Name: 体外骨髓源性巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学习利用荧光标记髓鞘碎片评估小鼠骨髓源性巨噬细胞吞噬能力的方法。该体外实验方案可用于神经创伤研究，帮助科研人员深入理解巨噬细胞清除髓鞘碎片的免疫机制。

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作者谨此感谢佛罗里达州立大学医学院媒体专家 Glenn Sanger-Hodgson 在视频制作、剪辑和配音方面所做的全部工作。
本工作由美国国立卫生研究院（R01GM100474 和 R01GM072611）资助。

本文及第2节所述方法已获得佛罗里达州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循以下指南中规定的要求： 实验动物护理和使用的指南，8th 版本本方案中使用的所有动物在使用前均饲养于专用的实验动物设施中。无 在体 在动物处死前完成实验操作。动物数量根据实验需求确定，以平均细胞和髓鞘采集量为参考，以尽量减少使用数量。
注意：本实验方案描述了骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的制备（第1节）、荧光标记脑源性髓鞘碎片的制备（第2节）、分析髓鞘碎片吞噬作用的一般流程（第3节），以及分析髓鞘碎片脂质积累的一般流程（第4节）。试剂配制、细胞收获与操作、髓鞘收集与标记以及实验操作均应在层流生物安全柜中完成。
1. 原代骨髓来源巨噬细胞的制备
<ol>
	<li>完全巨噬细胞培养基（CMCM）的制备 
	注意：从骨髓中生成巨噬细胞需要使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。本制备方法利用L929小鼠成纤维细胞条件培养基作为M-CSF的来源。
	<ol>
		<li>将L929小鼠成纤维细胞在直径145 mm的培养皿中培养，每皿加入50 mL高糖（4500 mg/L L-葡萄糖） Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并补充5%新生牛血清（NCS）和青霉素/链霉素，连续培养7天以制备条件培养基。</li>
		<li>将培养后的培养基收集至50 mL锥形离心管中，在4 °C条件下以3500 × g离心30分钟。</li>
		<li>将上清液通过0.2 µm注射器滤器过滤至新的50 mL锥形离心管中。条件培养基可在-80 °C保存长达6个月。</li>
		<li>向高糖DMEM中加入5%（v/v）NCS、15%（v/v）L929小鼠成纤维细胞条件DMEM以及1%青霉素/链霉素。该培养基可在4 °C保存2–3个月。使用前需预热至37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>原代骨髓细胞的收集与巨噬细胞诱导 
	注意：采用本方案，一只小鼠可获得约2000万个骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。
	<ol>
		<li>按照标准CO2窒息程序对8–10周龄小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>用70%（v/v）乙醇: H2O对动物体表进行消毒，充分浸润毛发。</li>
		<li>在腹部切开一个小口，小心向后剥离皮肤以暴露皮下组织。注意避免刺破腹膜腔。</li>
		<li>从髋部至踝部完整取下双侧后肢。将所获组织置于含有5–10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）并补充1%青霉素/链霉素的100 mm培养皿中。 
		注意：处理多只动物时，应将培养皿置于冰上以减少组织降解。</li>
		<li>使用解剖刀去除骨骼上的肌肉和结缔组织。仅保留股骨和胫骨用于细胞收集，腓骨可弃去。</li>
		<li>用解剖刀切除骨两端的小段，以暴露骨髓腔。</li>
		<li>使用25G针头，以CMCM冲洗骨髓腔，将冲洗液收集至50 mL锥形离心管中。当骨骼呈现白色时，表明冲洗充分。</li>
		<li>收集完成后，用18G针头剧烈吹打细胞悬液30–90秒，以获得单细胞悬液。 
		注意：此时可选择性进行红细胞（RBC）裂解步骤。最近有研究提示，细胞内铁含量可能影响髓鞘碎片对巨噬细胞极化的作用16。有关是否加入红细胞裂解步骤的详细信息，请参阅Trouplin et al.17。</li>
		<li>将细胞悬液通过70 µm无菌细胞筛过滤至新的50 mL锥形离心管中。</li>
		<li>将收集的细胞均匀接种至含有15–20 mL CMCM的145 mm细胞培养皿中。每只牺牲的小鼠约使用三个培养皿。将培养物置于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>72小时后，用无菌PBS洗涤培养皿一次以去除未贴壁细胞，然后加入15–20 mL新鲜CMCM。继续在37 °C、5% CO2条件下培养4天。经过总共7天的培养后，最初分离的造血骨髓细胞将发育为成熟的BMDMs（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 荧光标记的脑源性髓鞘碎片的制备
注意：所有试剂可在 4 °C 下保存长达 1 个月。
<ol>
	<li>髓鞘碎片收集试剂的制备 
	<ol>
		<li>配制 Tris·Cl 缓冲液。
		<ol>
			<li>向800 mL去离子蒸馏水中加入2O (ddiH2O) 加入 20 mL 1 M Tris·Cl（pH 7.45，终浓度 20 mM）和 20 mL 100 mM Na2EDTA（终浓度 2 mM）。</li>
			<li>调节pH至7.45，用ddiH₂O定容至1000 mL2O. 使用0.2 µm滤器过滤溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制1 M蔗糖溶液。
		<ol>
			<li>向100 mL Tris·Cl缓冲液中加入68.46 g蔗糖，用Tris·Cl缓冲液定容至200 mL。使用0.2 µm滤器过滤溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过将1 M蔗糖溶液与Tris·Cl缓冲液以0.83:0.16（体积比）稀释，配制200 mL的0.32 M蔗糖溶液。</li>
		<li>通过将1 M蔗糖溶液与Tris·Cl缓冲液按0.83:0.16（体积比）混合，稀释配制150 mL的0.83 M蔗糖溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑源性粗制髓鞘碎片的收集 
	注意： 此处所述收集方法用于分离粗制髓鞘碎片。
	<ol>
