Name: 巨噬细胞中含有吞噬的鼠伤寒沙门氏菌的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习从巨噬细胞中分离含有鼠伤寒沙门氏菌的吞噬体的方法。该技术利用生物素和链霉亲和素标记细菌，无需专用设备即可获得高质量的吞噬体，适用于研究吞噬体成熟和抗原加工等免疫学问题。

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Robinson 实验室的研究工作获得了德国科隆大学科隆衰老相关疾病细胞应激反应卓越集群（CECAD）的资助（该机构由德国联邦和州政府卓越计划框架下德国研究基金会（DFG）资助），以及德国研究基金会（SFB 670）、Köln Fortune 和德国科隆大学 Maria-Pesch 基金会所提供的项目资助。

所有涉及使用致病性S. typhimurium的操作必须在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的实验室中进行。S. Typhimurium的培养与包被，以及对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的感染操作，均须在超净工作台内执行，以防止污染。含有S. typhimurium的吞噬体的分离可在任何BSL-2级实验台面上进行。
从小鼠中提取骨髓并将其分化为巨噬细胞的操作，遵循了动物福利方面的机构指南，并获得了北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局［Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen；文件编号：84-02.05.40.14.082 和 84-02.04.2015.A443］以及科隆大学的批准。
1. 培养伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）
<ol>
	<li>接种 S. 鼠伤寒沙门氏菌 使用细菌接种环将单个细菌菌落中的（SL1344菌株）接种至5 mL脑心浸液（BHI）肉汤中。</li>
	<li>在37 °C摇床培养箱中孵育细菌悬液过夜。</li>
	<li>次日，将1 mL细菌悬液转移至含有19 mL BHI肉汤的锥形瓶中，在37 °C摇床培养箱中孵育。</li>
	<li>监测 S. typhimurium 通过测量600 nm处的光密度（OD）来评估生长情况（OD600使用分光光度计进行测量，每约30分钟测定一次。</li>
	<li>当OD600 当达到1.0时，从培养箱中取出细菌悬液并转移至50 mL离心管中。在4 °C条件下以5,400 x g离心15分钟。</li>
	<li>移除上清液，并用10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 5,400 x g 离心 15 分钟。</li>
	<li>移除上清液，并将细菌重悬于 4.9 mL 无菌 PBS 中。</li>
</ol>
2. 使用 NHS-生物素/链霉亲和素偶联磁珠包被 S. typhimurium
<ol>
	<li>向先前步骤制备的细菌悬液中加入100 µL新配制的10 mg/mL生物素连接溶液（NHS-Biotin溶于二甲基亚砜DMSO中）。例如，将5 mg NHS-Biotin溶解于0.5 mL无菌DMSO中。通过反复吹打数次充分混匀。</li>
	<li>将混合液分装至五个1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在室温（RT）下，于恒温金属浴中以350 rpm持续振荡孵育2小时。</li>
	<li>在室温下以15,000 × g离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL无菌PBS重悬沉淀，于室温下以15,000 × g离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤2.5两次，以彻底去除多余的生物素连接溶液。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将沉淀重悬于1 mL无菌PBS中。</li>
	<li>取100 µL浓度为10 mg/mL的链霉亲和素偶联磁珠溶液转移至1.5 mL离心管中，并将其置于磁力架上静置5分钟。</li>
	<li>用移液器吸除溶剂，将链霉亲和素偶联磁珠从磁力架上取下，加入1 mL在步骤2.7中制备的生物素包被的细菌悬液并重悬。</li>
	<li>在室温下，于恒温金属浴中以350 rpm持续振荡孵育1小时。</li>
	<li>将溶液置于磁力架上，静置5分钟后，用移液器吸除未吸附在管壁上的细菌（将其收集至标记为&#34;non-coated bacteria&#34;的离心管中）。与磁铁接触侧管壁上吸附的组分为生物素/链霉亲和素包被的细菌。</li>
	<li>将含有标记细菌的离心管从磁力架上取下，加入1 mL无菌PBS重悬。</li>
	<li>再次将离心管置于磁力架上，静置5分钟，用移液器吸除PBS。</li>
	<li>重复步骤2.13和2.14两次，以去除所有未被链霉亲和素偶联磁珠包被的细菌。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将包被的细菌重悬于500 µL无菌PBS中，并将离心管标记为&#34;coated bacteria&#34;。</li>
	<li>通过在BHI琼脂平板上进行系列稀释涂布，测定&#34;non-coated bacteria&#34;和&#34;coated bacteria&#34;两种溶液的菌落形成单位（cfu）。通常，从OD600为1.0的20 mL初始细菌悬液中可获得约2 × 108 cfu/mL的包被细菌。将包被的细菌悬液保存于4 °C，用于次日感染巨噬细胞。</li>
