Name: 在现场研究巨噬细胞吞噬溶酶体生源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习利用活细胞成像技术实时观察巨噬细胞中吞噬体成熟与吞噬溶酶体生源的动态过程。该方法通过荧光标记葡聚糖探针定量分析溶酶体物质向吞噬体的递送，为免疫学研究提供高时间分辨率的定量数据。

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感谢吞噬体生物学实验室成员对本文稿的审阅。本工作由亥姆霍兹青年研究员基金（亥姆霍兹协会的倡议与网络基金）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）优先计划SPP1580项目基金资助。

本方案中的动物护理及所有操作均遵循机构和国家的指导原则。
提前准备好标有“Π-&#34; 的试剂。
1. BMMs 的制备
<ol>
	<li>通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>去除股骨和胫骨，将骨骼从组织中分离，并修剪两端以便获取骨髓。</li>
	<li>将骨骼置于冰上预冷的 PBS 或冰上预冷的 DMEM 培养基（添加 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）中，冰上保存直至下一步操作。 
	注意在II级生物安全柜中进行以下步骤，以最大限度降低污染风险。</li>
	<li>使用连接1 ml注射器的26 G（0.45 mm）针头，以含青霉素/链霉素的冷PBS冲洗髓腔。</li>
	<li>以350 × g离心10分钟，轻柔沉淀细胞，将沉淀重悬于BMM培养基中，并接种于无涂层的无菌微生物培养皿中。
	<ol>
		<li>BMM 培养基的制备
		<ul type="disc">
			<li>Dulbecco改良型Eagle培养基 DMEM</li>
			<li>10% 灭活胎牛血清</li>
			<li>20% 小鼠成纤维细胞 L929 细胞系培养上清液（巨噬细胞集落刺激因子，M-CSF 来源）</li>
			<li>5% 马血清</li>
			<li>2 mM 谷氨酰胺</li>
		</ul>
		</li>
		<li>L929细胞系培养基的制备
		<ul type="disc">
			<li>RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所）1640培养基</li>
			<li>10% 灭活胎牛血清</li>
			<li>2 mM 谷氨酰胺</li>
		</ul>
		</li>
		<li>小鼠成纤维细胞L929细胞系培养上清液的制备
		<ul type="disc">
			<li>汇合的L929细胞按1:4比例传代，于175 cm²培养瓶中培养2&#160;使用20 ml培养瓶培养2天&#160;L929 培养基及培养上清在培养 48 小时后收集，经滤膜过滤后加入 BMM 培养基中</li>
		</ul>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将从股骨中冲洗出的细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2 大气</li>
	<li>每48小时（最长72小时）孵育后，吸除培养基并更换为新鲜BMM培养基，持续培养至10天。经流式细胞术检测，超过95%的细胞CD14呈阳性。CD14是一种模式识别受体，由&#160;主要由巨噬细胞完成。通过测定表达该受体的细胞百分比，已成功获得纯化的贴壁BMM培养物。</li>
</ol>
注意：若使用其他细胞类型，需相应地准备和培养细胞。
2. 作为吞噬性货物的微珠包被
<ol>
	<li>制备 1 ml 微球悬浮液时，使用 400 μl 的 2.5% 3 µm&#160;羧基化聚苯乙烯微粒，或其他替代微粒。</li>
	<li>将微球悬浮液转移至 1.5&#160;ml 微离心管中，用 PBS 洗涤 3 次&#160;，然后向微球沉淀中加入 100 μl pH 6.7 的 500 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐（MES 缓冲液）。</li>
	<li>将 50 μg 小鼠 IgG（多克隆 IgG 抗体）溶解于 50 μl&#160;无菌 ddH2O 中，并加入微球悬浮液中。</li>
	<li>用无菌 ddH2O 定容至 1 ml（450 μl）。</li>
	<li>在室温下于旋转仪上孵育 15 分钟。</li>
	<li>配制浓度为 10 mg/ml 的 EDAC 交联剂（N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐），并加入 14 μl 至微球悬浮液中。 
	注意：EDAC 可将 IgG 的氨基与微球表面的羧基交联，从而促进 IgG 在微球表面的固定。这对微球的摄取至关重要，因此该溶液应新鲜配制。</li>
	<li>在室温下于旋转仪上孵育 1 小时。</li>
	<li>再加入 14 μl EDAC 交联剂，并在室温下于旋转仪上继续孵育 1 小时。</li>