		<li>使用标准的 CO₂ 安乐死法处死 10–12 只 8–10 周龄的小鼠2 窒息处死指南，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>解剖脑组织，将其置于含有10 mL 0.32 M蔗糖溶液的100 mm培养皿中。将培养皿置于冰上保存。</li>
		<li>使用无菌手术剪将脑组织切成约5 mm的碎片3 大小。</li>
		<li>将组织转移至50 mL锥形离心管中，并加入约30 mL的0.32 M蔗糖溶液。</li>
		<li>使用无菌手持式旋转匀浆器匀浆，直至形成均匀的溶液。</li>
		<li>用0.32 M蔗糖溶液将匀浆后的脑组织稀释至终体积90 mL。</li>
		<li>向6个38.5 mL的薄壁聚丙烯超速离心管中，各加入20 mL 0.83 M蔗糖溶液。</li>
		<li>将匀浆后的脑组织溶液轻轻加至0.83 M蔗糖溶液的上层，注意避免混合两层溶液。</li>
		<li>用0.32 M蔗糖溶液平衡各离心管。</li>
		<li>在4°C条件下，使用适当的预冷超速离心转子，以100,000 × g离心45分钟。将转子的加速度和减速度设置为最小值，以减少髓鞘碎片的损失。</li>
		<li>从两种蔗糖密度的界面处收集髓鞘碎片。 
		注意杂质应呈现为试管中心区域的白色条带。</li>
		<li>将粗制髓鞘碎片合并至一个50 mL锥形离心管中，并用Tris·Cl缓冲液调节体积至约35 mL。</li>
		<li>使用无菌手持式旋转匀浆器将粗制髓鞘碎片匀浆处理30-60秒。</li>
		<li>将悬浮液均匀分装至6支洁净的超速离心管中，并用适量的Tris·Cl缓冲液平衡。</li>
		<li>在4°C条件下，使用适当的预冷超速离心转子，以100,000 × g离心45分钟。将转子的加速度和减速度均设置为最大值。</li>
		<li>此时可见白色固体沉淀，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮于10–15 mL Tris·Cl缓冲溶液中。</li>
		<li>将悬液均匀分装至2支洁净的超速离心管中，并用适量的Tris·Cl缓冲液平衡重量。</li>
		<li>再次使用预冷的超速离心机转子，在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 45 分钟。将转子的加速度和减速度设置为最大值。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 5–6 mL 无菌 PBS 中，并将悬液分装至适当数量的预称重 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 22,000 x g 离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，称量髓鞘碎片沉淀的重量。</li>
		<li>将沉淀重悬于PBS中，调整终浓度为100 mg/mL。 
		注意10至12个脑组织足以制备10–15 mL浓度为100 mg/mL的髓鞘碎片。髓鞘碎片可在-80 °C保存6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髓鞘碎片荧光标记
	<ol>
		<li>使用前立即配制50 µM的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液。
		<ol>
			<li>使用无菌 PBS 将用 100% 二甲基亚砜（DMSO）配制的 5 mM CFSE 储存液稀释至终工作浓度为 50 µM。</li>
			<li>使用 0.2 µm 注射器滤器过滤溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>解冻所需量的100 mg/mL髓鞘碎片，并用无菌29G针头重新悬浮。 
		注意冷冻髓鞘碎片会导致其从溶液中析出，使用前需重新悬浮。</li>
		<li>将髓鞘碎片转移至预称重的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在 4°C 条件下以 14,800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将髓鞘碎片重悬于 CFSE 溶液中，每 100 µL 髓鞘碎片沉淀物加入 200 µL CFSE 溶液。</li>
		<li>室温避光孵育30分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 14,800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀重悬于600-800 µL洗涤缓冲液（PBS中含100 mM甘氨酸，0.2 µm滤膜过滤除菌）中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 14,800 × g 离心 10 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 2.3.8–2.3.9 两次。</li>
		<li>最后一次洗涤后，称量髓鞘碎片沉淀的重量，并用无菌 PBS 重悬至 100 mg/mL。 
		注意：标记的髓鞘碎片可在 -80 °C 保存长达 6 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 髓鞘碎片吞噬实验
注意： 以下是观察荧光标记髓鞘碎片吞噬作用的基本方法。其他处理和实验条件的添加需由研究人员自行优化。
<ol>
	<li>处理板的制备
	<ol>
		<li>对于每个145 mm培养皿，使用5–6 mL含10 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS，pH 7.4）将成熟的BMDM细胞收集至15 mL圆锥形离心管中。 
		注意：不要使用胰蛋白酶，因为它可能会改变细胞的活化状态18。</li>
		<li>向每管收集的细胞中加入等体积预温的CMCM培养基。</li>
		<li>在20 °C下以180 × g离心8分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用CMCM重悬细胞并计数。</li>
		<li>向24孔细胞培养板的每孔中加入1×105个细胞，体积为1 mL CMCM。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髓鞘碎片处理与分析
	<ol>
		<li>向每孔加入10 µL 100 mg/mL CFSE标记的髓鞘碎片（终浓度为1 mg/mL）。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育1–3小时。</li>
		<li>用无菌PBS洗涤培养板3次，以去除未被吞噬的髓鞘碎片。</li>
