在现场研究巨噬细胞吞噬溶酶体生源

以下实验的总体目标是捕获吞噬细胞中吞噬体成熟和吞噬溶酶体生物发生的实时动态过程。这是通过用荧光偶联的 dex 链加载细胞的溶酶体区室来实现的，以实现溶酶体区室的可视化并将其管腔货物转移到吞噬体。作为第二步，添加微粒，作为吞噬模型。

接下来，使用实时销售成像和随后的数字图像处理分析溶酶体物质向吞噬体的递送。为了量化吞噬体成熟过程，结果显示了基于溶酶体内容物递送到吞噬体的各种因素对吞噬体成熟过程的影响。现有方法的这种技术的主要优点，例如固定细胞中巨噬细胞成熟的评估，是具有高时间分辨率的定量读数首先以 20 毫克/毫升的 PBS 溶解德克萨斯红色标记的 70 道尔顿 DExT 链或 Dex 70 KD，并将等分试样储存在零下 20 摄氏度。

接下来，将 Dex 70 KD 原液稀释到完全细胞培养物 Docos、改良的 eagles 培养基或 DMEM 中至约 1 毫克/毫升。在超声水浴中对 DExT 链等分试样进行超声处理 5 分钟。然后在微量离心机中以最大速度离心溶液 5 分钟，以去除溶液中的任何结块或污染物。

小心地将 SuperAgent 移至新试管中，同时避免沉淀在底部。然后在完全细胞培养物中将溶液稀释至每毫升 20 微克的最终工作浓度。DMEM 和过滤器。

通过 0.22 微米注射器安装过滤器对溶液进行灭菌。接下来，观察 2 毫升骨髓来源的小鼠巨噬细胞，其浓度为每毫升 10 至 4 个细胞的 5 倍。在无涂层玻璃底培养皿中的 DMEM 中，将细胞在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳缓冲气氛中孵育至少 12 小时。

为确保贴壁后粘附和驯化，吸出培养基并向玻璃底培养皿中加入 2 毫升战前 DExT 链 DMEM，然后在孵育后将细胞孵育 2 至 8 小时。用预热的完全 DMEM 洗涤细胞 3 次。最后一次冲洗后吸出培养基，并加入 2 mL 完全 DMEM。

将细胞孵育 4 至 12 小时。然后用预热的不含酚红的完全 DMEM 冲洗细胞，并在成像开始前至少 30 分钟添加 2 毫升完全过滤的不含酚红的 DMEM。接下来，将按照随附文本方案中所述制备的 1%IgG 包被的甜菜悬浮液等分试样置于室温下。

在超声波水浴中对溶液进行超声处理 2 到 3 分钟。然后在 2 类生物安全柜下，向细胞中加入 1 至 6 μL 的微珠悬浮液。使用移液管轻轻混合玻璃底培养皿中的悬浮液，扩散致密的珠团。

然后将样品带到显微镜前并聚焦感兴趣的区域。延时成像之前。优化设置，包括扫描、速度、放大倍率和分辨率，以便能够每 7 到 20 秒捕获一帧。

根据所使用的成像系统和探头调整激发发射设置，并优化设置以防止过度的照片漂白。然后捕获延时视频并将其保存为显微镜的原生文件格式。避免以 JPG 或 PNG 等压缩格式导出视频。

接下来，启动 Fiji 和 Image J 发行版，其中包含一个图像处理包，其中包含重新组织的工具菜单和其他免费提供的本机插件。下载。在 Fiji 中打开文件，然后选择要评估的视频。然后按照随附的文本协议中的详细说明设置选项、过滤器和测量参数。

接下来，扫描图像，注意形成完全形成的新生珠子吞噬体和 F 酸性杯闭合的框架。使用 Oval 选择工具在内化微珠上选择圆形感兴趣区域或 ROI。确保选择与拉延筋的外边缘紧密贴合。

然后转到分析并单击 测量 执行测量。结果将显示在名为 results 的单独窗口中。在下一个感兴趣的帧中，调整 ROI 的位置，以防珠子移动并重复测量，这将添加到结果窗口的列表中。

每个分析的帧都可以根据 label 列中的值进行标识。完成所有相关帧的测量后，将 int den 列中的值复制到电子表格应用程序。int den 列描述了所选区域的强度。

使用这些方法，捕获了加载了 DExT 链探针的骨髓来源的巨噬细胞的清晰图像。这张图片来自时间零，正好是细胞完成摄取此处指出的 IgG 编码珠子的时间。此处显示的图像是伪彩色的，以便更好地观察，并描绘了摄取后 0 到 85 分钟的吞噬体。

测得的吞噬体 ROI 用虚线勾勒出来，箭头指出葡聚糖在吞噬体中递送和积累的实例。然后从这些图像中生成图表，并显示随时间推移与吞噬体的信号关联的明显时间趋势。该图表示此处显示的两个细胞中 10 个吞噬体的平均值。

虽然每个分析的吞噬体之间的绝对信号强度通常不同，但时间趋势通常非常相似。将 Dex 70 KD 递送到吞噬体，吞噬作用后 35 至 40 分钟内达到平台期。观看此视频后，您应该对如何使用延时共聚焦显微镜评估吞噬体成熟有很好的了解。