Name: 新生小鼠骨髓分离和骨髓来源巨噬细胞的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习从7-9日龄新生小鼠分离骨髓的非酶法技术，使用L929细胞上清液诱导分化为功能性巨噬细胞。该方法通过F4/80、CD206和CD11b表面抗原表征细胞，为新生儿免疫学研究提供可重复的实验模型。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院 [R01 AI163333] 对 CMR 的资助。我们还感谢以下基金为西弗吉尼亚大学流式细胞术与单细胞核心设施提供的额外资金支持：西弗吉尼亚临床与转化科学研究所（WV CTSI）基金 GM104942、肿瘤微环境 CoBRE 基金 GM121322 以及美国国立卫生研究院基金 OD016165。

所有实验程序均经西弗吉尼亚州机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》的建议进行。本研究使用了C57BL/6J小鼠幼崽。所用全部试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 培养基制备
<ol>
	<li>在5 mL离心管中配制3 mL MEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、25 mM HEPES以及青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 µg/mL），并置于冰上保存。</li>
	<li>若需将骨髓前体细胞储存在液氮中，请配制含10% DMEM、80% FBS和10% DMSO的冻存液。</li>
	<li>配制完全DMEM培养基：在DMEM中添加10% FBS、2 mM谷氨酰胺、25 mM HEPES以及青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 µg/mL）。</li>
	<li>用于巨噬细胞分化时，配制含10% FBS、2 mM谷氨酰胺、青霉素（100 U/mL）/链霉素（100 µg/mL）以及10% L929细胞上清液9,10,11的DMEM培养基。</li>
</ol>
2. L929 细胞上清液的制备
<ol>
	<li>从液氮中取出冻存的L929细胞，解冻后转移至含有5 mL完全DMEM培养基的15 mL离心管中，在室温下以350 × g离心5分钟。</li>
	<li>用5 mL完全DMEM培养基重悬细胞，按2×105个细胞的密度接种至T25培养瓶中。使用0.4%台盼蓝染色，通过自动细胞计数仪进行细胞计数。于37 °C、5% CO2条件下培养，直至细胞融合度达到70%。</li>
	<li>消化细胞时，先用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，吸除PBS后加入2.5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟，随后加入5 mL完全DMEM培养基终止消化。</li>
	<li>收集细胞悬液，在室温下以350 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀用15 mL完全DMEM培养基重悬，转移至T75培养瓶中。</li>
	<li>于37 °C、5% CO2条件下继续培养，待细胞融合度达到90%时收集培养上清液，在4 °C下以500 × g离心5分钟。将含有M-CSF的培养基经0.45 µm滤膜过滤后，分装为每份5 mL，于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 动物准备
<ol>
	<li>在生物安全柜中，小心地将7至9日龄的C57BL/6J小鼠幼崽（一窝6只）与母鼠分离，并将其放入另一个笼子中。</li>
	<li>在钟形罩或其他密闭容器中，将一个棉球浸入2 mL兽用级异氟烷。</li>
	<li>将一只幼崽放入容器中并盖上盖子。观察幼崽约90秒，确保其完全静止且失去意识。</li>
	<li>迅速取出幼崽，并使用锋利的剪刀将其断头处死（遵循机构批准的操作规程），以避免幼崽恢复意识。 
	注意：新生幼崽呼吸过浅，仅通过吸入异氟烷无法实现有效安乐死。</li>
	<li>每次取出幼崽后务必盖紧容器盖子。同一棉球可用于处理5至7只幼崽。</li>
</ol>
4. 新生小鼠骨髓的分离
<ol>
	<li>用70%乙醇对新生儿身体进行消毒。</li>
	<li>使用镊子和细尖头&#160;手术剪，在两者之间做一切口 
	腹部和后肢。&#160;将后肢的皮肤向足部方向撕下。</li>
	<li>使用锋利的镊子刮除附着在骨骼上的结缔组织和肌肉。</li>
	<li>切断胫骨和股骨，如&#160;如图1所示，使用剪刀剪下并分离&#160;移除。&#160;用镊子将这些骨骼放入冰上的培养基管中。对每只幼鼠重复此操作。</li>
	<li>用镊子将骨骼转移至带有收集管的40 µm滤筛中。使用3 mL注射器推杆按压滤筛，研碎骨骼并释放骨髓。</li>
	<li>将细胞悬液在350 x g 4 °C下离心5分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，用0.2% NaCl（低渗溶液）轻柔吹打重悬细胞，以裂解红细胞。立即加入等体积的1.6% NaCl，使溶液恢复等渗状态。</li>
	<li>350 x g 离心 g 4 °C 下离心 5 分钟，弃去裂解液。</li>
	<li>用完全DMEM重悬细胞以立即使用，或用冻存培养基重悬以储存，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。 
