G2-seq: 一种基于高通量测序技术的基因组晚期复制区域识别方法

该程序对根据细胞周期阶段进行流式分选的细胞的 DNA 进行深度测序的总体目标是识别在细胞周期中复制极晚的基因组区域。这种方法可以帮助回答 DNA 复制领域的关键问题，例如基因组的哪些区域难以完成 DNA 复制，因此特别容易受到基因组重排的影响。该技术的主要优点是，尽管从实验的角度来看非常简单，但它为基因组复制的动力学提供了令人惊讶的丰富视图。

首先，用感兴趣的酵母细胞接种 15 毫升含有 8 毫升 YEPD 的试管。合成或富介质是可以接受的。将细胞培养过夜至少 12 小时，以便在其实际对数期分布期间收集它们。

第二天，当培养物的密度达到每毫升 5 至 1500 万个细胞时，旋转细胞并将其重悬于 1.5 毫升 70% 乙醇中。然后将悬浮液转移到 1.6 mL 微量离心管中，让细胞在室温下孵育一小时或在冰上孵育至少三小时。接种后，旋转细胞并将其重悬于 1 毫升柠檬酸钠中。

最后，对细胞进行短暂超声处理两次。然后重复离心循环，将酵母重悬于一毫升含有 RNase 的柠檬酸钠中。让 RNase 在 50 摄氏度下与酵母反应一小时，或在 37 摄氏度下在加热块或水浴中过夜。

RNase 处理后，向混合物中加入 50 微升蛋白酶 K 溶液，并在 50 摄氏度下继续反应一小时。然后旋转细胞，将细胞重悬于一毫升柠檬酸钠中。接下来，离心细胞并使用真空吸出上清液。

然后在昏暗的光线下，将细胞重悬于一毫升柠檬酸钠中，并进行绿色核酸染色。现在在室温下避光在酵母中孵育一小时。为了继续，使用使用 530 纳米发射数据的细胞分选仪对细胞进行计数。

根据它们的 DNA 含量将它们分为细胞周期期、G1 S 期、G2 早期和 G2 晚期。从每个阶段收集至少 160 万个单倍体细胞。分选细胞后，立即将它们旋转 20 分钟。吸出上清液并在零下 20 摄氏度下冷冻沉淀以储存。

我们发现，该程序最关键的步骤是在收集细胞后立即将细胞旋转，分选后最多一个小时。该提取基于酵母基因组 DNA 提取试剂盒。首先加入 120 微升消化缓冲液和 5 微升酵母裂解酶。

然后使用涡旋将细胞混合到反应混合物中，并在 37 摄氏度下孵育混合物 40 至 60 分钟。接下来，加入 120 μL 裂解缓冲液，高速涡旋混合物 10 至 20 秒。然后加入 250 微升氯仿，将试管内容物充分混合 1 分钟。

接下来，以最大速度将试管向下旋转两分钟。然后将上清液转移到 DNA 结合柱上。使用 1 分钟的最大速度离心循环将上清液离心穿过色谱柱。

要洗涤柱膜上的 DNA，请将柱转移到新的收集管中，并加入 300 μL DNA 洗涤缓冲液。然后以最大速度重复离心 1 分钟。再重复一次此洗涤步骤。

要收集 DNA，请将离心柱转移到新试管中。加入 60 微升水，等待 1 到 3 分钟。然后以最大速度离心色谱柱 10 秒，以分离含有洗脱 DNA 的水。

现在加入 5 至 195 μL 双链 DNA 高灵敏度缓冲液，其中含有浓度为 1 至 200 的试剂。然后测量样品的荧光以计算产量。预计收集 10 到 50 ng 的 DNA。

现在使用超声处理将 DNA 分解成 250 到 350 个碱基对之间的片段。然后使用标准试剂盒制备 DNA 文库，并使用至少 1000 万个 50 个碱基对单端读数对其进行测序。所描述的程序用于鉴定出芽酵母中的晚期复制位点。

将正常细胞与缺乏脱乙酰酶蛋白 Sir2 的细胞进行比较。原始数据包含较大的峰值，主要是由于 TY 元素的存在。通过将每个样品的读取深度限制为中位红色深度的 2.5 倍来去除这些尖峰。

然后用 20 kb 的滑动窗口对去加标的数据进行平滑处理。最后，对数据进行归一化并绘制为 G1 中水平的比率。完全未复制的单元格将显示为 0.5，完全复制的单元格将显示为 1。在来自 7 号染色体的这些数据中，有证据表明 Sir2 突变体中存在已知的晚期复制区域。

观看此视频后，您应该对如何识别基因组中最后完成 DNA 复制的区域有一个很好的了解，因此这些区域特别容易受到 DNA 断裂和其他与晚期复制相关的问题的影响。