Name: 骨髓衍生的巨噬细胞产 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习从小鼠骨髓中提取并培养原代巨噬细胞的方法，用于免疫学与细胞生物学研究。该技术可获得大量功能性巨噬细胞，适用于病原体相互作用及信号通路分析实验。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由法国国家科学研究中心（CNRS，E.G. 2012-2014 年 PICS 项目）以及坎帕尼亚大区政府（Regione Campania，L.R. n.5, 2002 年 3 月 28 日，资助 Giovanna Mottola）提供的资助支持。Filippo Conti 是科学合作基金会“Infectiopole Sud”的研究员。Nicola Boucherit 是法国研究与技术部的研究员。资助方在研究设计、数据收集、数据分析、发表决定以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

伦理声明
动物处理方案已获得本机构动物伦理委员会的批准 &#34;中国台湾医学与外科实验研究与培训中心科学委员会&#34; （根据Aix-Marseille大学Eric Ghigo持有的CFREMC项目许可10-300122013，遵循Décret N的规定）&#176; 87-848号，1987年10月19日。实验在蒂莫内医学院进行（实验许可号13.385，持有人Eric Ghigo）。
1. 材料与培养基制备
<ol>
	<li>将两把镊子、两把剪刀、两把手术刀片、研钵和研杵进行灭菌处理。</li>
	<li>准备含10%胎牛血清（FCS）、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的完全DMEM培养基。</li>
	<li>用无菌蒸馏水稀释10倍PBS，配制成1倍PBS。</li>
	<li>准备冰冻的1倍PBS、冰冻的完全DMEM以及预热至37 °C的完全DMEM。</li>
</ol>
2. L929 细胞上清液的制备
<ol>
	<li>在完全DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，将L929细胞培养至汇合（二十个175 cm2培养瓶）。</li>
</ol>
注意：诱导造血细胞分化为巨噬细胞需要粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）12。L929 细胞可产生 GM-CSF。
<ol start="2">
	<li>细胞汇合后，更换为新鲜的完全DMEM培养基，将培养瓶转移至32 °C、5% CO2条件下培养10天。</li>
	<li>收集上清液，合并后在750 × g离心10分钟，弃去细胞沉淀。</li>
	<li>将上清液分装至15 ml离心管中，于-20 °C保存。</li>
</ol>
3. 骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死1只小鼠。
	<ol>
		<li>整个实验过程中使用无菌手术刀。用70%酒精消毒皮肤，在每条后肢顶部做切口，并将皮肤向下拉至足部以暴露肌肉。</li>
		<li>剪下后肢，用无菌剪刀和无菌镊子去除皮肤，将后肢放入含有5 ml无菌冰浴1×PBS的无菌培养皿（35/10 mm）中。</li>
		<li>用无菌剪刀和无菌镊子去除附着在骨骼上的组织和肌肉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将骨骼转移至新的无菌培养皿（35/10 mm），其中含有5 ml冰浴无菌1×PBS。用5 ml冰浴无菌1×PBS洗涤骨骼两次。</li>
	<li>将骨骼转移至含有5 ml冰浴无菌1×PBS的无菌研钵中。</li>
	<li>用无菌剪刀在关节处分离胫骨与股骨，然后用研杵在含有5 ml冰浴无菌1×PBS的无菌研钵中轻轻研碎骨骼。</li>
	<li>收集上清液至冰浴的15&#160;ml离心管中。重复此步骤3次。</li>
	<li>通过70 μm尼龙细胞滤网过滤，以去除固体碎片。将滤液在4 °C下以450 × g离心10分钟。</li>
	<li>小心弃去上清液。将沉淀物重悬于10 ml红细胞裂解缓冲液中，裂解30秒，然后加入20 ml冰浴的完全DMEM培养基。</li>
</ol>
注意：此步骤的目的是去除污染的红细胞；因此，必须在2分钟内完成，以避免红细胞裂解缓冲液对造血细胞造成改变。
<ol start="8">
	<li>在 4 °C 条件下，以 450 × g 离心 10 分钟。轻轻弃去上清液。将沉淀重悬于 20 ml 预热至 37 °C 的完全 DMEM 培养基中。</li>
	<li>将解离后的细胞转移至 2 个培养皿（100/20 mm）中。在 37 °C 条件下孵育 4 小时。</li>
	<li>在室温下将上清液收集至 50 ml 离心管中。弃去含有常驻巨噬细胞的培养皿。</li>
</ol>
注意：此步骤的目的是利用培养处理过的塑料表面黏附的特性，去除定居的骨髓巨噬细胞。这些定居的巨噬细胞可用于其他实验。
<ol start="11">
	<li>将收集的上清液在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 10 ml 含 15% L929 细胞上清液的完全 DMEM 培养基轻柔重悬沉淀。通过 40 μm 尼龙细胞筛过滤细胞。</li>
	<li>收集滤液。将收集的滤液（10 ml）加入 140 ml 含 15% L929 细胞培养基的完全 DMEM 中。</li>
	<li>每皿（15 个培养皿，100/20 mm）加入 10 ml 细胞悬液。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>培养细胞 3 天</li>
	<li>加入 10 ml 含 15% L929 的完全 DMEM 培养基，继续培养细胞 4 天。</li>
</ol>
注意：定期使用倒置显微镜监测细胞生长情况（步骤 3.14–3.16）。培养 3 天后可观察到贴壁的巨噬细胞。
4. 收集BMDMs
<ol>
	<li>移除上清液。用完全DMEM洗涤BMDMs 2次。</li>
	<li>加入5 ml预热至37 °C的完全DMEM。用橡胶刮棒轻轻刮擦使BMDMs脱落。</li>
	<li>将BMDMs收集至50 ml离心管中，在450 × g下离心10分钟。用20 ml完全DMEM轻轻重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在台盼蓝染色下计数BMDMs（死亡率不应超过10%）。</li>
</ol>
注意：通常情况下，从15个培养皿（100/20 mm）的巨噬细胞中可获得约6-7.5 × 107个巨噬细胞。每个培养皿（100/20 mm）约含有4-5 × 106个巨噬细胞。
<ol start="5">
	<li>根据实验要求准备骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。在37 °C、5% CO2条件下于完全培养基中培养16小时后，巨噬细胞将再次贴附于支持物表面。</li>
</ol>
5. 储存BMDMs
<ol>
	<li>收集分离的BMDMs（步骤4.3）。在450 × g下离心10分钟。注意：BMDMs可用液氮冷冻保存。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于冻存液中，冻存液由10% DMSO和90% FCS组成，终浓度为4 × 106 个细胞/ml，用移液器将1 ml分装至每支安瓿瓶中。</li>
	<li>以1 °C/min的冷却速率冷冻细胞。24小时后，将安瓿瓶转移至液氮容器中进行长期保存。</li>
</ol>