	注意：在本研究中，该方法获得了 6.55 (± 1.44) × 106 骨髓细胞/幼鼠图1E).</li>
	<li>将细胞置于冻存液中于 -80 °C 保存，或按如下所述立即使用。 
	注意：由于骨骼较幼嫩，具有一定的透明度，足以透过骨壁观察到骨髓。在牵拉骨骼时需格外小心，因为轻微的压力就可能导致骨髓释放。新生个体骨骼中的骨髓呈液态，不同于成年个体骨骼中完整的条索状骨髓。若在采集骨骼过程中骨髓外溢，则难以收集。</li>
</ol>
5. 新生小鼠骨髓来源巨噬细胞的分化
<ol>
	<li>每瓶T75培养瓶中接种2 × 107个骨髓细胞，加入10 mL含10% L929细胞上清液（2.5 mL）的完全DMEM培养基，作为M-CSF来源。将培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下培养5天。在分化第3天加入2 mL L929条件培养基。</li>
	<li>每天使用倒置显微镜和成像系统（20倍放大）观察细胞。分化完成后，巨噬细胞应呈现贴壁、伸长且形态异质的特征（图2）。</li>
	<li>为进行后续实验，收集巨噬细胞前先吸除分化培养基。</li>
	<li>用5 mL PBS洗涤细胞，以去除未贴壁细胞及可能干扰细胞脱落的血清蛋白，随后吸除PBS。</li>
	<li>向培养瓶中加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液以收获细胞。将培养瓶置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育5分钟，然后加入5 mL DMEM终止消化。</li>
	<li>用移液器吹打使细胞脱落，室温下以350 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1 mL完全DMEM培养基中，使用台盼蓝染色检测细胞数量和活力。采用本方法分离的BMDM细胞产量为7.05（± 2.52）×105个/仔鼠（图1E）。 
	注意：观察分化第2天开始出现的纺锤形细胞（图1B，红色箭头）。若培养基颜色变黄，提示已耗尽，可在分化第4天补充L929条件培养基；不建议完全更换培养基。</li>
</ol>
6. 免疫标记与流式细胞术分析
<ol>
	<li>按照制造商推荐的方法，用100 μL/标记的流式细胞术缓冲液（含2 mM EDTA和0.5%牛血清白蛋白的PBS）重悬BMDMs（2×105/标记），并加入FcR阻断试剂（10 µL/107细胞）以阻断非特异性抗体标记。冰上孵育10分钟。 
	注意：细胞可在总体积中进行批量阻断，也可在单个孔或管中分别阻断。后续所有步骤中提及的试剂用量和体积均为每种细胞标记物在最终100 μL体积中的用量。</li>
	<li>加入200 µL流式细胞术缓冲液洗涤细胞，在室温下以525 × g离心7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬后接种于U型底96孔板中，每孔细胞密度为5 × 105个。在100 µL流式细胞术缓冲液中加入FVS780活/死细胞染料（稀释3,000倍）、BV786-CD11b、PE-F4/80和AlexaFluor488-CD206抗体，每种抗体用量为0.625 µL，可单独或联合使用12,13,14,15。细胞置于冰上避光孵育45分钟。</li>
	<li>加入100 µL流式细胞术缓冲液，室温下以525 × g离心7分钟洗涤细胞。</li>
	<li>吸除上清液，轻轻涡旋重悬细胞沉淀。每孔加入100 µL 0.4%多聚甲醛，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>加入100 µL流式细胞术缓冲液，室温下以525 × g离心7分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞重悬于400 µL流式细胞术缓冲液中，使用流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>
7. 体外 评估新生小鼠骨髓来源巨噬细胞吞噬效率的实验方法
<ol>
	<li>将BMDMs重悬于不含酚红和抗生素的完全DMEM培养基中，并以每孔500 µL体积、每象限2 × 105个细胞的密度接种至35 mm四象限培养皿中。</li>
	<li>为制备感染复数（MOI）为25或其他所需MOI的细菌接种物，取出一份预先计算好的、保存于-80 °C的Escherichia coli O1:K1:H7菌种。</li>
	<li>将所需体积的细菌转移至1.7 mL微量离心管中。加入PBS至总体积为1 mL以洗涤细菌，然后在室温下以2,000 × g离心5分钟收集菌体。重复洗涤步骤一次。</li>
	<li>将细菌沉淀重悬于50 µL PBS中，并加入绿色荧光pH敏感性染料，使其终浓度为500 µM。该染料在中性pH下无荧光信号，而在酸性环境（如吞噬过程中酸化的吞噬体）中可发出强烈荧光。</li>
	<li>避光孵育细菌20分钟，使染料完成偶联。</li>
	<li>用1 mL PBS将细菌洗涤四次，每次在室温下以1,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细菌重悬于500 µL不含酚红的完全DMEM培养基中，并加入BMDM培养物中。</li>
	<li>将BMDMs置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时，随后加入200 ng可穿透细胞膜的红色荧光染料以标记溶酶体。 
	注意：可通过荧光显微镜观察吞噬性细菌。</li>
</ol>

