G2-seq: 一种基于高通量测序技术的基因组晚期复制区域识别方法
March 22nd, 2018
我们描述了一种将流式细胞术和高通量测序相结合的技术来识别基因组的晚期复制区域。
该程序对根据细胞周期阶段进行流式分选的细胞的 DNA 进行深度测序的总体目标是识别在细胞周期中复制极晚的基因组区域。这种方法可以帮助回答 DNA 复制领域的关键问题，例如基因组的哪些区域难以完成 DNA 复制，因此特别容易受到基因组重排的影响。该技术的主要优点是，尽管从实验的角度来看非常简单，但它为基因组复制的动力学提供了令人惊讶的丰富视图。
首先，用感兴趣的酵母细胞接种 15 毫升含有 8 毫升 YEPD 的试管。合成或富介质是可以接受的。将细胞培养过夜至少 12 小时，以便在其实际对数期分布期间收集它们。
第二天，当培养物的密度达到每毫升 5 至 1500 万个细胞时，旋转细胞并将其重悬于 1.5 毫升 70% 乙醇中。然后将悬浮液转移到 1.6 mL 微量离心管中，让细胞在室温下孵育一小时或在冰上孵育至少三小时。接种后，旋转细胞并将其重悬于 1 毫升柠檬酸钠中。
最后，对细胞进行短暂超声处理两次。然后重复离心循环，将酵母重悬于一毫升含有 RNase 的柠檬酸钠中。让 RNase 在 50 摄氏度下与酵母反应一小时，或在 37 摄氏度下在加热块或水浴中过夜。
RNase 处理后，向混合物中加入 50 微升蛋白酶 K 溶液，并在 50 摄氏度下继续反应一小时。然后旋转细胞，将细胞重悬于一毫升柠檬酸钠中。接下来，离心细胞并使用真空吸出上清液。
然后在昏暗的光线下，将细胞重悬于一毫升柠檬酸钠中，并进行绿色核酸染色。现在在室温下避光在酵母中孵育一小时。为了继续，使用使用 530 纳米发射数据的细胞分选仪对细胞进行计数。
根据它们的 DNA 含量将它们分为细胞周期期、G1 S 期、G2 早期和 G2 晚期。从每个阶段收集至少 160 万个单倍体细胞。分选细胞后，立即将它们旋转 20 分钟。吸出上清液并在零下 20 摄氏度下冷冻沉淀以储存。
我们发现，该程序最关键的步骤是在收集细胞后立即将细胞旋转，分选后最多一个小时。该提取基于酵母基因组 DNA 提取试剂盒。首先加入 120 微升消化缓冲液和 5 微升酵母裂解酶。
然后使用涡旋将细胞混合到反应混合物中，并在 37 摄氏度下孵育混合物 40 至 60 分钟。接下来，加入 120 μL 裂解缓冲液，高速涡旋混合物 10 至 20 秒。然后加入 250 微升氯仿，将试管内容物充分混合 1 分钟。
接下来，以最大速度将试管向下旋转两分钟。然后将上清液转移到 DNA 结合柱上。使用 1 分钟的最大速度离心循环将上清液离心穿过色谱柱。
要洗涤柱膜上的 DNA，请将柱转移到新的收集管中，并加入 300 μL DNA 洗涤缓冲液。然后以最大速度重复离心 1 分钟。再重复一次此洗涤步骤。
要收集 DNA，请将离心柱转移到新试管中。加入 60 微升水，等待 1 到 3 分钟。然后以最大速度离心色谱柱 10 秒，以分离含有洗脱 DNA 的水。
现在加入 5 至 195 μL 双链 DNA 高灵敏度缓冲液，其中含有浓度为 1 至 200 的试剂。然后测量样品的荧光以计算产量。预计收集 10 到 50 ng 的 DNA。
现在使用超声处理将 DNA 分解成 250 到 350 个碱基对之间的片段。然后使用标准试剂盒制备 DNA 文库，并使用至少 1000 万个 50 个碱基对单端读数对其进行测序。所描述的程序用于鉴定出芽酵母中的晚期复制位点。
将正常细胞与缺乏脱乙酰酶蛋白 Sir2 的细胞进行比较。原始数据包含较大的峰值，主要是由于 TY 元素的存在。通过将每个样品的读取深度限制为中位红色深度的 2.5 倍来去除这些尖峰。
然后用 20 kb 的滑动窗口对去加标的数据进行平滑处理。最后，对数据进行归一化并绘制为 G1 中水平的比率。完全未复制的单元格将显示为 0.5，完全复制的单元格将显示为 1。在来自 7 号染色体的这些数据中，有证据表明 Sir2 突变体中存在已知的晚期复制区域。
观看此视频后，您应该对如何识别基因组中最后完成 DNA 复制的区域有一个很好的了解，因此这些区域特别容易受到 DNA 断裂和其他与晚期复制相关的问题的影响。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了一种结合流式细胞术和高通量测序以识别基因组晚期复制区域的技术。该方法提供了基因组复制动力学的见解，并有助于解决DNA复制领域的关键问题。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 细胞周期分析
- DNA复制
背景
- 了解基因组的晚期复制区域对于研究DNA复制至关重要。
- 这些区域可能易受基因组重排的影响。
- 流式分选允许基于细胞周期阶段分离细胞。
- 高通量测序提供了基因组动力学的全面视图。
研究目的
- 识别细胞周期晚期复制的基因组区域。
- 探索DNA不完全复制的影响。
- 增强对基因组稳定性和重排的理解。
使用的方法
- 流式细胞术根据细胞周期阶段对细胞进行分选。
- 对分选后的细胞进行DNA深度测序。
- 在YEPD培养基中培养酵母细胞。
- 过夜孵育以达到对数期分布。
主要结果
- 该技术揭示了基因组复制动力学的丰富视图。
- 识别的晚期复制区域可能指示易受不稳定性影响的区域。
- 简单的实验设计产生了重要的见解。
- 为DNA复制的进一步研究提供了框架。
结论
- 这种方法对于研究基因组晚期复制是有效的。
- 它可以帮助识别DNA复制中的脆弱性。
- 该方法对该领域的研究人员来说是可访问和信息丰富的。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying late-replicating genomic regions provides critical insights into chromosomal instability, a key factor in oncogenesis and aging-related pathologies. This technique enables early detection of genomic regions prone to breakage and mutation, supporting target validation in DNA damage response pathways. By linking replication timing to functional vulnerability, it enhances predictive confidence in preclinical models of genome maintenance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of replication timing as a biomarker for genomic instability in disease models.