	<li>在微量离心机中以 10,000 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>用终止缓冲液（含 1% Triton-X 100 的 10 mM Tris 缓冲液，pH 9.4）洗涤微球 3 次&#160;，以终止交联反应；方法是将沉淀重悬于终止缓冲液中，并在 10,000 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤微球 3 次&#160;，并将沉淀重悬于 1 ml PBS 中。 
	可选：分装成 30–50 μl 的工作 aliquot。</li>
	<li>将 IgG 包被的微球悬浮液保存在 4 °C，不超过 4 周&#160;，切勿冷冻。</li>
</ol>
注意：可向悬浮液中添加防腐剂（如叠氮化钠），终浓度为0.02%（w/v），以防止细菌生长和污染。在此情况下，使用前必须洗涤磁珠，以避免防腐剂的细胞毒性作用。取部分悬浮液在10,000 × g离心2分钟，通过将沉淀重悬于PBS中洗涤磁珠。重复洗涤3次。
3. 葡聚糖探针储备液的制备
<ol>
	<li>根据制造商说明书，将 Texas Red 70,000 道尔顿葡聚糖（Dex70kD）溶于 PBS 中，配制成 20 mg/ml 的溶液，并于 -20 °C 保存。 
	注意：储存液可于 -20 °C 保存数月，或于 4 °C 保存数周，具体请参见制造商提供的文档。</li>
	<li>将储存液用完全 DMEM 细胞培养基（DMEM、10% FCS、2 mM L-谷氨酰胺）稀释至约&#160;1 mg/ml，制备实验用葡聚糖溶液（该溶液为数倍浓缩液，后续将稀释至终工作浓度 20 μg/ml 后加入细胞）。</li>
	<li>使用超声水浴对葡聚糖分装液进行超声处理 5 分钟，以混匀溶液并溶解可能在成像过程中导致伪影的聚集体。</li>
	<li>在微量离心机中以最大离心力离心 5 分钟，以去除溶液中未溶解的团块或污染物。</li>
	<li>小心将上清液转移至新离心管中，避免触及管底沉淀，并用完全 DMEM 细胞培养基将溶液稀释至终工作浓度 20 μg/ml。</li>
	<li>使用 0.2 μm 注射器滤器对溶液进行过滤除菌。</li>
</ol>
4. 右旋糖酐预加载
<ol>
	<li>将细胞接种于活细胞成像用玻璃底培养皿中，于37 °C、5% CO2环境中孵育至少12小时，以确保细胞贴壁并适应环境。 
	注意：可使用分隔式玻璃底培养皿，每皿最多分为四个独立区域，便于在同一培养皿中进行多个实验。</li>
	<li>按照方案3所述方法配制DMEM中的葡聚糖溶液，并将配制好的葡聚糖DMEM溶液在37 °C水浴中预热。&#160;</li>
	<li>吸除培养基，小心加入葡聚糖溶液，于37 °C、5% CO2环境中孵育2–8小时，以实现内吞摄取。 
	注意：应根据所使用的探针和细胞类型预先规划并优化实验条件，并在重复实验时严格保持相同的孵育时间。这对于内吞途径中葡聚糖积累的特征一致性以及实验的可重复性至关重要。</li>
	<li>用预热的完全DMEM培养基洗涤细胞3次&#160;；吸除培养基后，用新鲜培养基小心冲洗细胞。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2环境中，用完全DMEM培养基孵育细胞4–12小时。</li>
	<li>用预热的完全过滤去酚红&#160;DMEM培养基洗涤细胞一次&#160;。</li>
	<li>为获得最佳成像效果，建议在成像开始前至少30分钟更换为预热的完全过滤去酚红DMEM&#160;培养基。酚红可能引起荧光信号淬灭，增加背景噪声，从而降低图像的对比度和清晰度。</li>
</ol>
注意：根据所使用的探针类型和细胞，按照预先设计并优化的方案，提前设置显微镜和成像参数。
5. 添加IgG包被的微珠
<ol>
	<li>将预配制的1%微珠悬液等分试样平衡至室温，并在超声水浴中进行超声处理&#160;浸泡2-3分钟。</li>
	<li>在II级生物安全柜中，向完全过滤的酚红-free DMEM培养基中加入1–6 μl的1%微珠悬浮液，以最大限度降低污染风险（建议起始浓度为每2 cm²培养面积加入1 μl）2&#160;培养皿表面） 
	注意将BMM细胞以每孔25,000个细胞的密度接种，并向培养皿中的培养基加入6 μl的1%母液微珠悬浮液。这大致相当于微珠与细胞的比例为15:1。该比例需根据所使用的细胞类型及微珠材料进行调整；例如，乳胶微珠密度较低，沉降到底部的速度较慢，而聚苯乙烯微珠则较快沉降，能更迅速且更多地与贴壁细胞接触。 
	注意：根据实验需求，可预先选择需要观察的区域。随后仅将微球悬液加入玻璃底培养皿的该特定区域，从而提高观察到理想摄取事件的概率。</li>
	<li>通过轻轻吹打，可使浓密的珠子云团分散&#160;玻璃底培养皿中的悬液。</li>
	<li>等待磁珠沉降至玻璃底培养皿底部，并大致与贴壁的吞噬细胞处于同一平面。</li>
	<li>聚焦于感兴趣区域（ROI），并开始延时成像。</li>
</ol>
注意：在成像过程中，可能需要根据所使用的成像系统、系统的稳定性以及被观察细胞的运动性，对焦距进行微调。然而请注意，重新对焦可能导致严重偏离焦平面的吞噬体无法进行正确的分析。