Phagocytic Assay Evaluation of Neonatal Bone Marrow Derived Macrophages 

<ol><li>Lucas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+bone+marrow+and+its+role+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).</li>
<li>Deb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+stem+cells+turn+into+bone+and+fat%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">How stem cells turn into bone and fat.</a> N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).</li>
<li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%3A+Aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li>
<li>Soleimani, M., Nadri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).</li>
<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+hematopoietic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific hematopoietic growth factors.</a> N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Translat%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Smith, A. M., Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+to+enhance+global+drug+development+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates.</a> Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).</li>
<li>Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+clinical+trials+for+children+and+young+people%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Challenges in clinical trials for children and young people.</a> Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).</li>
<li>Heap, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+characterization+of+the+L929+cell+supernatant+and+its+role+in+BMDM+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation.</a> Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).</li>
<li>Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bone+marrow-derived+macrophages+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.</a> J Vis Exp. (196), e64566(2023).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+An+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-1%3A+A+macrophage+differentiation+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody.</a> Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).</li>
<li>Austyn, J. M., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F4%2F80%2C+a+monoclonal+antibody+directed+specifically+against+the+mouse+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage.</a> Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).</li>
<li>Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+murine+CD68%2B+CCR2%2B+and+CD68%2B+CD206%2B+lung+macrophages+in+acute+pancreatitis-associated+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury.</a> PLoS One. 7 (10), e42654(2012).</li>
<li>Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+physiological+and+pathological+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy.</a> Front Immunol. 10, 792(2019).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+CD11c+defines+two+types+of+tissue-resident+macrophages+with+different+origins+in+steady-state+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands.</a> Sci Rep. 12 (1), 931(2022).</li>
<li>Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowing+the+immaturity+myth%3A+The+cost+of+defending+from+neonatal+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease.</a> Front Immunol. 9, 1077(2018).</li>
<li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+newborn+and+young+infant+from+infectious+diseases%3A+Lessons+from+immune+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny.</a> Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).</li>
<li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).</li>
<li>Winterberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phenotypic+features+of+neonatal+murine+macrophages%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages).</a> Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).</li>
<li>de Brito Monteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF-+and+L929-derived+macrophages+present+distinct+metabolic+profiles+with+similar+inflammatory+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes.</a> Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).</li>
</ol>

