Name: G2-seq: 一种基于高通量测序技术的基因组晚期复制区域识别方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 了解G2-seq方法如何结合流式细胞术与高通量测序技术识别基因组晚期复制区域。该技术为研究DNA复制动态和基因组稳定性提供了简单而有效的实验框架。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）GM117446基金对A.B.的资助。

1. 流式细胞分选的细胞准备
<ol>
	<li>将酵母接种于含有8 mL YEPD液体培养基的15 mL试管中，使过夜培养后菌液浓度达到每毫升5 × 106 至1.5 × 107 个细胞（参见讨论部分注释1）。</li>
	<li>在15 mL带螺帽的离心管中，于室温或4 °C条件下以1,400 × g离心5分钟，沉淀酵母细胞；用1.5 mL 70%乙醇重悬细胞，转移至1.6 mL微量离心管中，室温静置1小时，或冰上静置至少3小时（可在4 °C长期保存）（参见讨论部分第(2)点）。</li>
	<li>在微量离心机中以14,000 × g、4 °C离心1分钟，沉淀细胞；用1 mL pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液重悬细胞，再次以14,000 × g、4 °C离心1分钟；吸除上清液后，用含0.25 mg/mL RNase溶液的1 mL pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液重悬细胞，于50 °C加热块或水浴中孵育1小时，或于37 °C过夜孵育。</li>
	<li>加入50 µL蛋白酶K溶液（20 mg/mL，溶于10 mM Tris pH 7.5、2 mM CaCl2、50% w/v甘油），于50 °C孵育1小时。</li>
	<li>以14,000 × g、4 °C离心沉淀细胞，用1 mL pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液重悬细胞，再次以14,000 × g、4 °C离心；用真空泵吸除上清液后，用1 mL溶于pH 7.2的50 mM柠檬酸钠缓冲液中的1 µM Green核酸染料重悬细胞，室温避光孵育1小时，随后超声处理2次，每次2秒（输出功率2瓦）。</li>
</ol>
2. 细胞分选
<ol>
	<li>使用细胞分选仪，根据DNA含量将细胞分选至G1期、S期、&#34;早期G2期&#34;和&#34;晚期G2期&#34;，每个细胞周期阶段至少收集160万个单倍体细胞，如图1所示（见讨论部分第(3)点）。</li>
	<li>将细胞转移至微量离心管中，在4 °C条件下，于微量离心机中以14,000 × g离心20分钟，并用真空装置吸除上清液（沉淀物可于-20 °C长期冻存；见讨论部分第(4)点）。</li>
</ol>
3. DNA 提取与测序文库的制备
注意：以下步骤基于 &#34;方案 I&#34; 在酵母基因组DNA提取试剂盒中（参见 材料表).
<ol>
	<li>加入120 µL &#34;Digestion Buffer"（一种专有缓冲液，可使酵母裂解酶消化细胞壁）和5 µL酵母裂解酶，涡旋重悬，并在37 °C孵育40 - 60分钟。</li>
	<li>加入120 µL &#34;Lysis Buffer"（一种含有去污剂的专有缓冲液），剧烈涡旋10 - 20秒。</li>
	<li>加入250 µL氯仿，充分混匀1分钟。</li>
	<li>在微量离心机中以最大速度离心2分钟。</li>
	<li>将上清液转移至DNA结合柱中，在微量离心机中以最大速度离心1分钟。</li>
	<li>加入300 µL &#34;DNA Washing Buffer"（一种含有乙醇的专有缓冲液），在微量离心机中以最大速度离心1分钟。弃去穿流液，再加入300 µL DNA Wash Buffer，重复洗涤步骤。</li>
	<li>将离心柱转移至新的微量离心管中，加入60 µL水（非TE缓冲液），静置1 - 3分钟，然后离心10秒以洗脱DNA。</li>
	<li>通过将5 µL DNA加入已用dsDNA高灵敏度缓冲液稀释1:200的195 µL dsDNA高灵敏度试剂中测定浓度，使用荧光计检测荧光强度，并用提供的标准品（10 µL）进行校准；预期总DNA产量为10 - 50 ng。</li>
	<li>进行超声处理（峰值入射功率450，占空比30%，每脉冲周期200次，处理时间60秒，水位6），将DNA打断为250 - 350 bp的片段。</li>
	<li>使用DNA样本制备试剂盒构建文库，并在DNA测序仪上以快速模式进行测序（至少获得1000万条50 bp的单端读长）（参见讨论部分注释(5)）。</li>
</ol>
4. 测序数据分析与复制谱图的生成
<ol>
	<li>使用 Gsnap12 将序列比对至 Saccharomyces cerevisiae sacCer3 基因组（参见讨论说明 (6)）。</li>
	<li>使用 Bedtools 的 &#34;genomeCoverageBed&#34; 软件13 确定每个碱基对的测序深度。</li>
	<li>若存在测序深度中的假性尖峰，则予以去除（参见讨论说明 (7)）。</li>
	<li>在 R 软件包 &#34;caTools&#34; 中使用 &#34;runMean&#34; 函数，以 20 kb 滑动窗口的中位数对染色体上的测序深度进行平滑处理（参见讨论说明 (8)）。</li>
	<li>将 S 期、早期 G2 期和晚期 G2 期的测序深度绘制成完全复制时测序深度的百分比（参见讨论说明 (9)）。</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管该技术具有较强的稳健性且相对简单直接，但仍需特别注意以下事项：
(1) 我们建议培养物在达到对数生长期前至少培养12小时，因为如果在接种后仅4小时达到目标密度即收获培养物，细胞周期分布会出现差异。我们的假设是，细胞周期分布达到相对稳定的平衡状态时，更能代表一个 &#34;真实&#34; 对数期分布比将饱和培养物较晚转移至新鲜培养基时仍处于动态变化的分布更为稳定。
（2）固定细胞时，无需先将细胞离心沉淀，也可直接向酵母培养物中加入100%乙醇，使乙醇的终浓度为70%。细胞可在合成培养基或丰富培养基（YEPD）中培养。
（3）通过绘制细胞数量与530 nm发射光面积的关系图，可对细胞周期各时相进行可视化以实现分选。我们发现，G1期与S期之间以及S期与G2期之间的拐点可作为界定S期的可靠标志，而我们将G2期信号峰值用作划分早期G2和晚期G2的边界。为表述清晰和简洁，我们使用&#34;早期G2&#34;和&#34;晚期G2&#34;的术语，尽管从技术上讲，细胞在完成DNA复制...