6. 成像
遵循以下一般准则以获得最佳成像质量；
<ol>
	<li>使用共聚焦成像系统，例如激光扫描或转盘系统。 
	注意：配备环境控制室、由 Leica LAS AF 软件控制的 Leica TCS SP5 AOBS 激光扫描共聚焦显微镜&#160;此处使用延时视频成像技术。</li>
	<li>优化成像设置，例如扫描速度、放大倍数、分辨率 等等以每7-20秒获取一帧的速度进行，具体速率取决于所使用的系统。 
	注意：此处采用200 Hz的扫描速度，2倍放大倍数&#160;扫描仪缩放倍数及2-3倍线平均&#160;分辨率为512 × 512像素时，每帧的记录时间为3–5秒。采用每10秒记录一帧的速率，录制至少持续120分钟的时间序列影片。</li>
	<li>根据所使用的成像系统和探针，选择适当的激发/发射参数设置。
	<ol>
		<li>优化设置以防止过度光漂白。 
		注意：此处使用DPSS（561 nm）激光激发Texas Red Dextran 70kD，发射光通过Leica混合探测器（HyD）在600–650 nm波长范围内检测，发射峰位于610 nm。激光强度需根据信号强度进行调整，并尽可能保持最低，以最大限度减少荧光染料的光漂白以及激光对细胞的光毒性效应。通常情况下，需合理平衡扫描速度、线平均次数、扫描分辨率、帧间隔及成像持续时间，以获得适当且稳定的信号强度，并完整捕捉微珠摄取及吞噬体成熟全过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果微珠未与荧光染料偶联，应包含明场（BF）通道以观察微珠。 
	注意除了Texas Red通道外，还使用了BF通道来观察微珠，光源采用相同的DPSS激光器，信号由光电倍增管（PMT）检测器检测。 
	注意确保在采集需要合并的数据时使用相同的记录设置。最重要的参数包括：激发激光强度、检测器设置、采集设置、放大倍数和帧间隔。若未使用相同的帧间隔，则需要进行曲线平均化处理，因为观测数据点将无法重合（例如，将每隔7秒采集一帧的观测数据与其它数据合并时）&#160;使用另一组每12秒采集一帧的图像。这将增加数据评估所需的步骤，并需要使用具备曲线平均功能的附加软件，例如OriginLab公司的Origin Pro统计软件（<a href="http://www.originlab.com/">http://www.originlab.com/</a>).</li>
	<li>建议将延时视频以所用成像系统的原生文件格式保存，避免导出为压缩格式。</li>
</ol>
注意：此处，延时电影以徕卡 LAS AF 原生格式（.LIF 文件）保存，随后可直接导入 Fiji 中打开。Fiji 能够利用内置的 Bio-Formats 导入插件读取大多数显微镜制造商的原生文件格式。无需也不建议将延时电影文件导出为 JPG 或 TIFF 图像序列，或以 AVI 容器格式导出为视频文件。除了通过避免有损压缩算法（如 JPEG）来保留原始观测中尽可能高的图像质量外，使用显微镜原生文件格式还能确保文件的元数据（时间戳、放大倍数、激光与采集强度、探测器设置等）得以保留并可供 Fiji 使用。然而，如果由于某些原因需要将延时视频文件导出为其他格式用于分析，请务必在此步骤即使用无压缩的文件格式（如 TIFF 图像序列），并预先分离 RGB 彩色通道（红、绿、蓝），因为 Fiji 通常无法成功从导出文件中分离明场（BF）通道与其他彩色通道。同时，请务必保留原始显微镜文件作为参考。
7. 时间序列电影的分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ、Fiji 或任何其他具备类似信号关联分析功能的软件。 
	注意：此处使用 Fiji 分析延时电影。Fiji 是一种 ImageJ 发行版，包含一个图像处理软件包，具有重新组织的工具菜单和额外的原生插件，可免费下载于 <a href="http://fiji.sc">http://fiji.sc</a>本节所述过程如图所示 图2.</li>
	<li>在 Fiji 中通过点击打开文件 &#34;文件&#34;, &#34;打开&#34; 选择文件，或通过将文件拖放到 Fiji 中来完成。</li>
	<li>选择以下选项；
	<ol>
		<li>堆栈查看：使用 Hyperstack 查看堆栈，</li>
		<li>颜色选项：彩色模式 彩色，</li>
		<li>将通道拆分为单独窗口：拆分通道（为每个记录的RGB颜色通道分别打开一个独立窗口）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果要使用图像序列，请通过以下步骤将序列加载到 Fiji 中： &#34;文件&#34;, &#34;导入&#34;, &#34;图像序列&#34; 并选择包含目标图像序列的文件夹中的任意图像文件。
	<ol>
		<li>为加载系列中选定的图像设置过滤器和条件，例如；
		<ol>
			<li>图像数量：需加载的帧数。</li>
			<li>起始图像：序列中作为起始帧的图像。</li>
			<li>增量：要加载的帧之间的间隔（每帧、每隔一帧） 等等.).</li>
