骨髓衍生的巨噬细胞产

该程序的总体目标是从尿液、骨髓来源的细胞培养物中产生巨噬细胞。首先通过从小鼠后腿中提取骨髓来完成。在第二步中，去除骨髓驻留的巨噬细胞，然后在巨噬细胞分化条件下进一步培养骨髓细胞。

然后，当骨髓细胞分化成巨噬细胞时，可以收集它们进行实验分析。最终，共聚焦显微镜可用于证明细菌 LPS 在骨髓来源的巨噬细胞、末端酸性隔室内的定位。与现有方法（如培养巨噬细胞、细胞系）相比，该技术的主要优点是数量多，因此可以获得原代巨噬细胞。

方法的视觉演示至关重要，因为自我生产步骤很难学习并且需要练习，要取得成功，请用 70% 乙醇对安乐死小鼠的皮肤进行消毒。在每条后腿的顶部做一个切口，然后将皮肤向下拉向脚部以露出肌肉。接下来，剪掉后腿并使用无菌剪刀和镊子。

要去除皮肤，请将腿放入含有 5 毫升无菌冰的 35 毫米无菌培养皿中。冷 PBS。去除附着在骨头上的任何皮肤和肌肉，然后将骨头转移到含有 5 毫升冰的新无菌培养皿中。

冷无菌 PBS。再用 5 毫升 PBS 清洗骨头两次，然后将它们转移到含有 5 毫升冰的无菌研钵中。冷无菌 PBS。

现在从关节处的股骨上切下胫骨，然后用杵轻轻地粉碎骨头。将上清液收集在冰冷的 15 毫升试管中 3 次。然后通过 70 微米尼龙细胞过滤器过滤组织悬液。

要去除固体碎片，请旋转滤液并轻轻丢弃上清液。用红细胞裂解缓冲液解离沉淀，30 秒后加入 20 毫升冰冷的完整 DMEM 以停止反应离心细胞后，我们将沉淀悬浮在 20 毫升的 37 摄氏度中，完成 DMEM，然后将细胞悬液分装到两个 100 毫米培养皿中。将培养皿在 37 摄氏度下孵育 4 小时，然后在室温下将上清液收集到 50 毫升试管中。

旋转上清液后，将沉淀重新悬浮在 10 毫升补充有先前制备的 L 9 29 细胞上清液的完全 DMEM 中，然后通过 40 微米尼龙细胞过滤器过滤细胞。将滤液加入 140 毫升完整 DMEM 和 L 9 29 细胞培养基中，然后将每个培养皿的 10 毫升细胞悬液分配到 15 100 毫米培养皿中。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中加入 10 毫升完整 DMEM 加 L 9 29 上清液孵育 3 天后，再将细胞孵育 4 天。

用倒置显微镜定期监测细胞生长，收获骨髓来源的巨噬细胞，首先吸出并丢弃上清液。然后用完整的 DMEM 清洗培养皿两次。接下来，加入 5 毫升 37 摄氏度的完整 DMEM，并使用橡胶警察轻轻分离细胞，将骨髓衍生的巨噬细胞收集在 50 毫升试管中，然后旋转细胞。

将颗粒悬浮在 20 毫升完整的 DMEM 中。最后，通过 triam 蓝色排除对单元格进行计数。使用这种方法，在分离和接种圆形非粘附骨髓细胞减去骨髓驻留巨噬细胞后，只需几天即可获得大量巨噬细胞，正如刚刚证明的那样。

将这些代表性的 BMDM 前体细胞与 G-M-C-S-F 一起孵育。三天后，细胞开始粘附并分化为巨噬细胞。7 天后，观察到骨髓来源的巨噬细胞单层融合。

F four 80 和 H-L-A-D-R 的流式细胞术分析显示，骨髓来源的巨噬细胞表达两种标志物，证实骨髓细胞分化为巨噬细胞。评估骨髓来源的巨噬细胞的 PHA 酸性能力。正如预期的那样监测了细胞内化乳胶速度的能力。

确定每个细胞的珠子数量随着时间的推移而增加，以评估它们的内吞潜力。骨髓来源的巨噬细胞也与柯克斯体共培养。观察到红色的 Burnett 眼 LPS 定位于一个区室，该区室含有蓝色的溶酶体相关膜蛋白 1，但绿色的组织蛋白酶 D 没有，这表明 LPS 存在于晚期内体中，这些内体无法像预期的那样与溶酶体融合骨髓衍生的巨噬细胞。

通过 TMA Wiley 眼的感染进一步分析细菌病原体的相互作用。正如预期的那样，红色的细菌没有定位在容纳 KPS 和 D 的隔室中，它再次以绿色出现。在这个代表性的免疫印迹中，评估了骨髓来源的巨噬细胞信号转导通路，证明骨髓来源的巨噬细胞像组织一样，分离的巨噬细胞响应大肠杆菌 LPS 刺激上调磷酸化的 P 38 α 图激酶水平。

这种方法可以帮助回答细胞微生物学领域的关键问题，例如哪个细胞内区室微定位。