体外骨髓源性巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬

该方案的总体目标是评估脑源性髓鞘碎片的骨髓衍生巨噬细胞吞噬作用。该协议旨在回答神经创伤领域的关键问题。这种方法的优点是允许在体外对巨噬细胞反应进行有效且相对具有成本效益的分析，特别是骨髓来源的巨噬细胞对髓鞘碎片的吞噬能力。

这种方法可以很容易地用于研究外部调制器的影响。用 70% 乙醇浸透小鼠后，在腹部皮肤上开一个口。将皮肤向后拉，露出腿进行解剖。

在此过程中注意不要刺穿腹膜腔。暴露后，通过切割脚踝和臀部来去除腿部。将腿放入补充有抗生素的冰冷 PBS 中。

对另一条腿重复。用新鲜的冰冷 PBS 中清洗组织，并补充有抗生素，以去除解剖过程中可能粘附在组织上的任何颗粒。轻柔的刮擦动作会去除大部分不需要的组织。

用手术刀和镊子将胫骨从肌肉和结缔组织中解放出来。释放后，去除两端以露出骨髓腔。对股骨重复此过程。

将 25 号针头贴在装满完整骨髓来源的巨噬细胞培养基的 20 毫米注射器上。然后冲洗骨髓腔。充分冲洗后，骨头会呈白色。

用 18 号针头搅拌收集的骨髓抽吸物 30 至 90 秒，以获得单细胞悬液。接下来，将悬浮液通过无菌 70 微米孔径的细胞过滤器。将细胞悬液均匀分装在 145 厘米的细胞培养皿中。

每只老鼠将提供足够的三道菜。培养 7 天后，这些培养皿通常会与成熟巨噬细胞汇合 70% 至 80%。为了从大脑中分离粗髓鞘碎片，进行了一系列蔗糖梯度超速离心步骤。

首先，从 8 至 10 周龄的小鼠中解剖 10 至 12 个大脑。然后将脑在 0.32 摩尔蔗糖溶液中匀浆，然后分层到 0.383 摩尔蔗糖溶液垫上以产生不连续的梯度。离心后，在各层之间的界面处发现粗髓鞘碎片。

将其收集并分配到 Tris 缓冲溶液中，并再次离心以沉淀髓鞘碎片。将沉淀再次重悬于 Tris 缓冲液中，并在两个试管之间分流以进行进一步的离心。首先，取出整个大脑，将其放入装有冰冷的 0.32 摩尔蔗糖溶液的培养皿中。

使用无菌手术剪刀，将收集的大脑切成大约 5 毫米大小的块。此步骤有助于后续的均质化过程。将组织收集到 50 毫升的试管中。

使用旋转均质器，将组织均质化成光滑的浆液。确保所有可见的大脑固体都已彻底均质化。将 20 mL 0.83 摩尔蔗糖溶液的超速离心管中，生成并匀浆，注意保持分离。

使用 0.32 摩尔蔗糖溶液小心平衡每个试管。完成后，将试管转移到适当的离心机转子上，并在 100， 000 倍重力、4 摄氏度下旋转 45 分钟。确保 acceleration （加速度） 和 decelation （减速） 设置为最小值。

离心完成后，髓鞘碎片将在蔗糖密度界面之间可见。轻轻收集髓鞘碎片。收集后，将 Tris 缓冲液添加到髓鞘碎片中。

用旋转均质器再次匀浆。将匀浆分装在六个干净的超速离心管中，并根据需要用额外的 Tris 缓冲液平衡试管。将收集的髓鞘碎片再次以 100， 000 倍重力、4 摄氏度离心 45 分钟，并将加速和减速设置为最大值。

离心后，髓鞘将沉淀。使用 Tris 缓冲液，重悬沉淀。再次合并重悬液和超速离心机。

离心后，形成紧密堆积的颗粒。倒出上浆。将沉淀重悬于无菌 PBS 中。

将重悬的髓鞘碎片平均分成预先称重的微量离心管中。在 22， 000 倍重力下离心 10 分钟后，去除 PBS 上液。称量沉淀后，用 PBS 重悬至 100 毫克/毫升的浓度。