<ol><li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages%3A+chaos+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li>
<li>Van Furth, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVan+Furth%2C+R+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Adams, D., Halmiton, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+D+%22Inflammation%3A+Basic+Principles+and+Clinical+Correlates%22">Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates</a>. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).</li>
<li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4%2F80%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+microbes%3A+complexity+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li>
<li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte%2Fmacrophage+proteomics%3A+recent+findings+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK%2FVps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li>
<li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li>
<li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li>
</ol>

不存在已声明的利益冲突。

本文所述方案详细介绍了一种大量制备骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的方法。BMDM属于原代细胞，具有由单核细胞分化而来的成熟巨噬细胞的生物学功能和特性，这一点与未成熟的巨噬细胞系细胞不同。BMDM可用于基因筛选（RNAi）、药物筛选、功能研究、宿主-病原体相互作用研究以及众多其他研究领域。
本文介绍的实验步骤非常简单，无需任何专用设备，因此可在实验室或教室中轻松进行。该方法需要一定的练习和操作技巧。此外，也可将骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）保存于液氮中，以便后续实验使用。
成功的BMDM培养有几个关键步骤：1）保持无菌、健康的培养环境；2）骨髓提取需高效；3）L929上清液的质量至关重要；4）避免细胞接触红细胞裂解缓冲液超过2分钟，以防止造血细胞受损。
可以对本方案进行某些修改，但存在一定的限制。1）DMEM 可以用 RPMI 1640 替代，但 BMDM 的生成效率较低；2）可以使用商用 M-CSF（500–1000 UI/mL）替代 L929 上清液，但成本较高，且在细...