</ol>
3. BDMDs 的感染
<ol>
	<li>在细菌包被生物素和链霉亲和素偶联磁珠的同一天，将完全分化的BMDMs22以每皿5 × 106个细胞的密度接种于6 cm培养皿中。</li>
	<li>次日，将包被细菌悬液在4 °C条件下以15,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于补充有10%胎牛血清（FBS）的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中，调整浓度至10 × 106 cfu/mL。</li>
	<li>为以感染复数（MOI）为10的条件感染巨噬细胞，吸除BMDMs中的培养基，加入5 mL上述制备的包被细菌悬液。针对不同细胞类型或分离吞噬体的实验目的，应优化确定最佳MOI。</li>
	<li>在室温下孵育10分钟，以同步化吞噬过程。</li>
	<li>随后将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，以启动吞噬作用。其他类型的细胞可能需要不同的孵育时间以确保细菌被完全内化。</li>
	<li>从培养皿中移除含细菌的培养基，并用RPMI培养基洗涤细胞三次，以去除未被内化的细菌。</li>
	<li>最后加入含10% FBS和50 µg/mL庆大霉素的10 mL RPMI培养基，以杀灭所有未被吞噬的细菌。</li>
	<li>将感染后的BMDMs在37 °C、5% CO2条件下继续孵育至所需时间点。所需时间点应根据所用细菌种类、细胞类型及分析目的通过实验确定。在研究S. Typhimurium感染BMDMs中早期吞噬体-内体融合事件时，建议孵育30分钟；若分析后期事件，可在孵育2小时或4小时后提取吞噬体。巨噬细胞与S. Typhimurium共培养超过24小时会导致细胞死亡。在吞噬体提取前延长胞内感染时间可能导致生物素分子降解。然而，我们在24小时内未观察到包被细菌上的生物素丢失现象。</li>
</ol>
4. 分离 S. typhimurium含吞噬体
<ol>
	<li>按需配制吞噬体分离缓冲液 A（50 mM PIPES，pH 7.0，50 mM MgCl2，5 mM EGTA），加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为 1 mM，细胞松弛素 B 至终浓度为 10 µM，并按制造商推荐添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。 
	注意：DTT 和细胞松弛素 B 必须在使用前立即加入吞噬体分离缓冲液 A 中。细胞松弛素 B 可破坏细胞骨架，促进细胞膜破裂。</li>
	<li>在预定时间点，移除感染细胞的培养基，并用室温预热的无菌 PBS 洗涤。</li>
	<li>每皿加入 750 µL 吞噬体分离缓冲液 A，冰上孵育 20 分钟。若使用不同数量的细胞，应按比例调整分离缓冲液 A 的体积。</li>
	<li>每皿加入 250 µL 吞噬体分离缓冲液 B（50 mM PIPES，pH 7.0，50 mM MgCl2，5 mM EGTA，220 mM 甘露醇和 68 mM 蔗糖）。轻轻晃动培养板，确保缓冲液覆盖整个皿表面。若使用不同数量的细胞，应按比例调整分离缓冲液 B 的体积。</li>
	<li>用橡胶刮棒轻轻刮取细胞，将其从培养皿中收集，并转移至预冷的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>使用 1 mL 注射器将细胞悬液通过 26G 针头至少推注 15 次（每次吸入和推出细胞悬液计为一次）。此步骤足以释放 BMDM 的胞质内容物。针头推注次数需根据不同细胞类型进行优化。</li>
	<li>将细胞悬液置于磁力架上，静置 5 分钟。吸附在磁铁上的颗粒即为含有包被S. Typhimurium 的吞噬体，上清液中含有其余细胞组分。</li>
	<li>将上清液转移至标记为 &#34;胞质&#34; 的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>从磁力架上取下含有分离吞噬体的离心管，用 1 mL 无菌 PBS 重悬吞噬体。</li>
	<li>将吞噬体悬液再次置于磁力架上，静置 5 分钟后移除 PBS。</li>
	<li>重复步骤 4.9 和 4.10，以洗涤分离得到的含 S. typhimurium 的吞噬体。</li>
	<li>最后移除 PBS，将吞噬体重悬于所需缓冲液中；例如，用于蛋白质分析的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液。根据初始细胞数量和感染复数（MOI），每样本可获得约 50–200 µg 蛋白质。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种通过用生物素和链霉亲和素偶联的磁珠包被细菌来分离含有S. typhimurium的吞噬体的新方法。在轻柔裂解细胞膜后，可利用磁力架轻松提取含有细菌的吞噬体。我们证明，对细菌进行标记能够保持病原体诱导炎症反应的能力，并且不改变宿主细胞的吞噬特性。重要的是，通过该方法获得的吞噬体富含细菌以及内体/溶酶体标志物，且无胞质污染。
与传统的采用蔗糖梯度分离的吞噬体分离方法相比，该方法具有多项优势。它省去了耗时的多次离心步骤，使研究人员能够在更短时间内处理更多样本，并通过简单增加洗涤次数获得纯度更高的吞噬体样本。本方案的使用避免了对超速离心等特殊且敏感设备的需求。高速离心可能改变囊泡的特性，并降低最终得率22，这在本方案中应避免。我们还证明了包被 S. 鼠伤寒沙门氏菌 使用生物素和链霉亲和素偶联的磁珠不会改变巨噬细胞的吞噬能力。此外，用标记物感染后巨噬细胞中IL-6的诱导 S. typhimurium 与未标记细菌感染的巨噬细...