真核生物基因组的复制起始于多个离散位点，称为复制起点，从这些位点出发，复制叉向两个方向延伸（参见Fragkos et al., 20151的综述）。复制起点在激活的时间和效率上各不相同，为此已发展出多种技术用于监测复制起点的活性，并揭示这种差异的成因。单个复制起点的活性可通过检测单链DNA的水平2来推断，因为单链DNA会在活跃的复制起点周围形成；也可通过二维凝胶电泳技术监测特定的复制中间产物3，上述两种方法均可使用放射性探针进行检测。由于在S. cerevisiae中复制起点局限于特定的已知序列，因此这两种技术在该酵母中的应用比在哺乳动物细胞中更为简便。随着微阵列技术的出现，人们得以在全基因组范围内评估复制起点的激活情况。最初的方法是用重同位素标记DNA，将细胞从G1期阻滞中释放至含有轻同位素的培养基中，随后监测全基因组范围内重-轻杂合DNA的形成4。高通量测序技术的引入使得无需昂贵的同位素标记即可实现对复制起点活性的全基因组监测。通过流式细胞仪根据DNA含量对细胞进行分选，并对其DNA进行深度测序。由于在S期过程中序列覆盖度从1x逐步增加到2x，因此可通过比较S期细胞与G1期或G2期细胞的测序读段深度来评估相对复制时间5,6。这些技术，尤其是应用于酵母的研究，加深了我们对DNA序列、染色质结构以及DNA复制相关蛋白如何调控复制起点的时间和效率的理解。
细胞增殖过程中遗传信息的准确传递不仅依赖于在复制起始位点成功启动DNA复制，还需要在复制叉相遇的位置顺利完成复制过程。与复制起始类似，复制完成的时间在基因组不同区域存在差异，某些区域即使在细胞周期的后期仍保持未复制状态。这些区域可能距离活跃的复制起始位点较远，或含有阻碍DNA聚合酶的序列或染色质结构。晚期复制区域可能表现为脆性位点，与染色体断裂和较高的突变率相关，并已被认为与癌症和衰老有关7,8,9。然而，尽管DNA复制正确完成对于维持基因组稳定性至关重要，我们对这一过程发生的位置及机制的理解仍远远落后于对复制起始的认识。虽然已有研究利用qPCR等方法对某些因晚期复制而与疾病相关的特定基因进行了分析10，但针对晚期复制的全基因组范围研究，尤其是对其发生位置和根本原因的系统性探索仍十分缺乏。本文中，我们描述了一种称为&#34;G2 seq&#34;的技术，该技术将流式细胞术与高通量测序相结合，以揭示酵母基因组复制完成的过程11。通过少量修改，本实验方案可适用于任何可根据DNA含量进行流式分选的细胞类型。