巨噬细胞功能的一个重要方面是其在先天免疫和适应性免疫中的作用。由于巨噬细胞具有吞噬惰性颗粒、细菌或寄生虫的能力，因此它们是抵御外来病原体的第一道防线。一旦被内化，微生物将在吞噬溶酶体中被降解。巨噬细胞还能向其他免疫细胞（如T淋巴细胞）发出招募信号并呈递抗原。巨噬细胞来源于单核细胞。单核细胞由骨髓中的髓系干细胞产生，并迁移至外周血和各种组织，在这些部位分化为巨噬细胞。据估计，一只健康的成年小鼠体内约含有108个巨噬细胞，广泛分布于全身各器官和组织中（表1）1,2。由于巨噬细胞能够适应其微环境，因而表现出高度的表型和功能多样性3,4。巨噬细胞最重要的特性是其杀菌活性，这由其吞噬并消灭微生物的能力所决定。吞噬反应由微生物接触所激活的复杂信号网络介导；因此，巨噬细胞能够根据不同的刺激适当调节基因表达。吞噬后，微生物在一种称为吞噬溶酶体的结构中被清除；然而，许多致病性微生物已进化出多种策略以逃避巨噬细胞的杀菌功能5。不同微生物物种所采用的逃逸机制多种多样，这充分说明了吞噬过程6及吞噬溶酶体形成的复杂性。感染性疾病是人类健康的主要问题之一，众多机制和分子参与了巨噬细胞的抗微生物活动。此外，微生物所劫持的杀菌作用靶点仍有许多未知；因此，人们对宿主-病原体相互作用的进化、遗传和生化机制产生了极大兴趣，使巨噬细胞重新成为科学研究的焦点。目前，该领域的大多数研究使用巨噬细胞系进行，但这些细胞系在吞噬活性、细胞因子产生以及氧化爆发的调控方面均与原代巨噬细胞存在差异。此外，它们在显微镜观察方面也不够理想。为了研究巨噬细胞与病原体之间的相互作用，建议使用更具有生理特性的原代巨噬细胞，例如骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。此外，还可以使用基因修饰的BMDMs，因为这些巨噬细胞可直接从转基因小鼠中分离获得，并且借助慢病毒转染等新技术，可通过基因过表达或RNA干扰手段改变其基因表达谱。本文介绍了一种将小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞的方法，可在7天内获得大量巨噬细胞，用于蛋白质组学7、转录组学8、细胞内运输研究9、动态过程分析10、遗传筛选（RNAi）以及药物筛选11等多种功能分析。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10倍浓缩液)</td><td>Lonza</td><td>BEM515F</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网 70 &amp;mu;m 尼龙</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网 40 &amp;mu;m 尼龙</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 (100/20 mm)</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>经培养处理</td></tr><tr><td>培养皿 (35/10 mm)</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

骨髓来源巨噬细胞的制备

Bone Marrow-derived Macrophage Production

巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，由于其强大的杀菌活性，它们构成了抵御外来病原体的第一道防线。巨噬细胞广泛分布于全身，存在于淋巴器官、肝脏、肺、胃肠道、中枢神经系统、骨骼和皮肤中。由于其分布广泛，巨噬细胞参与了多种生理和病理过程。巨噬细胞是高度多能的细胞，能够识别微环境的变化，并维持组织稳态。许多病原体已进化出利用巨噬细胞作为“特洛伊木马”的机制，以在其中存活、复制，感染人类和动物，并在体内传播。近年来，人们对宿主-病原体相互作用在进化、遗传和生化层面的研究兴趣激增，使巨噬细胞再次成为科学关注的焦点。本文描述了一种从小鼠骨髓中分离和培养巨噬细胞的方法，可获得大量巨噬细胞，用于研究宿主-病原体相互作用以及其他相关过程。