		<li>向每孔加入400 µL 4%多聚甲醛溶液，在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>用无菌PBS洗涤培养板2次。</li>
		<li>向每孔加入400 µL Hoechst 33258溶液，在室温下避光孵育5分钟。</li>
		<li>用无菌PBS洗涤培养板2次。</li>
		<li>向每孔加入200 µL含Tris缓冲液的Fluoro-gel，以减少光漂白。</li>
		<li>使用具备倒置荧光功能的显微镜观察细胞。 
		注意：CFSE的激发波长和发射波长分别为494 nm和521 nm。</li>
		<li>通过将CFSE阳性细胞数除以细胞核数量，计算相对髓鞘碎片摄取量。</li>
		<li>成像前，可在4 °C避光条件下将培养板保存最多7天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过油红O染色法定量细胞内脂质
注意： 以下是观察细胞内髓鞘碎片来源脂质的基本方法。由于光谱重叠，不建议使用CFSE标记的髓鞘碎片对油红O染色进行荧光定量。其他处理方法和实验条件的添加需由研究者自行优化。
<ol>
	<li>染色溶液的配制
	<ol>
		<li>配制0.5%油红O（ORO）染色液。
		<ol>
			<li>在搅拌条件下，缓慢将100 mL 100%丙二醇（1,2-丙二醇）加入0.5 g ORO（1-([4-(二甲苯基偶氮)苯基]偶氮)-2-萘酚）中。</li>
			<li>在95 °C下加热溶液15分钟，或加热至所有大颗粒完全溶解。 
			注意：加热温度不得超过 100 °C。</li>
			<li>趁热将溶液通过滤纸过滤至新容器中。</li>
			<li>让溶液在室温下静置过夜冷却。溶液可在室温下保存长达1年。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制85%的丙二醇溶液。
		<ol>
			<li>将85 mL的100%丙二醇加入15 mL的ddiH₂O中2O. 搅拌至混合均匀。溶液可在室温下保存长达1年。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理板的制备
	<ol>
		<li>按照第3节所述方法准备24孔板。</li>
		<li>37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>髓鞘碎片处理 
	<ol>
		<li>每孔加入10 µL 100 mg/mL的髓鞘碎片（终浓度为1 mg/mL）。</li>
		<li>37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1–3 小时2.</li>
		<li>用无菌 PBS 洗涤平板 3 次，以去除未消化的髓鞘碎片。 
		注意：此时，培养板可立即进行固定，或加入新鲜的CMCM，将细胞继续孵育以获取其他时间点的数据。</li>
		<li>每孔加入 400 µL 4% 多聚甲醛，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>用无菌 PBS 洗涤平板 2 次，然后进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ORO染色与分析
	<ol>
		<li>用去离子水洗涤固定后的培养板3次2O.</li>
		<li>向每个孔中加入 400 µL 100% 丙二醇，在室温下孵育 5 分钟。 
		注意：这将减少ddiH的残留2O.</li>
		<li>吸出丙二醇，向每孔加入 400 µL ORO 溶液。</li>
		<li>在 60 °C 下孵育 8 分钟。</li>
		<li>吸除 ORO 溶液。然后每孔加入 400 µL 85% 丙二醇，在室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>用ddiH2O洗涤平板3次2O.</li>
		<li>每孔加入 400 µL Hoechst 33258 溶液，在室温避光孵育 5 分钟。</li>
		<li>用无菌 PBS 洗涤平板 2 次。</li>
		<li>每孔加入 200 µL 含 Tris 缓冲液的 Fluoro-gel。</li>
		<li>使用倒置荧光显微镜对细胞进行成像。ORO 可使用标准的 Texas Red 或 DsRed 滤光片组进行成像。</li>
		<li>通过测定每张图像视野中油红O阳性区域面积，并将其除以细胞核数量，来量化相对脂质滞留量。</li>
		<li>将培养板置于4 °C避光保存7天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li>
<li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+spinal+cord+injury%3A+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li>
<li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve%3A+an+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li>
<li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+activates+FAK%2FAkt%2FNF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380(2010).</li>
<li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li>
<li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition%3A+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li>
<li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li>
<li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow-derived+Macrophage+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48(2016).</li>
<li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).</li>
<li>Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
</ol>