<table><tbody><tr><td>YeaStar 基因组 DNA 试剂盒</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>用 50 mM 柠檬酸钠（pH 7.2）重悬</td></tr><tr><td>50 mM 柠檬酸钠，pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 溶液（0.25 mg / mL）</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>将 0.25 mg / mL RNaseA 重悬于 50 mM 柠檬酸钠（pH 7.2）中，首次使用前煮沸 10 分钟，之后储存于 -20&amp;deg;</td></tr><tr><td>蛋白酶 K 溶液（20 mg / mL）</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>用 10 mM Tris（pH 7.5）、2 mM CaCl₂、50% 甘油重悬，储存于 -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 超声破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD 生物科学 FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III 离心柱</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 专注式超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT 样品制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 测序仪</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap 比对软件</td><td>开源软件 / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

已开发出多种技术用于追踪DNA复制在细胞周期S期中的进程。其中大多数技术主要致力于阐明基因组复制起始的位置和时间，而非复制完成的过程。然而，了解基因组中最后完成复制的区域至关重要，因为这些区域更容易发生染色体断裂和突变，并且与疾病及衰老密切相关。本文介绍了我们如何改进一种原本用于监测复制起始的技术，以识别基因组中最后完成复制的区域。该方法结合了流式细胞术和高通量测序技术。尽管本报告重点描述该技术在酵母中的应用，但该方法可适用于任何能够根据DNA含量通过流式细胞仪进行分选的细胞。

我们已采用上述方法鉴定出芽殖酵母中复制较晚的位点。利用人工染色体上已知的复制晚期区域对该方法进行测试，结果证明该技术准确且可靠。我们的研究结果还揭示了复制过程适时完成的重要生物学意义：在7号染色体上，我们根据G2-seq结果鉴定出的一个复制晚期区域，其丢失频率比相应的对照区域高出约三倍11。
G2-seq 结果的一个具体示例如 图2 所示。我们曾假设，在缺乏一种称为 Sir2 的蛋白质去乙酰化酶的细胞中，基因组中某些区域会特别晚进行复制。图2A 展示了野生型（蓝色）和 sir2 突变型（红色）数据处理的逐步过程。原始数据（上方行）包含大量尖峰，其中大多数是由于 Ty 元件的存在所致。通过将每个样本的测序深度限制在其中位数的 2.5 倍以内，可去除这些尖峰（中间行）。去尖...