本方法旨在数日内简便地获得大量巨噬细胞。小鼠后肢骨骼被取出并在研钵中捣碎，以制备骨髓细胞，如图1所示。在去除骨髓细胞悬液中的常驻巨噬细胞后，将骨髓细胞与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）共同孵育（第0天）。培养3天后，原本呈圆形且不贴壁的细胞开始分化为巨噬细胞并贴壁附着（图1A）。通过F4/80和HLA-DR标志物进行流式细胞术分析显示，这些细胞同时表达两种标志物，证实其已成功分化为巨噬细胞（图1B）。培养7天后，每只小鼠可获得6-7.5 × 107个骨髓来源巨噬细胞（BMDM），形成单层细胞。巨噬细胞可用于多种类型的实验（图2）。BMDM的功能活性可通过多种方式测定。例如，通过乳胶微球的内吞作用来监测BMDM的吞噬功能，结果显示每个细胞内微球数量随时间逐渐增加（图2A）。此外，还评估了BMDM的内吞潜能（图2B）、与细菌病原体的相互作用（图2C）以及信号转导通路（<st...

巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。

巨噬细胞是先天性和适应性免疫反应的关键组成部分，由于它们能够抵御外来病原体的入侵，因此构成了第一道防御屏障，因为……

本实验的总体目标是从尿液和骨髓来源的细胞培养物中生成巨噬细胞。首先通过从小鼠后肢提取骨髓来实现这一目标。第二步，去除骨髓中的常驻巨噬细胞，随后在巨噬细胞分化条件下进一步培养骨髓细胞。当骨髓细胞分化为巨噬细胞后，即可收集用于实验分析。最终，可通过共聚焦显微镜观察细菌脂多糖（LPS）在骨髓来源巨噬细胞内酸性区室中的定位。该技术相较于现有方法（如培养巨噬细胞系）的主要优势在于，能够获得大量原代巨噬细胞。方法的可视化演示至关重要，因为自行操作步骤难以掌握，需要反复练习才能成功。用70%乙醇对已安乐死小鼠的皮肤进行消毒。在每只后肢的顶部做一切口，并将皮肤向下拉至足部以暴露肌肉。接下来，剪下后肢，并使用无菌剪刀和镊子进行操作。去除皮肤时，将腿部置于含有5毫升无菌冰浴PBS的无菌35毫米培养皿中。清除附着在骨骼上的任何皮肤和肌肉，然后将骨骼转移至另一个含有5毫升冰浴的新无菌培养皿中。冰冷且无菌的 PBS。用额外的五毫升 PBS 将骨骼清洗两次，然后将其转移至含有五毫升冰的无菌研钵中。冰冷且无菌的 PBS。现在在关节处将胫骨与股骨分离，并用研杵轻轻研碎骨骼。将上清液在预冷的15毫升离心管中收集三次。然后将组织悬液通过70微米的尼龙细胞滤网过滤。为去除固体碎片，将滤液离心后轻轻弃去上清液。用红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，并在30秒后加入20毫升冰预冷的完全DMEM以终止反应。离心细胞后，将沉淀重悬于20毫升37摄氏度的完全DMEM中，然后将细胞悬液分装至两个100毫米的培养皿中。于37摄氏度孵育4小时后，在室温下将上清液收集至50毫升离心管中。离心去除上清液后，将沉淀重悬于10毫升完全DMEM培养基中，该培养基需添加先前制备的L 9 29细胞上清液，然后通过40微米尼龙细胞筛网过滤细胞。将滤液加入140毫升完全DMEM培养基和L 9 29细胞培养基中，随后将细胞悬液以每皿10毫升分装至15个100毫米培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用10毫升完全DMEM培养基加L 9 29细胞上清液培养细胞3天，再继续培养4天。定期使用倒置显微镜监测细胞生长情况，以收获骨髓来源的巨噬细胞。首先吸出并弃去上清液，然后用完全DMEM培养基洗涤培养皿两次。接着加入5毫升37°C的完全DMEM培养基，用橡胶刮棒轻轻吹打使细胞脱落，将骨髓来源的巨噬细胞收集至50毫升离心管中，随后离心沉淀细胞。用20毫升完全DMEM重悬细胞沉淀。最后，通过台盼蓝排斥法计数细胞。采用此方法，仅需数天即可获得大量巨噬细胞，这些细胞来源于分离并接种的圆形非贴壁骨髓细胞，且已去除骨髓定居巨噬细胞，如上所述。这些具有代表性的BMDM前体细胞用G-M-C-S-F进行孵育。三天后，细胞开始贴壁并分化为巨噬细胞。七天后，可观察到融合的骨髓来源巨噬细胞单层细胞层。通过流式细胞术分析F四80和H-L-A-D-R发现，骨髓来源的巨噬细胞表达这两种标志物，证实骨髓细胞已分化为巨噬细胞。为评估骨髓来源巨噬细胞的酸性能力，检测了细胞内吞乳胶微球的能力，结果符合预期。为评估细胞的内吞潜能，检测了每细胞所含珠粒数量随时间的变化。此外，将骨髓来源的巨噬细胞与伯氏考克斯体共培养。结果显示，呈红色的Burnett眼LPS定位于含有蓝色溶酶体相关膜蛋白1的区室，但不与绿色的组织蛋白酶D共定位，表明该LPS存在于晚期内体中，且该内体无法与溶酶体融合，符合骨髓来源巨噬细胞的预期特征。通过TMA Wiley眼对细菌病原体相互作用进行了进一步分析。如预期所示，呈红色的细菌并未定位于含有KPS和D的区室，而KPS和D再次以绿色显示。在此具有代表性的免疫印迹实验中，检测了骨髓来源巨噬细胞的信号转导通路，结果表明，与组织分离的巨噬细胞类似，骨髓来源巨噬细胞在大肠杆菌LPS刺激下会上调磷酸化的P38α MAP激酶水平。该方法有助于解答细胞微生物学领域的一些关键问题，例如微生物在细胞内的定位位置。