			<li>文件名包含：使用文件名对特定通道进行筛选（例如通过设置） &#34;c001&#34;，这通常是来自图像的 &#34;通道1&#34; 在多通道延时视频进行颜色分离后进行标记。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除缩放，方法是前往 &#34;分析&#34;, &#34;设置比例尺…，勾选复选框 &#34;全球&#34; 并点击 &#34;点击以移除比例尺&#34;. 
	注意：如果针对不同实验组采用了不同的放大倍数，此步骤可实现图像的基于像素的分析。如果放大倍数设置始终保持恒定，且显微镜原始文件已直接导入Fiji，则可跳过此步骤，因为Fiji能够读取并利用显微镜文件元数据中的放大倍数和标尺信息。</li>
	<li>通过前往设置测量参数 &#34;分析&#34;, &#34;设置测量参数&#34; 并勾选以下选项： &#34;面积&#34;, &#34;标准差&#34;, &#34;积分密度&#34;, &#34;显示标签&#34; 和 &#34;平均灰度值&#34;.</li>
	<li>重定向至含有待测探针信号的颜色通道，并确认 &#34;好的&#34;.</li>
	<li>转到进行测量的帧&#160;启动并单击窗口上边缘以选择明场（BF）通道窗口。</li>
	<li>使用 &#34;椭圆选择工具&#34; 选择一个感兴趣区域（ROI）， 即 在内化的微珠上绘制一个圆形兴趣区域（ROI）。确保选区紧密贴合明场（BF）通道中可见的微珠外缘。 
	注意：使用PC时，利用选择工具的同时按住Shift键，以确保获得圆形的感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>在微珠完全被吞噬前的几个帧开始测量为最佳，记录下新生微珠吞噬体完全形成且吞噬杯闭合时的帧数。这一时刻在明场（BF）通道中应能相对清晰地辨别。</li>
	<li>前往 &#34;分析&#34; 并单击 &#34;测量&#34; 执行测量；结果将显示在一个标题为 &#34;结果&#34;.</li>
	<li>转到下一帧，如果微珠发生移动，则调整感兴趣区域（ROI）的位置，并重复测量。结果将添加到结果窗口的列表中；每个已分析的帧可根据列表中的数值进行识别 &#34;标记&#34; 柱 
	注意：使用快捷键（例如 &#34;M&#34; 用于测量）可显著加快评估过程；请在菜单下查看快捷键列表并设置自定义快捷键 &#34;插件&#34;.</li>
	<li>在完成所有相关帧的测量后，可将结果复制到电子表格应用程序（如 MS Excel）中。该列 &#34;IntDen&#34; 显示测量被重定向到的通道中选定区域的强度。</li>
</ol>
8. 漂白校正
根据所使用的探针和成像设置，可能会发生光漂白现象。根据其程度的不同，这可能显著影响评估结果。然而，该效应可通过为测量值施加一个相等但相反的变化速率进行部分校正。如果存在光漂白，可通过测量与每个吞噬体分析相关的时间段内整个图像帧或特定裁剪区域中信号强度随时间的下降来计算光漂白系数。此过程如图3和&#160;4所示。
<ol>
	<li>在 Fiji 的 &#34;Plugins&#34; 菜单下，使用 &#34;Time Series Analyzer&#34; 插件&#160;来确定整个图像帧或特定 ROI 探针信号强度随时间的整体下降趋势（图 3）。 
	注意：若 Plugins 菜单中尚未包含该插件，可从以下网址下载： <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a>。</li>
	<li>在 MS Excel 中将测量值对时间（秒）作图，仅包含与待分析吞噬体对应的图像帧。</li>
	<li>为该图添加线性趋势线（图 4A）；若信号呈下降趋势且斜率为负，则表明存在光漂白效应。</li>
	<li>将反向斜率校正应用于待分析吞噬体的数值（图 4B 和 图 4C）：校正后信号强度（SI）= 原始 SI +（时间（秒）× 反向斜率）</li>
</ol>
注意：每个单独分析的吞噬体在记录的时间序列电影中都有特定的时间跨度（从完全摄取的帧开始）；光漂白必须针对该特定时间段重新计算，并且仅适用于校正该特定吞噬体的测量值。
9. 数据评估
<ol>
	<li>整理数据，并计算经漂白校正后的数值的平均值和统计误差&#160;适当的软件。</li>
	<li>以适当的形式绘制评估后的数据。</li>
</ol>
注意：此处使用了科学统计与绘图软件 GraphPad Prism（<a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/">http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</a>）。只要所有数据具有相同的帧率（即均以相同的时间间隔采集，例如每 10 秒一帧），Prism 软件即可生成并绘制出带有相应误差指示的平均曲线。
注意：同一实验组重复测量中绝对SI值存在较大差异时，会引入显著的统计误差，导致数据无法使用。如果实验方案、 例如。 成像设置在不同实验重复之间并不严格保持一致，这些实验将被汇总。