作者无披露信息。

本文所述实验步骤同时使用新鲜分离的粗制中枢神经系统髓鞘碎片和原代骨髓来源的巨噬细胞。为了减少动物使用量，建议在处死小鼠时同时采集脑组织和骨髓细胞。两名研究人员可协作同时制备两种材料。 alternatively，脑组织可在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存于 -80 °C，以备后续进行髓鞘碎片的分离。根据我们的经验，在此条件下保存长达1个月，脑组织产生髓鞘碎片的能力不会出现明显下降。
CFSE 被用于标记髓鞘碎片，因其使用简便且荧光强度高。该染料在细胞内酯酶切除分子上的乙酸基团之前保持淬灭状态14。游离的琥珀酰亚胺酯基团随后可与伯胺发生反应，从而共价结合到细胞蛋白上14。虽然 CFSE 可通过标准的绿色荧光通道激发，但目前已有多种具有不同光谱特性的衍生物商业化供应。因此，可以设计一种类似的吞噬实验，使用多种荧光染料进行标记。还应注意，由于该染料可轻易穿过质膜，因此也可用于以类似标记髓鞘碎片的方式标记凋亡细胞19。此外，尽管本方法依赖于标...

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是连接先天免疫系统与适应性免疫系统的重要环节。作为抗原呈递细胞（APCs），它们可通过抗原呈递和细胞因子释放与淋巴细胞进行通讯1,2,3。然而，作为专业的吞噬细胞，其主要功能是清除病原体、衰老细胞及细胞碎片1,4。在脊髓损伤（SCI）后，大量髓鞘碎片由负责中枢神经系统（CNS）轴突髓鞘形成的少突胶质细胞死亡而产生5。我们及其他研究团队已证实，髓鞘碎片的清除主要由浸润的BMDMs负责5,6,7。然而，在脊髓损伤部位，吞噬髓鞘碎片可能促使这些原本具有抗炎特性的细胞转变为促炎状态5,8,9。由于BMDMs在损伤脊髓中是神经炎症的关键介导者，因此成为重要的临床干预靶点。
为了帮助研究BMDMs在损伤脊髓中的作用，我们开发了一种 体外 用于直接研究BMDM对髓鞘碎片的反应。为提高生物学相关性，这些研究中使用了原代小鼠BMDM和新鲜分离的髓鞘碎片。因此，本文所述方法还包括原代小鼠BMDM的分离与培养，以及一种改良的蔗糖梯度法用于分离小鼠中枢神经系统来源的髓鞘碎片10,11,12髓鞘碎片可轻易用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行标记，以追踪其被骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的内化过程。CFSE 非常适用于此应用，因其无细胞毒性，且具有狭窄的荧光发射光谱，可与其他荧光探针进行多重标记。13,14吞噬作用发生后，髓鞘碎片中的脂质通过溶酶体转运，并以中性脂质形式包裹进入细胞内脂滴5为定量分析这种细胞内脂质蓄积，我们提供了一种经优化用于定量图像分析的油红O（ORO）染色方法。该染色方法简便，结果稳定且可重复，并可实现定量。15这些方法可在有限的专用设备条件下，促进对髓鞘碎片吞噬作用及脂质滞留的研究。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>高糖，含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100倍浓缩液</td></tr><tr><td>新生小牛血清（NCS）</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>源自美国</td></tr><tr><td>NCTC clone 929 [L细胞，L-929，Strain L的衍生株]&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>用于制备条件培养基的L929细胞系</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>VWR</td><td>10062-896&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>聚苯乙烯，145/20 mm</td></tr><tr><td>CFSE细胞增殖检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>提供用于重悬的DMSO</td></tr><tr><td>含Tris缓冲液的Fluoro-gel&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>薄壁，聚丙烯，38.5 mL，25 × 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti超速离心转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti转子，摆桶式，钛合金</td></tr><tr><td>手持式旋转匀浆器</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