bone-marrow-derived-macrophage-production

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

骨髓衍生的巨噬细胞产

在本视频中，我们演示了骨髓来源巨噬细胞在细菌脂多糖和静脉注射免疫球蛋白刺激下的活化过程。...

小鼠骨髓来源巨噬细胞对抗体刺激的活化

本文描述了一种简便易行的自适应方法 体外...

利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍一种分离小鼠腹腔巨噬细胞的简单方案。该操作随后进行RNA提取，以在Toll样受体刺激后开展基因表达分析。...

从小鼠腹腔巨噬细胞分离以进行Toll样受体刺激后的基因表达分析

代谢重编程是M1和M2型巨噬细胞极化的特征及先决条件。本文描述了一种用于检测小鼠骨髓来源巨噬细胞糖酵解和线粒体功能基本参数的实验方法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢及其表型。...

利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养的骨髓细胞可形成包含巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的异质性细胞群。本方法重点利用主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）和透明质酸（HA）结合能力来区分GM-CSF培养体系中的巨噬细胞与树突状细胞。该培养体系中的巨噬细胞在诸多特性上与肺泡巨噬细胞相似。...

小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。...

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

本方案描述了从人诱导性多能干细胞高效生成巨噬细胞的方法，以及对这些细胞进行后续表征的技术。通过细胞表面标志物表达、基因表达分析和功能检测，评估由诱导性多能干细胞衍生的巨噬细胞的表型与功能特性。...

由多能干细胞生成并表征人类巨噬细胞

本方案旨在培养缺乏四氢生物蝶呤（BH4）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的原代小鼠巨噬细胞，以研究一氧化氮-氧化还原生物学。该研究重点在于减少传统分离和培养方法中可能存在的BH4污染及其他人为假象，这些因素可能干扰实验结果并影响对数据的正确解读。...

分离与 体外 骨髓来源巨噬细胞的培养用于一氧化氮氧化还原生物学研究

本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。...

从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

学习从小鼠骨髓中提取并培养原代巨噬细胞的方法，用于免疫学与细胞生物学研究。该技术可获得大量功能性巨噬细胞，适用于病原体相互作用及信号通路分析实验。

骨髓来源巨噬细胞的制备

探索更多视频