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<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

作者无披露内容。

在接下来的部分中，我们将讨论该方法的关键步骤及其局限性。此外，我们将一些常见问题与相应的解决方案联系起来，介绍可能的改进方案，并探讨本方法的优势以及适用于该方法的互补技术。
磁珠的制备，包括将IgG偶联至磁珠表面的过程，至关重要，应避免使用非新鲜制备的磁珠。此外，每次实验前必须从冷冻储备液中新鲜配制葡聚糖（经稀释和灭菌）。为确保细胞摄取、区室分布及累积的一致性，葡聚糖的加载必须遵循精确的时间安排。同时，不仅应使用相同的显微镜装置和软件设置，还应尽可能保持外围条件恒定。例如 温度，CO2湿度，微珠添加技术 等等另一个关键点是视野或目标细胞的选择，在开始成像前应对样品进行全面观察，以选取具有代表性的细胞。
该方法的主要局限性之一是获得具有统计学意义的样本量所需进行的实验数量较多。由于在选定分辨率下，单个视野中可观察到的吞噬体数量有限，因此所述方法相对耗时且工作量较大。若仅随机选取极少数吞噬体进行结果汇总，则少数极端异常值可能对平均值产生显著影响。而较大的样本量则能够掩盖吞噬...

专业吞噬细胞（包括巨噬细胞）在免疫系统中发挥着关键作用。除了作为先天免疫系统的首道防线外，它们还通过信号传导和抗原呈递功能，在适应性免疫的激活过程中发挥至关重要的作用1-3。尽管专业吞噬细胞的功能具有多重性，吞噬体成熟仍是其杀菌功能和抗原加工功能的核心基础4,5。当通过受体介导的方式吞噬并摄取细菌等吞噬靶标后，新生吞噬体会经历一系列复杂且高度协调的过程，与胞内内吞网络及其他多种细胞器进行相互作用和物质交换6。这些细胞结构之间交换物质的性质，以及融合事件的调控机制和时间进程，决定了吞噬体腔内的微环境和吞噬体膜的组成7，从而决定了发育中吞噬体的命运8。
吞噬体成熟过程的生理相关性体现在多种胞内病原体为逃避、阻滞或干扰该过程而采用的不同策略上9。这些策略大多直接或间接地阻止了吞噬体成熟过程的最终关键阶段：即吞噬体与晚期内体/溶酶体区室的融合，而正是这一融合使吞噬体获得了成熟吞噬体所含的大部分水解酶和抗菌因子7,8,10。因此，对这一最终关键步骤的分析可为我们提供强有力的指标，用以判断吞噬体的成熟状态，以及在特定实验条件下其自然生理状态是否受到正面或负面的影响。
晚期内体/溶酶体区室通常被认为是内吞途径的终末区室，其特征在于存在多种阶段特异性的标志分子，从而可与早期内吞区室相区分。例如水解酶或溶酶体相关膜蛋白（Lysosomal associated membrane proteins, LAMPs）等其他成分11。这些终末内吞区室——下文简称为溶酶体——同时也是吞噬/内吞途径末端消化过程的主要场所12。因此，可通过内吞作用和巨胞饮作用将不可降解的探针从细胞外环境摄入，并经内吞途径转运至溶酶体，在完成特定的摄取与追踪循环后于其中积累13,14&#160;。在荧光显微镜研究中，常使用荧光染料标记的探针，如有机不可降解聚合物葡聚糖，作为内吞探针15-17。
在本方法中，我们描述了利用IgG包被的微珠作为吞噬性货物，通过分析溶酶体腔内容物向吞噬体的递送过程，来研究吞噬体成熟。通过使用荧光染料标记的葡聚糖探针作为溶酶体的易检测标记物，并结合共聚焦激光扫描显微镜进行活细胞时间延时成像，在源自骨髓的巨噬细胞（BMM）中以高时间分辨率追踪货物递送至吞噬体的动态过程。随后，我们阐述了如何利用开源且免费的图像分析软件Fiji（或ImageJ）对采集的时间延时成像数据进行评估，并使用Microsoft Excel进行统计分析，最后通过GraphPad Prism软件进行数据展示14,18。
在描述本方法之后，可通过修改实验条件和因素来设计类似的实验，以研究这些因素对吞噬体成熟的影响；几乎任何其他类型的贴壁原代细胞或细胞系吞噬细胞、包括基因敲除和基因敲低在内的功能缺失实验、突变体或融合蛋白的表达、吞噬靶标、微珠包被化合物、内体/溶酶体探针以及细胞因子、化学抑制剂或siRNA&#160;等因素，均可作为本方法基本流程中的可变参数加以应用。
我们将该方法的目标和基本要求定义如下：
<ul type="disc">
	<li>方法的目标：在活的吞噬细胞中以高时间分辨率对吞噬体成熟过程进行直接的、定量和定性的观察与分析。</li>
	<li>吞噬性货物：适当包被的微粒或生物靶标。本文使用经IgG包被的3 μm球形聚苯乙烯微粒，可通过Fc-γ受体介导的吞噬作用高效内化。此外，也可使用任何具有相应吞噬受体的微生物或包被微粒。</li>