体外骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬作用

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是一类成熟的白细胞，作为专业的吞噬细胞，在清除多种颗粒物质方面发挥关键的生理作用。正常情况下，BMDMs 被限制在中枢神经系统（CNS）之外，但在发生损伤后，它们可迅速浸润进入 CNS。一旦进入受损的中枢神经系统组织，BMDMs 即成为清除损伤来源的细胞碎片的主要细胞类型，包括大量富含脂质的髓鞘碎片。BMDM 浸润及其对髓鞘碎片的吞噬作用在中枢神经系统中引发的神经病理学影响复杂，目前尚未完全明确。本文所述的实验方案可用于直接 体外 在中枢神经系统损伤背景下对BMDMs的研究。本文涵盖了小鼠BMDM的分离与培养、髓鞘碎片的制备，以及评估BMDM吞噬髓鞘碎片能力的实验方法。这些技术可产生稳定且可量化的结果，无需大量专用设备或材料，同时可根据研究人员的具体需求进行灵活调整。

用CFSE标记的髓鞘碎片处理BMDM应能观察到明显的内化现象（图2）。虽然3小时的相互作用时间已足以使BMDM吞噬足够量的髓鞘碎片，从而实现稳定的下游检测，但在仅1小时的相互作用后即可观察到细胞内积累。然而，洗涤后仍可能有部分髓鞘碎片残留在细胞表面，这可能是由于洗涤不充分，或在吞噬早期阶段颗粒尚未完全内化所致。
尽管BMDM能够快速内吞髓鞘碎片，但在形成油红O可染脂滴之前，需要经过溶酶体加工处理。为证明这一点，将BMDM与髓鞘碎片共孵育90分钟，随后洗涤，并在固定和染色前继续培养不同时间（图3）。图4显示，从处理开始到中性脂质出现之间存在延迟。还应注意，脂质在培养过程中并不稳定。BMDM在脂滴形成后不久即开始代谢所积累的脂质。因此，我们建议在洗去未吞噬的髓鞘碎片后，至固定前的等待时间不超过24小时。
ORO 染色面积的定量分析可反映 BMDM 中髓鞘...

我们介绍了利用荧光标记的髓鞘碎片和细胞内脂滴染色来评估原代小鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬能力的方法。

骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）是成熟的白细胞，在生理上具有关键作用，作为专业的吞噬细胞，能够清除……