作者声明本文无相关利益冲突。

涉及新生小鼠模型的研究可能面临诸多挑战。新生小鼠的免疫系统正处于发育阶段，其特性与成年个体显著不同8。因此，不应假设来自动物成年模型的数据可直接适用于新生儿，已有若干研究明确阐述了这一观点18,19。因此，必须使用针对新生期的特异性模型和细胞来源，以深入研究生命早期免疫应答的复杂机制。然而，由于新生小鼠体型微小、对外界刺激敏感且身体结构脆弱，可获取的生物样本量通常有限，且采样过程可能耗时较长。本实验方案建立了一种简单且高效的方法，用于从小鼠新生个体中提取骨髓组织。
成年小鼠的骨骼足够大，可插入针头并轻松冲洗出骨髓。相反，由于新生小鼠骨骼体积小且脆弱，用针头获取其骨髓具有挑战性。一些研究采用II型胶原酶和分散酶进行酶消化处理20。在此，由于新生骨骼柔软且细小，我们采用了碾碎法来释放骨髓。经过纯化后，根据具体研究需求，这些细胞可被诱导分化为特定的细胞类型。
新生小鼠表现出独特的表型巨噬细胞群体21。本研究阐明了从出生7至9天幼鼠的骨髓细胞中分化骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的方法，且无需使用酶处理。该方法的关键步骤包括：新生小鼠幼崽组织较为脆弱，收集小骨时需避免骨髓释放，以及准确定位胫骨和股骨上使用剪刀剪开的合适位置。我们观察到，与成年小鼠来源的BMDM相比，新生小鼠BMDM在培养过程中更为敏感，且从新生小鼠中分离骨髓的时间过长会抑制其分化能力。因此，不建议一次同时处理超过7只幼鼠。此外，在分化第2天添加BMDM分化培养基也会导致较差的结果，如分化效果不佳和细胞活力降低。
本实验方案使用L929细胞上清液作为M-CSF来源，以诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。L929细胞是一种小鼠成纤维细胞，已知可产生大量M-CSF10。在使用L929上清液时，巨噬细胞除暴露于M-CSF外，还可能接触到上清液中分泌的其他物质。也可使用市售的纯化M-CSF进行巨噬细胞分化；然而，我们尚未将其与L929细胞培养上清液的使用效果进行直接比较。此外需注意，L de Brito Monteiro等人的研究发现，使用L929上清液与市售M-CSF所生成的巨噬细胞具有不同的代谢特征22。
该方法建立了一种省时且经济的方法，无需使用任何消化酶。该技术可稳定分离新生小鼠骨髓，并成功实现新生小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的明确分化。分离获得的新生小鼠BMDMs可进一步用于研究多种感染过程中新生小鼠巨噬细胞的动态变化，以及这些细胞对炎症反应的调控作用。该方法的局限性在于初次建立时存在一定的学习曲线，尤其是在处理细小骨骼的拉取操作方面，但随着经验积累，操作时间将缩短，细胞存活率也会提高。此外，每窝幼鼠的数量也是影响可分化巨噬细胞数量的因素之一，需根据实验需求加以考虑。

骨髓包含可自我更新并能分化为多种细胞谱系的造血干细胞和间充质干细胞群体。&#160;骨髓中的造血干细胞可分化为髓系和淋巴系细胞1。间充质干细胞可生成成骨细胞（骨）、脂肪细胞（脂肪）或软骨细胞（软骨）2。这些细胞在细胞生物学和组织工程领域具有多种应用，包括基因治疗3,4。骨髓中存在的祖细胞在谱系特异性生长因子的作用下可分化为特定细胞类型。例如，促红细胞生成素可促进红系祖细胞的增殖，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）可刺激中性粒细胞集落的生长，而血小板生成素则可调控血小板的生成5。利用细胞表面抗原标记的流式细胞术（FACS）和磁珠激活细胞分选（MACS）是分离和纯化特定骨髓来源细胞类型的成熟方法6。
尽管新生儿研究正在不断推进，以探寻新生儿死亡的原因并解决早产期间出现的并发症，但直接的治疗手段开发仍是尚未满足的医疗需求。Smith和Davis指出， &#34;儿科患者仍然是治疗上的孤儿&#34;7样本量小、结局的终身影响以及在新生儿临床研究中获取知情同意的伦理问题等诸多挑战8因此，对 体内 和 体外 针对新生儿的特定研究模型以实现转化相关性。由于啮齿类动物在解剖和组织水平上与人类具有相似性，且妊娠期短、每胎产仔数量多，因此是最常被研究的哺乳动物模型系统。
在此，我们描述了一种详细、可行性高且可重复的小鼠幼崽（7–9日龄）骨髓分离方法，并阐述其向巨噬细胞分化的潜能。然而，通过使用不同的分化信号，也可获得多种其他细胞谱系。我们还展示了细胞表面标志物的存在以及 体外 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）预期的吞噬活性