	<li>吞噬细胞：表达相应吞噬受体的贴壁吞噬细胞。本文使用小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（BMMs），其高表达Fc-γ受体。此外，也可使用树突状细胞（DC）、单核细胞、吞噬性上皮细胞，或其基因突变体或基因敲除变体。</li>
	<li>溶酶体货物：荧光标记的溶酶体探针。本文使用德克萨斯红标记的70,000千道尔顿葡聚糖（Dex70kD）作为溶酶体腔内标记物。此外，也可使用任何可荧光检测的细胞区室或细胞器标记物，或用于检测吞噬体特性的适当探针（如酸性或降解能力），以研究吞噬体成熟的进程。</li>
	<li>影响因素：例如信号分子、化学化合物、基因敲低，或突变蛋白的瞬时表达等。本文为简化起见未使用此类因素，但关于突变蛋白表达与基因敲低作为影响因素的近期示例，请参见Kasmapour et al.18&#160;任何可能影响吞噬作用，或吞噬体及其相互作用细胞器的环境与运动性的因素，均可潜在地用于此类研究。</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（D-MEM）</td><td>PAA, 奥地利</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的杜尔贝科改良伊格尔培养基（D-MEM）</td><td>PAA, 奥地利</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>PAA, 奥地利</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>PAA, 奥地利</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, 奥地利</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>PAA, 奥地利</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&amp;reg; 玻璃底培养皿（35 mm &amp;empty;, #1.5）</td><td>WillCo Wells, 荷兰</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM 玻璃底培养皿，35 mm</td><td>Greiner Bio one, 德国</td><td>627871</td><td>替代品：可提供分段式版本</td></tr><tr><td>羧基化乳胶微球</td><td>Polysciences, 美国</td><td>#09850</td><td>提供不同直径，我们使用了 3 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微粒</td><td>Kisker Biotech, 德国</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, 德国</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>小鼠全IgG</td><td>Rockland, 美国</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC 交联剂</td><td>Sigma-Aldrich, 美国</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, 美国</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1-ml 注射器 Omnifix -F</td><td>B.Braun, 德国</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&amp;nbsp;G 针头（0.45*25 mm）</td><td>B.Braun, 德国</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, 奥地利</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco, 美国</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES 一水合物</td><td>Sigma-Aldrich, 美国</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m 一次性针式滤器</td><td>Sartorius, 德国</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