所得的粗髓鞘碎片现在适用于吞噬作用的研究。CFSE 标记髓鞘碎片可用于追踪早期内化以及细胞内运输。未标记的髓鞘碎片与 Oil Red-O 脂质染色相容，以评估内化脂质的储存和代谢。

如果您使用的是储存在零下 80 摄氏度的髓鞘碎片，您首先需要用 29 号针头重悬。在 200 微升 PBS 中重悬 10 毫克沉淀的髓鞘碎片。然后加入 2 微升 5 毫摩尔 CFSE 溶液。

移液管混合。孵育 30 分钟后，避光洗涤后，用 PBS 将髓鞘碎片重悬至 100 毫克/毫升。用 4% 多聚甲醛培养和固定后，向每个孔中加入 100% 丙二醇。

在室温下孵育 5 分钟后，向每个孔中加入 Oil Red-O 染色溶液。在 60 摄氏度下孵育 8 分钟，同时轻轻搅拌。轻轻倾斜板，让 Oil Red-O 染色剂完全吸出。

向每个孔中加入 85% 丙二醇。在室温下孵育 5 分钟后，用 PBS 洗涤孔，并使用您选择的细胞核染料对细胞进行染色。培养过程中骨髓细胞的代表性光学显微镜图像。

初始接种后 24 小时，几乎没有贴壁细胞存在。然而，在巨噬细胞集落刺激因子 M-CSF 存在的情况下，白细胞前体细胞开始分化。在 M-CSF 存在下培养 7 天后，前体细胞完全分化为能够吞噬作用的成熟骨髓衍生的巨噬细胞。

使用这种方法，一只 8 至 10 周龄的 C57 黑色 6J 小鼠通常可产生 18 至 2400 万个骨髓巨噬细胞。为了可视化内化，将 CFSE 标记的髓鞘碎片添加到骨髓衍生的巨噬细胞培养物中。用 1 毫克/毫升 CFSE 标记的髓鞘碎片处理细胞 1 小时，然后用 4% 多聚甲醛洗涤和固定。

内化的髓鞘碎片可以在具有落射荧光功能的显微镜上使用标准 GFP 滤光片组进行可视化。为了证明髓鞘脂质积累如何随时间变化，用未标记的髓鞘碎片处理巨噬细胞 90 分钟，然后在不同时间点洗涤和固定。洗涤后，立即可见少量脂滴。

然而，随着时间的推移，更多的脂滴变得可见，在洗涤后约 24 小时达到最大值。巨噬细胞将开始代谢以外排到脂质储存中，从而减少可染色液滴的数量。为了量化 Oil Red-O 染色，使用具有落射荧光功能的显微镜从每个时间点样品中获得 5 张随机获得的图像。

使用 DsRed 通道中捕获的图像确定每个孔的 Oil Red-O 染色面积。细胞总数是通过计算每个字段中存在的细胞核数量来确定的。此图显示了生成的量化结果。

Oil Red-O 阳性信号的稳定增加是典型的，因为骨髓来源的巨噬细胞将内化的髓鞘脂质转化为中性脂质。随着巨噬细胞开始代谢或流出脂质，Oil Red-O 阳性信号在 24 小时达到峰值后减弱。看过这个视频后，您应该对如何分离和培养原代骨髓来源的巨噬细胞，以及如何研究它们与新鲜分离的脑源性髓鞘碎片的相互作用有一个很好的了解。

这些程序中最重要的部分是始终正确维护无菌技术。由于巨噬细胞可以对少量病原体相关分子产生稳健反应，因此尽量减少任何可能使结果产生偏差的潜在相互作用至关重要。这些技术的主要优点是它们使我们使用了生物学相关的原代细胞和新鲜的髓鞘碎片，同时消除了所需的专业设备的数量。

此外，通过一些用户优化，这些方法可以很容易地适应解决有关骨髓来源的巨噬细胞对髓鞘碎片的反应的各种问题。通过利用荧光标记的髓鞘碎片和有髓巨噬细胞的 Oil Red-O 染色，可以研究针对各种神经创伤患者的潜在治疗干预措施。此类工作的总体目标是远程巨噬细胞介导的细胞碎片清除以促进炎症消退。