本实验方案的总体目标是评估骨髓来源巨噬细胞对脑组织来源髓鞘碎片的吞噬作用。该方案旨在回答神经创伤领域的关键科学问题。本方法的优势在于，能够高效且相对经济地在体外分析巨噬细胞的反应，特别是骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬能力。该方法可轻松地进行调整，以研究外部调节剂的作用。用70%乙醇充分浸润小鼠后，在腹部皮肤上切开一个开口。向后拉开皮肤以暴露腿部，进行解剖。操作过程中注意避免刺破腹膜腔。暴露后，在踝关节和髋关节处剪断，取下腿部，并将腿部置于含有抗生素的冰冻 PBS 中。另一条腿重复上述操作。用新鲜的冰冻 PBS（添加抗生素）清洗组织，以去除在解剖过程中可能附着在组织上的颗粒物。沿肌肉轻轻刮擦，可去除大部分不需要的组织。使用手术刀和镊子将胫骨从肌肉和结缔组织中分离出来。分离后，切除两端以暴露骨髓腔。对股骨重复此操作。将25号针头连接至装有完全骨髓来源巨噬细胞培养基的20毫米注射器上，然后冲洗骨髓腔。当骨充分冲洗后，会呈现白色。使用18号针头将采集的骨髓穿刺液充分振荡30至90秒，以获得单细胞悬液。随后将悬液通过无菌的70微米孔径细胞筛网过滤。将细胞悬液均匀分装至145厘米的细胞培养皿中。每只小鼠可提供足够用于三皿的材料。培养七天后，这些培养皿中的成熟巨噬细胞通常会达到70%至80%的融合度。为了从脑组织中分离粗制髓鞘碎片，需进行一系列蔗糖梯度超速离心步骤。首先，从8至10周龄的小鼠中分离出10到12个脑组织。将脑组织在0.32摩尔蔗糖溶液中匀浆，然后铺在0.383摩尔蔗糖溶液垫上，形成不连续梯度。离心后，粗制髓鞘碎片位于两层之间的界面处。将样品收集后加入Tris缓冲液中，再次离心以沉淀髓鞘碎片。将沉淀物重新悬浮于Tris缓冲液中，并分装至两支试管中进行进一步离心。首先，完整取出大脑，置于含有冰冻0.32摩尔蔗糖溶液的培养皿中。使用无菌手术剪将采集的脑组织切成约五毫米大小的碎片。此步骤有助于后续的匀浆过程。将组织收集至一个50毫升的离心管中。使用旋转式匀浆器将组织匀浆成均匀的糊状物。确保所有可见的大块脑组织均已充分匀浆。将匀浆液加入含有 20 毫升 0.83 摩尔蔗糖溶液的超速离心管中，制备匀浆时需注意保持分层状态。使用 0.32 摩尔蔗糖溶液仔细平衡每个离心管。完成后，将离心管转移至合适的离心机转子中，在 4 摄氏度条件下以 100,000 ×g 离心 45 分钟。确保加速度和减速度均设置为最低值。离心完成后，可在蔗糖密度界面处观察到髓鞘碎片。请轻柔收集髓鞘碎片。收集后，向髓鞘碎片中加入Tris缓冲液。使用旋转式匀浆器再次进行匀浆。将匀浆液分装至六个洁净的超速离心管中，并根据需要使用额外的Tris缓冲液平衡各管。将收集的髓鞘碎片在4°C条件下以100,000 × g离心45分钟，加速度和减速度均设为最大值。离心后，髓鞘应已形成沉淀。用Tris缓冲液重悬沉淀物。合并重悬液，再次进行超速离心。离心后，会形成紧密的沉淀。弃去上清液。用无菌 PBS 重悬沉淀。将重悬的髓鞘碎片等分至预先称重的微量离心管中。在22,000 ×g条件下离心10分钟，弃去PBS上清液。称量沉淀物后，用PBS重悬至浓度为100毫克/毫升。所获得的粗制髓鞘碎片现可用于吞噬作用的研究。