活体巨噬细胞中吞噬溶酶体发生的生物学研究

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

吞噬细胞通过在其吞噬体中清除和消除入侵的微生物，在先天免疫系统中发挥重要作用。吞噬体成熟是一个复杂且受到严密调控的过程，在此过程中，新生的吞噬体通过与细胞质中多种细胞器和区室进行精确协调的相互作用，发生剧烈的转变。该过程对于吞噬细胞的生理功能至关重要，它赋予吞噬体裂解和杀菌特性，并最终完成吞噬体与溶酶体的融合以及吞噬溶酶体的生成，后者被认为是吞噬体成熟的最后也是关键阶段。在本报告中，我们描述了一种基于活细胞成像的方法，用于对溶酶体向吞噬体内容物递送的动态过程进行定性和定量分析，这一过程是吞噬溶酶体生成的标志性事件。该方法利用IgG包被的微珠作为吞噬作用的模型，使用荧光染料标记的葡聚糖分子作为腔内溶酶体货物探针，从而在活体巨噬细胞中通过延时成像和共聚焦激光扫描显微镜实时追踪溶酶体内容物向吞噬体的动态递送。本文详细阐述了该方法的背景、准备步骤以及逐步的实验设置，以便其他实验室能够简便而精确地实施该技术。我们所描述的方法简单、可靠，更重要的是，可轻松适用于不同系统和多种实验条件下对吞噬体相互作用与成熟过程的研究，例如使用不同类型的吞噬细胞、功能缺失实验、不同探针以及不同的吞噬颗粒。

正确制备用于成像的细胞和微珠至关重要。图1展示了本方法中接种、探针负载及初始成像步骤的概要，该流程基于我们针对BMMs优化的实验方案。因此，必须根据所使用的细胞类型和探针种类对实验参数进行测试和优化。
在将IgG包被的磁珠加入预加载的细胞后，选择视野时应尽可能包含最多数量的潜在摄取事件和最多数量的细胞，同时保持方案中预设的放大倍数。如图2所示，这种方法可在每段延时视频中获得更大量的可分析吞噬体。除了增加每组实验每次视频所产生的数据点数量外，该策略还可减少由不同边缘条件引入的变异，从而提高数据的稳健性。
建议由同一个人以盲法进行信号关联测量程序（图2），如果可能的话。由于每个吞噬体的感兴趣区域（ROI）需在每帧图像后手动选择和移动，采用盲法可减少多种人为误差来源，降低偏倚。
虽然通常“样本量越大越好”的原则在此同样适用，但为避免对单个细胞赋予过高权重（因为同一培养物中的所有...

吞噬细胞通过在其吞噬体中清除和消除入侵的微生物，在先天免疫系统中发挥重要作用。吞噬体……

以下实验的总体目标是捕获吞噬细胞中吞噬体成熟及吞噬溶酶体生成的实时动态过程。该目标通过将细胞的溶酶体区室负载荧光偶联葡聚糖链实现，从而可视化溶酶体区室及其腔内货物向吞噬体的转移。第二步是加入微粒，作为吞噬作用的模型。接下来，通过活细胞成像及后续的数字图像处理，分析溶酶体物质向吞噬体的递送过程。为了定量分析吞噬体成熟过程，实验结果展示了不同因素对吞噬体成熟的影响，其依据是溶酶体内容物向吞噬体的递送情况。该技术相较于现有方法（如在固定细胞中评估巨噬细胞成熟）的主要优势在于能够以高时间分辨率实现定量读数。首先，将 Texas red 标记的 70 千道尔顿葡聚糖链（Dex 70 kD）溶解于 PBS 中，浓度为 20 毫克/毫升，分装后于 -20 摄氏度保存。接下来，将70 kD的Dex储备液用完全细胞培养基Docos、改良的伊格尔培养基（DMEM）或DMEM稀释至约1毫克/毫升。将DExT链的分装样品置于超声水浴中处理5分钟。然后在微量离心机中以最大速度离心5分钟，以去除溶液中的任何团块或污染物。小心地将SuperAgent转移至新的离心管中，避免触碰底部的沉淀。然后用完全细胞培养基将溶液稀释至终工作浓度为20微克/毫升，使用DMEM并过滤。使用装有0.22微米滤器的注射器过滤溶液以灭菌。随后，将骨髓来源的小鼠巨噬细胞调整至每毫升5×10⁴个细胞的浓度，取2毫升加入未包被的玻璃底培养皿中，在DMEM培养基中于37°C、5%二氧化碳缓冲环境下孵育至少12小时。为确保细胞贴壁及贴壁后的适应，吸除培养基，向玻璃底培养皿中加入2毫升预热的DExT链DMEM培养基，随后将细胞置于培养箱中孵育2至8小时。用预热的完全DMEM培养基洗涤细胞3次。最后一次洗涤后吸除培养基，并加入2毫升完全DMEM培养基。将细胞孵育 4 到 12 小时。然后用预热的不含酚红的完全 DMEM 洗涤细胞，并在成像开始前至少 30 分钟加入 2 毫升完全过滤的不含酚红的 DMEM。接着，将按照随附文本方案制备的 1% IgG 包被甜菜悬浮液等分试样恢复至室温。在超声波水浴中将溶液超声处理两到三分钟。然后在二级生物安全柜中，向细胞中加入一至六微升磁珠悬液。使用移液器轻轻吹打玻璃底培养皿中的悬液，使浓密的磁珠云团分散均匀。然后将样品置于显微镜下，聚焦于目标区域。在进行延时成像之前，优化扫描参数，包括扫描速度、放大倍数和分辨率，以便能够每7至20秒捕获一帧图像。根据所使用的成像系统和探针调整激发和发射参数，并优化设置以防止过度光漂白。然后采集延时视频，并以其显微镜的原生文件格式保存。避免以 JPG 或 PNG 等压缩格式导出视频。接下来，启动 Fiji 和 ImageJ 分发版，该版本包含一个图像处理软件包，具有重新组织的工具菜单和可免费使用的附加原生插件。下载后，在 Fiji 中打开文件并选择需要评估的视