巨噬细胞是一类循环中的特化吞噬细胞，能够识别、内吞并降解外周组织中存在的任何外来颗粒，从凋亡细胞到入侵的微生物（如细菌）均在其作用范围内。当巨噬细胞通过其表面受体识别出通常存在于微生物表面的病原体特异性标志物（称为病原体相关分子模式，PAMPs）时，便会启动细胞膜的复杂重组过程，以包裹并吞噬病原体1。
被吞噬的病原体随后被巨噬细胞包裹在一种称为吞噬体的细胞内囊泡中。通过与其他囊泡（如内体和溶酶体）发生一系列融合与分裂事件，含有病原体的吞噬体获得一组清除吞噬体内容物所必需的蛋白质。因此，在这一被称为吞噬体成熟的过程中，吞噬体的酶组成具有高度可变性2。
吞噬作用发生后不久，多聚体复合物液泡ATP酶（v-ATPase）通过与内体融合被整合到吞噬体膜中3。该复合物利用ATP将质子从细胞质泵入吞噬体腔内4。吞噬体的酸化对于与其他囊泡的融合事件5以及大量pH依赖性降解酶的活化至关重要6。另一种迅速在吞噬体膜上组装的多聚体酶复合物是NADPH氧化酶（NOX）复合物。NOX复合物通过氧化NADPH产生活性氧（ROS），这些活性氧被分泌至吞噬体腔内，对被吞噬微生物的杀灭起着重要作用7。
在成熟过程的初始阶段，吞噬体通常会表现出早期内体和晚期内体的标志物，例如Rab5和Rab7，以及v-ATPase的V0亚基8。吞噬体与溶酶体及晚期内体融合后，被吞噬的病原体会暴露于多种水解酶中，如组织蛋白酶（cathepsin）蛋白酶、脂肪酶和β-半乳糖苷酶9。腔体的酸化对于这些酶的活化也至关重要。例如，组织蛋白酶D被切割生成具有活性的短链形式这一过程依赖于pH值10。这些酶可降解病原体，并促进产生来源于病原体的短肽，后者由巨噬细胞的主要组织相容性复合体（MHC）II类分子呈递给T细胞，从而触发适应性免疫反应11。
因此，吞噬体成熟对于先天免疫反应至关重要，并且连接了免疫系统的先天性和适应性免疫应答。病原体已进化出多种策略以逃避巨噬细胞通过上述吞噬体成熟过程将其清除，这并不令人意外。例如，胞内细菌Mycobacterium tuberculosis和Legionella pneumophila通过抑制v-ATPase的组装及其导致的腔体酸化，从而阻断吞噬体的成熟12,13。其他细菌，如Listeria monocytogenes或Shigella flexneri，则通过在吞噬体膜上诱导形成孔道，逃逸至胞质溶胶中14,15。另一方面，Salmonella enterica血清型typhimurium（S. typhimurium）能够在液泡内修饰吞噬体的特性，将其转化为适合自身复制的环境16。这种能力使S. typhimurium成为研究病原体介导的吞噬体成熟干扰机制的一个极具价值的模型。
S. typhimurium 是一种兼性胞内细菌，可引起人类胃肠炎。在侵入黏膜下层后，S. Typhimurium 细菌会迅速被巨噬细胞识别并吞噬，并被包裹于吞噬体中17。一些既往研究报道，含有 S. typhimurium 的吞噬体同时具有内体和溶酶体的标志物18，而其他研究则发现，在 S. Typhimurium 感染后，吞噬体与溶酶体的融合受到抑制19。
最初，通过免疫荧光显微镜研究了伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）感染后吞噬体的成熟过程。细菌携带型吞噬体分离技术的发展，使得能够更精确地研究吞噬体内容物中的内体和溶酶体标志物。迄今为止，分离含细菌吞噬体的主要方法是蔗糖阶梯梯度亚细胞分级法18,20。然而，该方法需要多次离心步骤，可能导致吞噬体受到机械损伤，影响吞噬体组分（蛋白质和脂质）的稳定性，且耗时较长。此外，该方法需要使用超速离心机——这是一种专业设备，并非所有实验室都能配备。
最近，一种新方法被应用于含细菌吞噬体的分离，该方法通过使用生物素化脂肽（Lipobiotin）标记细菌病原体，随后利用链霉亲和素偶联的磁珠进行提取21。我们提出一种替代性的互补方法，即利用NHS-Biotin标记细菌表面含胺基的大分子，再通过链霉亲和素偶联的磁珠进行捕获。采用该方法获得的吞噬体高度富集早期内体和溶酶体标志物，可用于多种检测，从蛋白质分析到组学分析均可适用。此外，该方法无需超速离心机等特殊设备。更重要的是，通过省去离心步骤，显著减少了对吞噬体的机械损伤以及操作所需时间。该方法可轻松适用于其他细菌（如革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus）所含吞噬体的分离，本文亦包含了该菌的相关实验。综上所述，这种分离含S. typhimurium吞噬体的方法比传统的蔗糖梯度超速离心法更为简便、经济且耗时更短，可获得高度富集的含细菌吞噬体。