用CFSE标记的髓鞘碎片可用于追踪早期内化过程以及细胞内转运。未标记的髓鞘碎片可与油红O脂质染色兼容，用于评估内化脂质的储存与代谢情况。如果使用的是保存在负80摄氏度的髓鞘碎片，首先需用29号针头重悬。将10毫克的髓鞘碎片沉淀物重悬于200微升PBS中，然后加入2微升5毫摩尔的CFSE溶液。用移液器混匀。避光孵育30分钟后，经后续洗涤，用PBS将髓鞘碎片重悬至100毫克/毫升。细胞培养并用4%多聚甲醛固定后，向每孔加入100%丙二醇。在室温下孵育5分钟后，向每孔加入油红O染色液。在60摄氏度下轻轻振荡孵育8分钟。轻轻倾斜培养板，以便完全吸除油红O染液。向每个孔中加入85%的丙二醇。在室温下孵育5分钟后，用PBS洗涤孔板，并使用您选择的核染料对细胞进行染色。骨髓细胞在培养期间的代表性光学显微镜图像。初次接种后24小时，仅有少量贴壁细胞存在。然而，在存在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的情况下，白细胞前体细胞开始发生分化。在含有M-CSF的培养条件下培养七天后，前体细胞完全分化为成熟的骨髓来源巨噬细胞，具备吞噬能力。采用该方法，一只8至10周龄的C57BL/6J小鼠通常可获得1800万至2400万个骨髓来源巨噬细胞。为观察内化过程，将CFSE标记的髓鞘碎片加入骨髓来源巨噬细胞培养物中。细胞经含1毫克/毫升CFSE标记髓鞘碎片的溶液处理1小时后，洗涤并用4%多聚甲醛固定。可通过具备落射荧光功能的显微镜，使用标准的 GFP 滤光片组观察被内化的髓鞘碎片。为了展示髓鞘脂质在不同时间点的累积变化情况，巨噬细胞先与未标记的髓鞘碎片共同孵育 90 分钟，随后洗涤并在不同时间点进行固定。洗涤后立即观察，可见脂滴数量较少。然而，随着时间推移，可见的脂滴数量逐渐增多，在洗涤后约24小时达到峰值。此后巨噬细胞将开始代谢并外排脂质储存，导致可染色的脂滴数量减少。为了定量分析油红O染色结果，使用具备落射荧光功能的显微镜，从每个时间点的样本中随机获取五张图像进行分析。通过DsRed通道拍摄的图像确定每个孔的油红O染色区域。通过计数每个视野中细胞核的数量来确定细胞总数。该图显示了相应的定量结果。随着骨髓来源的巨噬细胞将内吞的髓鞘脂质转化为中性脂质，油红O阳性信号通常会持续增加。在24小时达到峰值后，随着巨噬细胞开始代谢或外排脂质，油红O阳性信号随之减少。观看本视频后，您应能较好地掌握如何分离和培养原代骨髓来源的巨噬细胞，以及如何研究这些细胞与新近分离的脑源性髓鞘碎片之间的相互作用。这些操作步骤中最关键的部分是始终正确维持无菌技术。由于巨噬细胞对少量病原体相关分子即可产生强烈反应，因此最大限度减少任何可能影响实验结果的干扰因素至关重要。这些技术的主要优势在于，它们利用了具有生物学相关性的原代细胞和新鲜的髓鞘碎片，同时减少了所需专用设备的数量。此外，经过一定的用户优化，这些方法可轻松适用于研究骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片反应的多种问题。通过联合使用荧光标记的髓鞘碎片和髓鞘巨噬细胞的油红O染色，有可能探索针对多种神经创伤患者的潜在治疗干预手段。此类研究的总体目标是通过远端巨噬细胞介导的细胞碎片清除，促进炎症的消退。