<table><tbody><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>Greiner</td><td>542040</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>96 孔圆底（U 型）板</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-65</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b-BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>740861</td><td>FACS 分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD206-Alexa Fluor488</td><td>BD Biosciences</td><td>141709</td><td>FACS 分析</td></tr><tr><td>抗小鼠 F4/80-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>565410</td><td>FACS 分析</td></tr><tr><td>Countess3</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSI-C3ACC</td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>WN182</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td>感染</td></tr><tr><td>EVOS FL&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12-563-649</td><td>细胞成像系统&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor&amp;nbsp;</td><td>76419-584</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>FluoroBright BMDM</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>无染料培养基</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td></td><td>分化</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>流式细胞仪</td></tr><tr><td>溶酶体示踪红 DND 99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>pHrodo 绿色 STP 酯&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P35369</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Cell star</td><td>658170</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300120</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>Zeiss 710&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>P20GM103434</td><td>共聚焦显微镜</td></tr></tbody></table>

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

从成年小鼠中分离骨髓的多种技术已较为成熟。然而，从新生小鼠中分离骨髓仍具有挑战性且耗时较长，但对于某些研究模型而言，这一过程具有转化意义且必不可少。本实验方案描述了一种高效且简便的方法，用于制备7至9日龄幼鼠的骨髓细胞。这些细胞可进一步分离或分化为特定的目标细胞类型。巨噬细胞是关键的免疫细胞，在炎症与感染过程中发挥重要作用。在发育过程中，新生期巨噬细胞对组织重塑具有显著贡献。此外，新生期巨噬细胞的表型和功能与其成年对应细胞存在差异。本方案还详细阐述了在L929条件培养基存在下，由分离所得骨髓细胞分化为新生期巨噬细胞的过程。采用流式细胞术分析鉴定分化后新生期巨噬细胞的表面标志物。为验证其功能，使用pH敏感性染料标记的大肠杆菌（Escherichia coli）检测了其吞噬效率。