我们描述了一种将流式细胞术与高通量测序相结合的技术，用于鉴定基因组中晚期复制的区域。

G2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

已开发出多种技术用于追踪DNA复制在细胞周期S期中的进程。其中大多数技术……

本实验流程的总体目标是通过对处于不同细胞周期阶段并经流式分选的细胞进行深度测序，以鉴定基因组中在细胞周期极晚期才发生复制的区域。该方法有助于解答DNA复制领域中的关键科学问题，例如基因组中哪些区域难以完成DNA复制，因而更容易发生基因组重排。该技术的主要优势在于，尽管其实验操作极为简便，却能够提供关于基因组复制动态的丰富信息。首先，将目标酵母细胞接种于含有8毫升YEPD培养基的15毫升试管中。可使用合成培养基或丰富培养基。将细胞在至少12小时的过夜培养中生长，以在其真正的对数生长期收集细胞。第二天，当培养物密度达到每毫升500万至1500万个细胞时，离心收集细胞，并将其重悬于1.5毫升70%乙醇中。随后将悬液转移至1.6毫升微量离心管中，室温孵育1小时，或冰上孵育至少3小时。接种后，离心收集细胞，并将其重悬于1毫升柠檬酸钠溶液中。最后，将细胞短暂超声处理两次。然后重复离心步骤，将酵母重悬于1毫升含RNase的柠檬酸钠溶液中。将样品置于50摄氏度的加热块或水浴中反应1小时，或在37摄氏度下过夜。RNase 处理后，向混合物中加入 50 微升蛋白酶 K 溶液，在 50 摄氏度下继续反应 1 小时。然后离心收集细胞，并将细胞重悬于 1 毫升柠檬酸钠溶液中。接着离心细胞，并用真空泵吸除上清液。然后在弱光条件下，将细胞重悬于1毫升含绿色核酸染料的柠檬酸钠溶液中。接着将酵母在室温下避光孵育1小时。接下来，使用细胞分选仪，根据530纳米的发射光数据对细胞进行计数。根据其DNA含量将细胞按细胞周期时相分为G1期、S期、早期G2期和晚期G2期。从每个时相中收集至少160万个单倍体细胞。分选细胞后立即以20分钟离心沉淀细胞，吸除上清液，并将细胞沉淀在-20摄氏度下冷冻保存。我们发现，该实验流程中最关键的一步是在收集细胞后尽快离心沉淀细胞，分选后最多不超过一小时。该提取方法基于酵母基因组DNA提取试剂盒。首先加入120 µL消化缓冲液和5 µL酵母裂解酶。然后使用涡旋振荡器将细胞混入反应混合物中，在37摄氏度下孵育40至60分钟。接着加入120微升裂解缓冲液，高速涡旋振荡10至20秒。然后加入250微升氯仿，充分混匀管内物质1分钟。接下来，以最大速度离心管子两分钟。然后将上清液转移至DNA结合柱上。使用一分钟最大速度的离心步骤，使上清液通过柱子。为了清洗柱膜上的DNA，将柱子转移到新的收集管中，并加入300微升DNA洗涤缓冲液。然后以最大速度离心一分钟。再重复此洗涤步骤一次。为收集 DNA，将离心柱转移至新的离心管中。加入 60 µL 水，静置 1 至 3 分钟。然后以最大速度离心 10 秒，以收集含有洗脱 DNA 的水溶液。现在加入 5 至 195 微升含有试剂的双链 DNA 高灵敏度缓冲液，试剂浓度为 1:200。然后测定样品的荧光值以计算得率。预期可获得 10 至 50 纳克的 DNA。现在使用超声处理将DNA打断成250至350个碱基对的片段。然后使用标准试剂盒构建DNA文库，并进行测序，测序要求至少1000万条50个碱基对的单端读长。上述方法已被用于鉴定芽殖酵母中的晚期复制位点。将正常细胞与缺乏去乙酰化酶蛋白Sir2的细胞进行了比较。原始数据中存在大量尖峰，主要由TY元件的存在引起。通过将每个样本的测序深度限制在中位测序深度的2.5倍以内，去除了这些尖峰。去尖峰后的数据随后使用 20 kb 滑动窗口进行平滑处理。最后，数据经过标准化，并以 G1 期细胞水平的比值形式绘图。完全未复制的细胞比值为 0.5，而完全复制的细胞比值为 1。在来自 7 号染色体的该数据中，可见 Sir2 突变体中已知的晚期复制区域的证据。观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定基因组中最后完成DNA复制的区域，这些区域由于复制时间较晚，因而特别容易发生DNA断裂及其他相关问题。

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遗传学

G2-seq: 一种基于高通量测序技术的基因组晚期复制区域识别方法

用于NGS测序的基因组DNA富集是研究遗传性突变的一种简便而强大的工具。本文介绍了对11个参与DNA损伤修复的基因进行完整序列分析的实验流程。...

基于转座酶技术的gDNA富集用于NGS分析BRCA1、BRCA2及9个DNA损伤修复相关基因的全序列

亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。...

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

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逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文介绍一种相对快速且简便的方法，用于绘制哺乳动物全基因组复制时间图谱，涵盖从细胞分离到测序结果基础分析的全过程。按照本方案操作后，将获得一份代表性复制程序的基因组图谱。...

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本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

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Gel-seq：一种利用水凝胶基质同时进行DNA和RNA测序文库构建的方法

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

本文介绍一种从哺乳动物细胞中富集内源性RNA结合位点或RNA:蛋白质（RNP）复合物的"足迹”的实验方案。该方法包括对RNP亚基进行两次免疫沉淀，因此被称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT）。...

通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

本文概述了利用二维凝胶电泳分析通过致病性、易形成结构的重复序列进行复制进程的实验步骤。...

基于SV40的人工附加体中通过结构倾向性DNA重复序列的复制电泳分析

本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统能够在模式BY-2体系中实现大规模平行的基因表达与功能研究，且该技术有望拓展应用于非模式作物。...

一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

了解G2-seq方法如何结合流式细胞术与高通量测序技术识别基因组晚期复制区域。该技术为研究DNA复制动态和基因组稳定性提供了简单而有效的实验框架。

G2-seq：一种基于高通量测序技术鉴定基因组晚期复制区域的方法

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