巨噬细胞中含有吞噬的鼠伤寒沙门氏菌的分离

我们在这里描述了一个简单和快速的方法, 以隔离的鼠伤寒沙门氏菌-含有吞噬从巨噬细胞涂层细菌与生物素和亲和。

该程序的总体目标是分离含有吞噬体的完整和富集细菌。这种方法可以帮助我们回答免疫学领域的关键问题，例如当病原微生物侵入宿主细胞时吞噬体成熟和抗原加工的变化。该技术的主要优点是它使用简单的步骤生产含有吞噬体的高质量细菌，无需专用设备。

与非方法相比，刚接触该方法的人会发现它在技术上是平易近人的。当我们研究细胞内病原体劫持吞噬体以发挥其优势的机制时，我们第一次有了开发这种方法的想法。演示此程序的是我实验室的博士后 Saray Gutierrez。

要开始鼠伤寒沙门氏菌培养，请使用细菌环将单个细菌菌落接种到 5 毫升脑心输液液中。然后将悬浮液在 37 摄氏度的培养箱中孵育过夜，同时振荡。第二天，将 1 毫升这种细菌混悬液转移到锥形瓶中的 19 毫升 BHI 肉汤中。

在 37 摄氏度的培养箱中再次摇动孵育。当 OD600 达到 1 时，从培养箱中取出培养瓶，并将培养物转移到 50 mL 试管中。然后将试管在 4 摄氏度下以 5400 x G 离心 15 分钟。

去除上清液后，将细菌沉淀重悬于 10 毫升无菌 PBS 中。重复离心一次后，将沉淀重新悬浮在 4.9 ml PBS 中。接下来，将 100 微升新鲜制备的生物素连接溶液添加到细菌悬浮液中。

将该悬浮液分成 5 个 1.5 mL试管后，在热模块中，在室温下以 350 rpm 的速度持续摇动孵育 2 小时。在室温下以 15， 000 x G 离心试管 10 分钟后，弃去上清液。再离心两个步骤并完全去除生物素连接溶液后，将这种生物素编码的细菌重新悬浮在单个 1.5 mL 试管中的 1 毫升无菌 PBS 中。

将 100 μL 链霉亲和素偶联的磁珠溶液转移到新的 1.5 mL 试管中，并将其置于磁力架中 5 分钟。从试管中取出溶剂后，从磁力架上取下试管。然后用 1 毫升生物素编码的细菌悬浮液重悬留在试管中的珠子。

将试管在热模块上室温孵育 1 小时，同时以 350 rpm 的速度摇动。接下来，将试管放在磁力架上 5 分钟。使用移液器去除未粘附在壁上的细菌，并转移到标有非编码细菌的新管中。

粘附在壁上的磁珠管含有生物素链霉亲和素编码的细菌。从磁力架中取出含有生物素链霉亲和素编码细菌的试管，并重新悬浮于一毫升无菌 PBS 中。试管在磁力架上放置 5 分钟后，取出 PBS。

最后，将洗涤的生物素链霉亲和素编码细菌重悬于 500 微升无菌 PBS 中，并将试管标记为编码细菌。在感染前一天，在补充有 10% FBS 的 RPMI 中，将完全分化的 BMDM 放在 6 厘米的培养皿中。第二天，将编码的细菌悬浮液在 4 摄氏度下以 15， 000 x G 离心 5 分钟。

去除上清液后，将细菌沉淀重悬于补充有 10% FBS 的 RPMI 培养基中。从 BMDM 中取出培养基，并在 RPMI 培养基中加入 5 毫升编码的细菌悬浮液，以感染细胞。要同步吞噬作用，请在室温下孵育 10 分钟。

然后启动吞噬作用，在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育 30 分钟。孵育后，从培养皿中取出培养基，并在 RPMI 下洗涤细胞 3 次，以去除未内化的细菌。在 10 毫升 RPMI 中杀死任何非吞噬细菌，其中含有 10% FBS，溶于 50 微克/毫升庆大霉素。

最后，将受感染的 BMDM 在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育，直到所需的时间点。首先，通过在使用前添加 DTT 和细胞松弛素 B 以及制造商推荐的蛋白酶和磷酸酶抑制剂来制备所需体积的吞噬体分离缓冲液 A。在所需时间点从感染细胞中取出培养基，并用预热至室温的无菌 PBS 洗涤细胞。

然后向培养皿中加入 750 微升吞噬体分离缓冲液 A，并在冰上孵育 20 分钟。记得偶尔摇晃盘子。接下来，加入 250 微升 Phagosome 分离缓冲液 B，然后摇动板以确保缓冲液完全覆盖表面。

使用橡胶警察轻轻刮擦细胞，从培养皿中取出细胞，并将它们转移到预冷的 1.5 毫升试管中。然后使用 1 毫升注射器将细胞悬液通过 26 号针头至少 15 次。接下来，将细胞悬液放在磁力架上 5 分钟。

附着在磁珠上的颗粒是含有编码鼠伤寒沙门氏菌的吞噬体。然后将包含其余细胞成分的悬浮液转移到标记为 Cytosol 的新 1.5 毫升试管中。从架子上取下含有分离的吞噬体的试管，然后重新悬浮在一毫升无菌 PBS 中。

将试管放回磁力架上 5 分钟，然后取出 PBS。用 PBS 重复洗涤一次后，去除 PBS，最后，在所需的缓冲液中重新悬浮含有吞噬体的鼠伤寒沙门氏菌。为了通过共聚焦显微镜评估鼠伤寒沙门氏菌生物素化的有效性，BMDM 用生物素标记的 mCherry 鼠伤寒沙门氏菌感染。

与 Cy5-链霉亲和素固定和孵育后，Cy5-链霉亲和素荧光信号证实生物素化成功。该信号仅在生物素化的 mCherry S.Typhimurium 中观察到，而在未生物素化的 mCherry S.Typhimurium 中没有信号。分离的吞噬体的免疫阻滞分析显示，与胞质部分相比，吞噬体中表达鼠伤寒沙门氏菌的 mCherry 显着富集。

在分离的吞噬体中使用内体和溶酶体标志物的免疫阻滞分析显示，与感染后 30 分钟相比，感染后 4 小时分离的吞噬体中测试标志物的富集。当该方案应用于金黄色葡萄球菌时，显示表达金黄色葡萄球菌的 GFP 的成功生物素化。一旦掌握，这项技术可以在大约一个半小时内完成，具体取决于研究者为感染选择的潜伏期。

为确保成功分离含有吞噬体的细菌，请确保缓冲液含有指定浓度，并且摇动板以确保细胞的均匀覆盖。此外，刮擦细胞和将细胞悬液穿过针头时要轻柔。在此程序之后，可以使用分离的吞噬体进行其他技术，例如蛋白质组学或代谢组学，以研究在涉及致病因素下由病原体引起的改变。