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体外骨髓源性巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬

巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。...

骨髓来源巨噬细胞的制备

吞噬细胞通过在其吞噬体中清除和消除入侵的微生物，在先天免疫系统中发挥重要作用。吞噬体……...

活体巨噬细胞中吞噬溶酶体发生的生物学研究

我们描述了如何使用数字光学显微镜实时观察巨噬细胞与C. neoformans...

可视化非裂解性胞吐作用 新型隐球菌 使用数字光学显微镜从巨噬细胞中分离

在此，我们介绍一种从新生小鼠（出生第1天）中分离小胶质细胞的实验方案 体外...

快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素和链霉亲和素包被细菌，从巨噬细胞中分离含有Salmonella...

从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体

本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。...

小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像

神经退行性疾病与小胶质细胞功能失调相关。本文介绍了一种利用iPSC来源的巨噬细胞体外吞噬神经母细胞瘤细胞的检测方法。文中描述了活细胞延时成像和固定细胞高内涵成像的定量显微镜读数分析方法。...

诱导多能干细胞来源巨噬细胞吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的体外定量成像分析

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从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

本实验方案旨在评估重复性磁刺激对小胶质细胞吞噬髓鞘碎片能力的影响。 体外 已建立小胶质细胞与髓鞘碎片共培养系统以实现该目的。...

评估小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬作用 体外 在重复磁刺激下

学习利用荧光标记髓鞘碎片评估小鼠骨髓源性巨噬细胞吞噬能力的方法。该体外实验方案可用于神经创伤研究，帮助科研人员深入理解巨噬细胞清除髓鞘碎片的免疫机制。

体外骨髓来源巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬作用

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