- Operational Value: Combines flow cytometry with sequencing to isolate and analyze phase-specific DNA populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide replication timing profiles for comparative screening.
- Operational Value: Standardized workflow using DNA content sorting and library preparation supports assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals regions with elevated breakage and mutation rates, informing mechanistic de-risking of genome stability targets.
- Operational Value: Enables comparison between wild-type and mutant backgrounds (e.g., Sir2) to assess genetic modifiers of replication timing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery by providing functional genomic data that informs target selection and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of replication timing effects on genomic stability and chromosomal integrity.
- Screening: Delivers normalized, spiking-corrected sequencing data enabling quantitative comparison of replication completion across conditions.
- Analytics: Uses sliding window smoothing and G1-normalized ratios to produce interpretable replication timing maps.
- Translational Research: Connects late replication to phenotypic outcomes like breakage and mutation, supporting translational biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any flow-sortable cell type, enabling cross-project application in mammalian or yeast systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in identifying mechanistically vulnerable genomic loci.
- Operational Value: Standardized, scalable workflow from cell sorting to sequencing library preparation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by highlighting targets associated with replication stress and instability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets based on replication timing vulnerability.
Implementation Considerations
- Expertise in flow cytometry, nucleic acid extraction, and next-generation sequencing library preparation.
- Instrumentation for cell sorting, sonication, and high-throughput sequencing platforms.
- Standardization of spike removal (capping read depth) and smoothing parameters across samples.
- Adaptation considerations for varying genome sizes and cell types beyond yeast.
- Practical limitation: Requires sufficient cell numbers (1.6M per phase) and careful timing post-sort to prevent degradation.
