和冷却研磨系统至关重要。
此步骤可防止生物降解并允许高效粉末化，但需要技术培训才能安全处理。速冻后，将研钵和研杵放入装有干冰的聚苯乙烯盒中。另外，将抹刀放在干冰上。
接下来，从箔纸中取出样品并将其装入砂浆中。并将较大的杵放在其上方。使用螺丝刀旋转杵，研磨样品 15 至 20 次。
研磨时，用冰镇的刮刀尖端混合样品。使用大杵后，用较小的杵重复研磨过程。获得细粉对于高效蛋白质提取至关重要。
现在，将粉末状样品倒入已知质量的 15 毫利特离心管中。然后用冷刮刀将任何剩余的材料刷入砂浆中。将装有样品的试管放在干冰上，并快速确定样品的质量。
接下来，将样品倒入玻璃均质管中。然后，每 10 毫克样品加入 200 微升尿素缓冲液。在此过程中，通过用尿素缓冲液等分试样冲洗来回收管中残留的残留物。
现在使用以 1， 500 rpm 运行的电动 PFTE 杵对样品进行均质化。以扭转动作将杵慢慢压在样品上 10 次。接下来，使用玻璃移液管将粘稠的黄色上清液转移到干净的 1.7 ml 离心管中。
现在使用一半的尿素对剩余的样品重复均质化。回收上清液并将其与先前的集合混合。接下来，将试管放在试管旋转器上 30 分钟。
30 分钟后，将试管装入冷离心机中，并以 13， 000 G 的离心速度将样品离心半小时。然后，回收上清液。并使用 Bradford 蛋白测定法测量蛋白质浓度。
在执行规定的方案后，经过一些额外的处理后，使用多种方法研究蛋白质提取物。通过二维电泳、液相等电聚焦、液相色谱-质谱和 2D 液相色谱-质谱在二尖瓣组织中共鉴定出 422 种蛋白质。使用 Gene Ontology 分析对 422 个蛋白质进行分类。
细胞外区域包含几种预期的蛋白质和其他细胞内和细胞表面蛋白。其中许多是首次在二尖瓣中发现的。在三个独特样本中用抗体证实了二尖瓣中先前未发现的四种此类蛋白质的存在。
这些蛋白质是 Septin-11、四个半 LIM 结构域、蛋白质 1、皮细胞红蛋白和 α 结晶 B.看完这个视频，您应该对如何从心脏二尖瓣中提取蛋白质进行鉴定和定量有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这个协议可以在近两个小时内完成。在尝试此程序时，为了获得具有高蛋白质完整性的最大蛋白质产量，样品在任何转移过程中都不要解冻，这一点至关重要。
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概述
本协议旨在高效提取人心脏二尖瓣中的蛋白质，用于蛋白质组学分析。它可以帮助识别心脏瓣膜疾病中的新型诊断和预后标志物。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏生物学
- 蛋白质组学
- 瓣膜性心脏病
背景
- 人心脏二尖瓣的蛋白质组成尚未完全了解。
- 低细胞性使蛋白质分析复杂化。
- 了解二尖瓣蛋白质组对心脏健康至关重要。
- 本协议也可应用于猪二尖瓣。
研究目的
- 提供从二尖瓣中提取蛋白质的高效方法。
- 促进蛋白质组学分析，以更好地理解心脏瓣膜疾病。
- 识别潜在的治疗靶点和疾病标志物。
使用方法
- 人心脏二尖瓣的蛋白质提取方案。
- 与各种分析应用兼容。
- 由实验室技术员演示。
- 在实验模型中的潜在应用。
主要结果
- 建立了高效的提取工作流程。
- 对二尖瓣蛋白质组进行了更全面的表征。
- 本协议适用于其他类似系统。
- 了解瓣膜疾病的致病机制。
结论
- 本协议增强了对二尖瓣生物学的理解。
- 它可能会导致新的诊断和治疗途径的发现。
- 进一步的研究可以以此为基础。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in cardiovascular target validation by enabling efficient protein extraction from low-cellularity, matrix-rich tissues like the human mitral valve. By supporting comprehensive proteomic profiling, it facilitates mechanistic de-risking of therapeutic targets in cardiac valve disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular phenotypes to pathogenic mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein identification in disease-relevant tissue.
- Operational Value: Provides a standardized workflow for extracting proteins from challenging extracellular matrix-rich samples.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery and target prioritization by uncovering novel disease-associated proteins.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates protein extracts compatible with downstream applications such as immunoblotting and mass spectrometry.
- Reproducibility: Establishes a consistent extraction process critical for assay standardization across laboratories.
- Scalability: Permits application to model systems like porcine mitral valve for cross-species target validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links protein expression data with mRNA and immunohistochemical analyses for multi-omics validation.
- Mechanistic De-risking: Identifies intracellular and extracellular proteins not previously detected in mitral valves, clarifying disease mechanisms.
- Preclinical Relevance: Enables target validation in models that closely resemble human valve physiology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation by providing reliable molecular readouts from diseased tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via comprehensive proteomic characterization of the mitral valve.
- Screening: Delivers quantifiable protein outputs suitable for screening campaigns targeting valve pathology.
- Analytics: Enables comparative analysis of protein expression profiles across conditions using Bradford assay and electrophoresis.
- Translational Research: Facilitates correlation of proteomic data with mRNA and immunohistochemical findings.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteomic preparation platform for cardiovascular target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by revealing previously undetected proteins in mitral valve tissue.
- Operational Value: Ensures sample integrity through cold-chain handling and prevents degradation during extraction.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing mechanistic insights into valve disease pathways.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through comprehensive molecular profiling of disease tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection and cold-sample handling to prevent thawing.
- Needs access to cryogenic equipment (liquid nitrogen, dry ice) and motorized homogenization tools.
- Demands standardized protocols across teams to ensure reproducible protein yields.
- Must account for tissue variability when adapting to different valve models or disease states.
- Limited by starting material availability; dependent on access to explanted human or porcine valves.