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在现场研究巨噬细胞吞噬溶酶体生源

来源：Lê-Bury, G., 等. 在感染HIV-1的活体人原代巨噬细胞中测量吞噬体迁移与速度。J. Vis. Exp. (2016)本视频展示了对感染 HIV-1 的人巨噬细胞进行活细胞共聚焦成像，通过 GFP 荧光和明场追踪技术来观察和量化吞噬体的迁移，从而揭示 HIV 如何在 Fc...

活体成像观察HIV-1感染人巨噬细胞中吞噬体的迁移

本视频展示了一种高分辨率的全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，用于实时观察巨噬细胞介导的吞噬作用过程中，当IgG包被的红细胞（RBCs）附着在玻璃底培养皿表面时，吞噬体的形成及闭合过程。巨噬细胞会向红细胞周围延伸伪足，将其包裹进吞噬体内，并使其从玻璃表面脱离。...

基于TIRF显微镜的吞噬体形成与闭合过程可视化

我们描述了利用活细胞视频显微镜观察巨噬细胞吞噬Candida...

活细胞视频显微镜观察真菌病原体的吞噬作用

我们描述了一种实验装置，利用全内反射荧光显微镜，在活体巨噬细胞中以前所未有的高分辨率三维可视化吞噬体的形成与闭合过程。该方法可实时监测吞噬杯底部、延伸的伪足，以及吞噬体断裂的精确位点。...

利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行“吞噬体闭合检测”以三维可视化吞噬体形成过程

我们描述了一种利用旋转盘共聚焦荧光显微镜识别荧光标记的感染细胞，并结合明场显微镜检测吞噬体，以测量在感染或未感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的活细胞中向细胞中心移动的吞噬体速度的方法。...

活体原代人巨噬细胞感染HIV-1后吞噬体的迁移与速度测定

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胞葬作用（efferocytosis）是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程，对于维持机体稳态至关重要，该过程依赖于一系列受体和信号通路，以实现对凋亡细胞的识别、吞噬和内化。本文介绍了一种利用荧光显微镜定量分析胞葬作用及其相关信号通路活性的实验方案。...

通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

与吞噬作用相关的机制 利什曼原虫 感染仍知之甚少。本文中，我们描述了用于评估感染早期事件的方法 利什曼原虫...

使用共聚焦显微镜研究Leishmania的吞噬作用

本研究阐明了哺乳动物细胞对戈丹提煅烧粉（GB）颗粒的吞噬加工过程，表征了其细胞摄取、液泡动态变化、酸化及降解过程。这些发现不仅加深了我们对基本吞噬机制的理解，同时也确立了GB作为开发新型治疗策略的有前景的模型系统。...

探究戈丹提白夏在哺乳动物细胞中引发吞噬作用的连续细胞事件

学习利用活细胞成像技术实时观察巨噬细胞中吞噬体成熟与吞噬溶酶体生源的动态过程。该方法通过荧光标记葡聚糖探针定量分析溶酶体物质向吞噬体的递送，为免疫学研究提供高时间分辨率的定量数据。

活体巨噬细胞中吞噬溶酶体发生的生物学研究

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