骨髓来源巨噬细胞的制备

本实验的总体目标是从尿液和骨髓来源的细胞培养物中生成巨噬细胞。首先通过从小鼠后肢提取骨髓来实现这一目标。第二步，去除骨髓中的常驻巨噬细胞，随后在巨噬细胞分化条件下进一步培养骨髓细胞。

当骨髓细胞分化为巨噬细胞后，即可收集用于实验分析。最终，可利用共聚焦显微镜来展示细菌脂多糖（LPS）在骨髓来源巨噬细胞内酸性区室中的定位。该技术相较于现有方法（如培养巨噬细胞系）的主要优势在于，能够获得大量原代巨噬细胞。

方法的可视化演示至关重要，因为自行操作步骤难以掌握，需要反复练习才能成功。用70%乙醇对已安乐死的小鼠皮肤进行消毒。在每条后肢的顶部做一切口，并将皮肤向下拉至足部以暴露肌肉。接下来，剪下后肢，并使用无菌剪刀和镊子进行操作。

去除皮肤时，将腿部置于含有5毫升无菌冰冻PBS的无菌35毫米培养皿中。清除附着在骨骼上的任何皮肤和肌肉，然后将骨骼转移至另一个含有5毫升冰冻PBS的无菌培养皿中。

冰冷且无菌的 PBS。用额外五毫升 PBS 清洗骨骼两次，然后将其转移至含有五毫升冰的无菌研钵中。冰冷且无菌的 PBS。

现在在关节处将胫骨与股骨分离，并用研杵轻轻研磨骨骼。将上清液收集到预冷的15毫升离心管中，共收集三次。然后将组织悬液通过70微米的尼龙细胞筛过滤。

为去除固体碎片，将滤液离心后轻轻弃去上清液。用红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，并在30秒后加入20毫升冰预冷的完全DMEM以终止反应。离心细胞后，将沉淀重悬于20毫升37摄氏度的完全DMEM中，然后将细胞悬液分装至两个100毫米的培养皿中。于37摄氏度孵育4小时后，在室温下将上清液收集至50毫升离心管中。

离心去除上清后，将沉淀重悬于10毫升完全DMEM培养基中，该培养基需添加先前制备的L 9 29细胞上清液，然后通过40微米尼龙细胞筛网过滤细胞。将滤液加入140毫升完全DMEM培养基和L 9 29细胞培养基中，随后将细胞悬液以每皿10毫升分装至15个100毫米培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞3天，每皿加入10毫升完全DMEM培养基并补充L 9 29细胞上清液，再继续培养4天。

定期使用倒置显微镜监测细胞生长情况，以收获骨髓来源的巨噬细胞。首先吸除并弃去上清液，然后用完全DMEM培养基洗涤培养皿两次。接着加入5毫升37°C的完全DMEM培养基，用橡胶刮刀轻轻吹打使细胞脱落，将骨髓来源的巨噬细胞收集至50毫升离心管中，随后离心沉淀细胞。

用20毫升完全DMEM重悬细胞沉淀。最后，通过台盼蓝排斥法进行细胞计数。采用此方法，仅需数天即可获得大量巨噬细胞，这些细胞来源于已去除骨髓驻留巨噬细胞后的圆形非贴壁骨髓细胞，其分离与接种过程如上所述。

这些具有代表性的BMDM前体细胞用G-M-C-S-F进行孵育。三天后，细胞开始贴壁并分化为巨噬细胞。七天后，可观察到融合的骨髓来源巨噬细胞单层细胞层。

通过流式细胞术分析F四80和H-L-A-D-R发现，骨髓来源的巨噬细胞表达这两种标志物，证实骨髓细胞已成功分化为巨噬细胞。为评估骨髓来源巨噬细胞的酸性吞噬体功能，检测了细胞内吞乳胶微球的能力，结果符合预期。

为评估细胞的内吞潜能，检测了每细胞所含珠粒数量随时间的变化。骨髓来源的巨噬细胞还与伯氏考克斯体共培养。结果显示，呈红色的Burnett眼LPS定位于含有蓝色溶酶体相关膜蛋白1的区室，但不与绿色的组织蛋白酶D共定位，表明LPS存在于晚期内体中，且该内体无法与溶酶体融合，符合骨髓来源巨噬细胞的预期特征。

通过TMA Wiley眼对细菌病原体相互作用进行了进一步分析。如预期所示，呈红色的细菌未定位于含有KPS和D的区室中，而KPS和D再次以绿色显示。在此具有代表性的免疫印迹实验中，检测了骨髓来源巨噬细胞的信号转导通路，结果表明，与组织分离的巨噬细胞类似，骨髓来源巨噬细胞在大肠杆菌LPS刺激下会上调磷酸化的P38α MAP激酶水平。

该方法有助于解答细胞微生物学领域的一些关键问题，例如微生物在细胞内的定位位置。