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS 生物素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag 链霉亲和素磁珠</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL 或 DynaMag 磁力架</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 分光光度计</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>细菌接种环（10&amp;micro;l）</td><td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>鼠伤寒沙门氏菌 SL1344 菌株</td><td>Leibniz Institute DSMZ-德国微生物与细胞培养保藏中心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 标记链霉亲和素</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>抗 β-肌动蛋白抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>抗 mCherry 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>抗 Rab5 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>抗 Rab7 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>抗 v-ATPase（V0）抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>抗 v-ATPase（V1）抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>抗组织蛋白酶 D 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>抗 Tomm20 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>抗钙连蛋白抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAPDH 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

从巨噬细胞中分离含有salmonella typhimurium的吞噬体

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium 是一种兼性胞内细菌，可引起人类胃肠炎。在侵入固有层后，S. typhimurium 细菌会迅速被巨噬细胞识别并吞噬，进入称为吞噬体的囊泡中，以期被降解。分离含有 S. typhimurium 的吞噬体已被广泛用于研究 S. typhimurium 感染如何改变吞噬体成熟过程，从而避免细菌被降解。传统上，含细菌吞噬体的分离依赖于蔗糖梯度离心法。然而，该方法耗时较长，且需要专用设备以及一定的操作技巧。本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素-链霉亲和素偶联的磁珠包被细菌，从巨噬细胞中分离含有 S. typhimurium 的吞噬体。采用该方法获得的吞噬体可悬浮于任意选择的缓冲液中，便于将分离的吞噬体用于多种检测，如蛋白质、代谢物和脂质分析。总之，这种分离含 S. typhimurium 吞噬体的方法具有特异性强、效率高、速度快、所需设备最少等优点，且比传统的蔗糖梯度超速离心法更具通用性。