采用本研究所述方法，可从五只C57BL/6小鼠仔鼠组成的同窝仔鼠中成功分离出2500万至3700万个骨髓细胞。该方法已在5至7只仔鼠的同窝规模中得到验证。本实验中分离的最小小鼠年龄为7日龄。根据同窝仔鼠数量及实验所需细胞数（若少于一百万个），研究人员可尝试将本方案用于小于7日龄的小鼠。在以L929细胞上清作为M-CSF来源的条件下，骨髓细胞在5天内分化为巨噬细胞（图2）。分化第二天可观察到纺锤形细胞的形成（图2B），第三天约一半细胞呈现纺锤形（图2C），第五天大多数细胞已贴壁并形成细长的纺锤形状（图2D）。采用该方法，从5只7日龄仔鼠获得的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）产量为250万至500万个细胞。
为了在表型上表征分化后的BMDM，对培养5天的细胞进行了CD11b、CD206和F4/80的免疫标记。前向/侧向散射及单标记设门方案见补充图1。流式细胞分析结果显示，76.4%的BMDM同时表达CD11b和F4/80（图3A）。F480-CD11b+细胞群的比例与CD206阳性细胞的大致数量一致（图3B）。后者通常被视为与M2样巨噬细胞表型相符的标志物；尽管CD206标记的丰度差异可达两倍之多，但F4/80标记阳性细胞占比较高，这与M-CSF促进细胞向M1样表型分化的特性相符16,17（图3）。
我们进一步评估了分化后的新生小鼠BMDM吞噬细菌并将其转运至酸化区室的能力，以此作为功能检测指标。用pH敏感性染料标记的细菌仅在被吞噬并转运至酸化区室时才会发出绿色荧光。感染后，在BMDM内检测到大量呈绿色荧光的吞噬细菌图 4A）。绿色荧光进一步与红色荧光共定位，后者指示酸化的溶酶体（图 4B，C). 在整个4小时感染过程中，也观察了新生小鼠BMDM中绿色pH敏感性染料阳性吞噬作用及其形态变化。图4D 和补充视频）。此处展示的功能活性与M1样炎症性巨噬细胞活性一致。
<img alt="培养皿中的骨髓提取、组织解剖阶段、细胞过滤、柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：7日龄C57BL/6J小鼠幼崽骨髓的分离。（A）置于100 mm培养皿中的7日龄幼崽后肢骨骼。（B）去除皮肤和皮下组织后的7日龄幼崽后肢；黑色虚线表示骨髓提取时的切割位置。（C）处理后尚未压碎的新生小鼠后肢骨骼及其骨髓。（D）使用注射器活塞在滤筛中压碎后的新生小鼠后肢骨骼。（E）三次独立实验获得的骨髓（BM）及骨髓来源巨噬细胞的平均数量±标准误差。（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养生长进程、显微镜图像、第1-5天、200 µm比例尺、细胞增殖研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：由7天龄新生小鼠骨髓细胞分化为BMDM。 分化第1天（A）、第2天（B）、第3天（C）和第5天（D）的骨髓细胞。图B中的红色箭头指示分化第2天呈纺锤形贴壁的细胞。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图；CD11b 对 F480，CD206。数据显示细胞群体分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：通过流式细胞术检测小鼠巨噬细胞标志物。 分化的新生小鼠骨髓来源巨噬细胞显示表达 F4/80 和 CD11b（A）或 CD206 和 CD11b（B）表面抗原。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="染色细胞的荧光显微镜图像；绿色、红色通道，合并视图，20µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：新生小鼠骨髓来源巨噬细胞对 pH 敏感性染料标记的 E. coli 的吞噬作用。（A）感染 4 小时后，骨髓来源巨噬细胞内可见吞噬的 pH 敏感性染料标记（绿色）的 E. coli。（B）用酸化溶酶体染色剂标记的 BMDMs（红色）。（C）图（A）与（B）的合并图像。比例尺：20 µm。（D）绿色荧光细菌在相差显微镜图像巨噬细胞上的叠加图。图（D）的放大倍数与图（A）相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充视频。新生小鼠BMDM吞噬绿色荧光细菌的活细胞成像，持续4小时，对应图4 A面板。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/Annamanedi-et-al_Supplemental-Figure-2_highres.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充图1：BMDM的流式细胞术分析。（A）BMDM首先根据FSC和SSC设门，以去除碎片和双联体。分别显示F4/80（B）、CD11b（C）和CD206（D）的单染结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/Supplemental%20Figure%201%20v2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。

从成年小鼠中分离骨髓的多种技术已较为成熟。然而，从新生小鼠中分离骨髓仍具有挑战性……

本研究的目的是了解新生儿对细菌感染的早期免疫反应中存在的一些局限性。为实现这一目标，我们需要建立并使用针对新生儿的特异性研究模型。从出生第7天的幼鼠中分离骨髓具有挑战性，且目前尚未建立完善的方法。与其他骨髓来源的巨噬细胞相比，新生小鼠骨髓来源的巨噬细胞更为敏感且易于受到应激。本方案所采用的技术简单且可重复，可指导使用者在不使用任何酶的情况下，从小龄7至9天的新生小鼠中分离骨髓。本研究提供了一种标准化的方法，用于从新生小鼠中分离骨髓来源的巨噬细胞，可用于解答有关新生期免疫学的问题。该可重复的方法为在多个专业领域推进新生期免疫研究提供了特定年龄的模型。在断头后，使用70%乙醇对麻醉后的新生小鼠尸体进行消毒。使用镊子和尖头手术剪，在腹部与后肢之间做一切口。然后将后肢的皮肤向足部方向撕下。用锋利的镊子刮除附着在骨骼上的结缔组织和肌肉。用剪刀剪下胫骨和股骨。使用镊子将胫骨和股骨放入盛有 MEM 培养基并置于冰上的离心管中。将骨骼转移至带有收集管的 40 微米细胞筛中。用3毫升注射器活塞在滤筛上压碎骨骼，以释放骨髓。将细胞悬液在4°C下以350×g离心5分钟。吸除上清液，并将细胞轻轻重悬于0.2%氯化钠溶液中，制成低渗溶液以裂解红细胞。立即加入等体积的1.6%氯化钠溶液，使溶液呈等渗状态。离心上清液并弃去裂解液。用完全DMEM重悬细胞，并使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。首先，将2000万个新生小鼠骨髓细胞接种至每个T75培养瓶中，每瓶加入10毫升含2.5毫升10% L929细胞上清液的完全DMEM培养基。将培养瓶置于37°C、5% CO₂条件下培养5天。在分化第3天，向培养瓶中加入2毫升L929条件培养基。在20倍放大倍数的倒置显微镜下每日观察细胞。在第5天收集巨噬细胞时，吸去培养瓶中的分化培养基。用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除非贴壁细胞和血清蛋白。向培养瓶中加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，置于含5%二氧化碳的37°C培养箱中孵育。5分钟后，加入5 mL DMEM，用移液器吹打使细胞脱落。将细胞悬液以350×g离心5分钟。用一毫升完全DMEM培养基解离细胞腭。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。在L929细胞上清液存在条件下，骨髓细胞在五天内分化为巨噬细胞。从第二天开始观察到纺锤形细胞的形成，到第3天时近一半细胞呈现此形态，到第5天时大多数细胞均呈现纺锤形。首先，将小鼠新生骨髓来源的巨噬细胞重悬于不含酚红和抗生素的完全DMEM培养基中。以每象限200,000个细胞的密度，将500微升细胞悬液接种至35毫米四象限培养皿中。从 -80 摄氏度取出预配置的大肠杆菌菌种。取适量体积的菌悬液加入 1.7 毫升微量离心管中，制备感染复数为 25 的细菌接种物。然后加入 PBS 至总体积为 1 毫升。将细菌悬液在2000g下离心5分钟，并将沉淀重悬于50 µL PBS中。加入绿色荧光pH敏感性染料，使其终浓度为500 µmol/L，在避光条件下孵育20分钟以完成染料偶联。用1 mL PBS将细菌洗涤4次，每次在1000g下离心5分钟。将沉淀重悬于500微升不含酚红的完全DMEM培养基中，并加入骨髓来源的巨噬细胞培养物。在37°C和5%二氧化碳条件下培养4小时。加入200纳克细胞通透性红色荧光染料以标记溶酶体。细菌感染后，可在骨髓来源的巨噬细胞内检测到大量绿色荧光细菌的吞噬现象。绿色荧光进一步与指示酸化溶酶体的红色荧光共定位。在长达四小时的感染过程中，亦可观察到表达绿色pH敏感性染料阳性的新生小鼠骨髓来源巨噬细胞的吞噬作用及其形态变化。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

新生小鼠骨髓分离和骨髓来源巨噬细胞的制备

巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。...

小鼠巨噬细胞的耗竭与重建

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巨噬细胞长期以来被认为是先天性和适应性免疫应答的关键组成部分。近年来，关于巨噬细胞与微生物之间在进化、遗传和生化方面相互作用的知识迅速增长，使科学界对巨噬细胞重新给予了高度关注。本文介绍了一种从小鼠骨髓中分化巨噬细胞的方法。...

骨髓来源巨噬细胞的制备

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抗体类药物对小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞活化影响的评估

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

本文提供了一种在小鼠骨髓来源的树突状细胞和巨噬细胞中表达荧光融合蛋白的详细实验方案。该方法基于利用逆转录病毒载体转导骨髓前体细胞，随后将其分化为巨噬细胞和树突状细胞。 体外.

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本方案旨在培养缺乏四氢生物蝶呤（BH4）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的原代小鼠巨噬细胞，以研究一氧化氮-氧化还原生物学。该研究重点在于减少传统分离和培养方法中可能存在的BH4污染及其他人为假象，这些因素可能干扰实验结果并影响对数据的正确解读。...

分离与 体外 骨髓来源巨噬细胞的培养用于一氧化氮氧化还原生物学研究

本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。...

从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

学习从7-9日龄新生小鼠分离骨髓的非酶法技术，使用L929细胞上清液诱导分化为功能性巨噬细胞。该方法通过F4/80、CD206和CD11b表面抗原表征细胞，为新生儿免疫学研究提供可重复的实验模型。

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

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