通过本方案分离含有细菌的吞噬体，首先需要对细菌进行生物素标记。因此，我们评估了该方法的有效性 S. typhimurium 通过共聚焦显微镜分析感染了生物素标记的mCherry的BMDMs的生物素化S. typhimurium 用Cy5-Streptavidin标记。简言之，BMDMs按照本方案所述方法用mCherry-S. typhimurium 先前已生物素标记但未与链霉亲和素偶联磁珠孵育的样本。在30分钟孵育后于 37 °C，用预温的PBS洗涤细胞，随后在室温下用4%多聚甲醛固定20分钟。通过多次PBS洗涤终止固定。接着在室温下用含3% Triton的PBS处理5分钟以通透细胞。然后将感染的BMDM与Cy5-Streptavidin在室温下孵育20分钟 4 °C经过充分洗涤后，将样品制备用于共聚焦显微镜分析（图1）。非生物素标记的 mCherry-S鼠伤寒沙门氏菌用作阴性对照。仅在生...

本文介绍一种简单快速的方法，通过用生物素和链霉亲和素包被细菌，从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体。

从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体

鼠伤寒沙门氏菌是一种兼性胞内细菌，可引起人类胃肠炎。在侵入黏膜下层后，S. ...

本实验的总体目标是分离完整且富集的含有细菌的吞噬体。该方法有助于我们回答免疫学领域中的一些关键问题，例如当病原微生物侵入宿主细胞时，吞噬体成熟过程及抗原加工的变化。该技术的主要优势在于，仅需简单的操作步骤且无需特殊设备，即可获得高质量的含有细菌的吞噬体。对于初学者而言，与非技术性方法相比，该方法在技术上更容易掌握。我们最初萌生开发此方法的想法，是在研究细胞内病原体如何劫持吞噬体以利于自身生存的机制时。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员Saray Gutierrez进行演示。开始鼠伤寒沙门氏菌培养时，使用细菌接种环将单个细菌菌落接种至5毫升脑心浸液肉汤中。然后在37摄氏度摇床培养箱中过夜培养该悬浮液。次日，将1毫升该细菌悬浮液转移至锥形瓶中的19毫升BHI肉汤中。再次放入37摄氏度摇床中孵育。当OD600达到1时，从摇床中取出锥形瓶，将菌液转移至50毫升离心管中。然后在4摄氏度条件下以5400 × g离心15分钟。去除上清液后，将细菌沉淀重悬于10毫升无菌PBS中。再次离心一次后，将沉淀重悬于4.9毫升PBS中。接着，向细菌悬液中加入100微升 freshly prepared Biotin linking solution。将该悬液分装至五个1.5毫升离心管后，在室温下于恒温振荡仪中以350 rpm持续振荡孵育两小时。在室温下以15,000 × g离心十分钟后，弃去上清液。再经过两次离心步骤并彻底去除生物素连接溶液后，将该生物素编码的细菌重新悬浮于一个1.5毫升离心管中的1毫升无菌PBS中。将100微升链霉亲和素偶联的磁珠溶液转移至一个新的1.5毫升离心管中，并将该管置于磁力架上静置5分钟。待溶剂被去除后，将离心管从磁力架上取下。随后，用1毫升生物素编码的细菌悬液重新悬浮管中残留的磁珠。将离心管置于室温的温控金属块上，以 350 rpm 振荡孵育 1 小时。随后，将离心管放在磁力架上静置 5 分钟。使用移液器吸除未吸附在管壁上的细菌，并转移至新离心管中，标记为非编码细菌。管壁附着磁珠的离心管中含有生物素-链霉亲和素编码的细菌。将含有生物素-链霉亲和素编码细菌的离心管从磁力架上取下，加入一毫升无菌磷酸盐缓冲液重悬。将离心管置于磁力架上五分钟，随后移除磷酸盐缓冲液。最后，将洗涤后的生物素-链霉亲和素编码细菌重悬于500 µL无菌PBS中，并将试管标记为编码细菌。感染前一天，将完全分化的BMDM细胞接种于6 cm培养皿中，使用添加10% FBS的RPMI培养基。次日，在4°C条件下以15,000 × g离心编码细菌悬液5分钟。去除上清液后，将细菌沉淀重悬于添加了10% FBS的RPMI培养基中。移除BMDMs中的培养基，并加入5毫升用RPMI培养基配制的编码细菌悬液以感染细胞。为同步吞噬作用，在室温下孵育10分钟。然后，为启动吞噬作用，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，从培养皿中移除培养基，并用RPMI洗涤细胞三次，以去除未被内化的细菌。为了杀灭任何未被吞噬的细菌，加入含有10%胎牛血清（FBS）的10毫升RPMI培养基，其中包含50微克/毫升的庆大霉素。最后，将感染的BMDM在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育至预定时间点。首先，在使用前立即加入DTT和细胞松弛素B，并根据制造商建议加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，配制所需体积的吞噬体分离缓冲液A。在预定时间点移除感染细胞的培养基，并用预热至室温的无菌PBS洗涤细胞。然后向培养皿中加入 750 微升吞噬体分离缓冲液 A，冰上孵育 20 分钟。注意期间需偶尔轻轻摇动培养板。接着，加入 250 微升吞噬体分离缓冲液 B，随后轻轻摇动培养板，确保缓冲液完全覆盖表面。使用橡胶刮棒轻轻刮取细胞，将细胞从培养皿上脱离，并转移至预冷的1.5毫升离心管中。随后，用1毫升注射器将细胞悬液通过26号针头反复吹打至少15次。接着，将细胞悬液置于磁力架上静置5分钟。附着在磁珠上的颗粒是含有编码伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）的吞噬体。随后将含有其余细胞组分的悬液转移至新标记为“胞质溶胶”（Cytosol）的1.5毫升离心管中。从磁力架上取下含有分离吞噬体的离心管，加入1毫升无菌PBS重悬。将试管放回磁力架上静置五分钟，随后移除 PBS。用 PBS 重复洗涤一次后，移除 PBS，最后将含有沙门氏菌的吞噬体重新悬浮于所需缓冲液中。为通过共聚焦显微镜评估鼠伤寒沙门氏菌生物素标记的效果，使用经生物素标记的 mCherry 鼠伤寒沙门氏菌感染 BMDM。固定并用Cy5-链霉亲和素孵育后，通过Cy5-链霉亲和素的荧光信号确认了生物素标记的成功。该信号仅在生物素标记的mCherry鼠伤寒沙门氏菌中观察到，而在未进行生物素标记的mCherry鼠伤寒沙门氏菌中则无信号。对分离的吞噬体进行免疫封闭分析显示，与胞质组分相比，表达mCherry的鼠伤寒沙门氏菌在吞噬体中显著富集。使用内体和溶酶体标志物对分离的吞噬体进行免疫阻断分析显示，与感染后30分钟相比，感染后4小时分离的吞噬体中所检测的标志物显著富集。当该方案应用于金黄色葡萄球菌时，成功实现了对表达GFP的金黄色葡萄球菌的生物素标记。一旦掌握，该技术所需时间约为一个半小时，具体时长取决于研究者选择的感染孵育时间。为了确保成功分离含有吞噬体的细菌，请务必确保缓冲液中含有指定浓度的成分，并且培养板需轻轻摇动以保证细胞均匀覆盖。在刮取细胞以及将细胞悬液通过针头时，操作应轻柔。按照本方案操作后，可对分离得到的吞噬体进行蛋白质组学或代谢组学等其他技术分析，以研究病原体在相关致病因素作用下引起的改变。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

巨噬细胞中含有吞噬的鼠伤寒沙门氏菌的分离

来源：Gutiérrez, S., et. al., 从巨噬细胞中分离含鼠伤寒沙门氏菌的吞噬体。J. Vis. Exp. (2017)本视频演示了细胞的培养与制备 Salmonella typhimurium...

鼠伤寒沙门氏菌 培养物的制备

来源：Sigal, N., 等. 从巨噬细胞内增殖的单核细胞增生李斯特菌中提取RNA。 J. Vis. Exp.

从感染的宿主细胞中分离胞内病原菌

来源：Gutiérrez, S., et al., 从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体。J. Vis. Exp.

从感染的巨噬细胞中分离含有磁珠标记细菌的吞噬体

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