从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体

本实验的总体目标是分离完整且富集的含有细菌的吞噬体。该方法有助于我们回答免疫学领域中的一些关键问题，例如当病原微生物侵入宿主细胞时，吞噬体成熟过程及抗原加工的变化。该技术的主要优势在于，仅需简单的操作步骤且无需特殊设备，即可获得高质量的含有细菌的吞噬体。

对于初学者而言，与非技术性方法相比，该方法在技术上更容易掌握。我们最初萌生开发此方法的想法，是在研究细胞内病原体如何劫持吞噬体以利于自身生存的机制时。本次实验操作将由我实验室的博士后研究员Saray Gutierrez进行演示。

开始鼠伤寒沙门氏菌培养时，使用细菌接种环将单个细菌菌落接种至5毫升脑心浸液肉汤中。然后在37摄氏度摇床培养箱中过夜培养该悬浮液。次日，将1毫升该细菌悬浮液转移至锥形瓶中的19毫升BHI肉汤中。

再次放入37摄氏度摇床中孵育。当OD600达到1时，从摇床中取出锥形瓶，将菌液转移至50毫升离心管中。然后在4摄氏度条件下以5400 × g离心15分钟。

去除上清液后，将细菌沉淀重悬于10毫升无菌PBS中。再次离心一次后，将沉淀重悬于4.9毫升PBS中。接着，向细菌悬液中加入100微升 freshly prepared Biotin linking solution。

将该悬液分装至五个1.5毫升离心管后，在室温下于恒温振荡仪中以350 rpm持续振荡孵育两小时。在室温下以15,000 × g离心十分钟后，弃去上清液。再经过两次离心步骤并彻底去除生物素连接溶液后，将该生物素编码的细菌重新悬浮于一个1.5毫升离心管中的1毫升无菌PBS中。

将100微升链霉亲和素偶联的磁珠溶液转移至一个新的1.5毫升离心管中，并将该管置于磁力架上静置5分钟。待溶剂被去除后，将离心管从磁力架上取下。随后，用1毫升生物素编码的细菌悬液重新悬浮管中残留的磁珠。

将离心管置于室温的温控金属块上，以 350 rpm 振荡孵育 1 小时。随后，将离心管放在磁力架上静置 5 分钟。使用移液器吸除未吸附在管壁上的细菌，并转移至新离心管中，标记为非编码细菌。

管壁附着磁珠的离心管中含有生物素-链霉亲和素编码的细菌。将含有生物素-链霉亲和素编码细菌的离心管从磁力架上取下，加入一毫升无菌磷酸盐缓冲液重悬。将离心管置于磁力架上五分钟，随后移除磷酸盐缓冲液。

最后，将洗涤后的生物素-链霉亲和素编码细菌重悬于500 µL无菌PBS中，并将试管标记为编码细菌。感染前一天，将完全分化的BMDM细胞接种于6 cm培养皿中，使用添加10% FBS的RPMI培养基。次日，在4°C条件下以15,000 × g离心编码细菌悬液5分钟。

去除上清液后，将细菌沉淀重悬于添加了10% FBS的RPMI培养基中。移除BMDMs中的培养基，并加入5毫升用RPMI培养基配制的编码细菌悬液以感染细胞。为同步吞噬作用，在室温下孵育10分钟。

然后，为启动吞噬作用，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育30分钟。孵育结束后，从培养皿中移除培养基，并用RPMI洗涤细胞三次，以去除未被内化的细菌。为了杀灭任何未被吞噬的细菌，加入含有10%胎牛血清（FBS）的10毫升RPMI培养基，其中包含50微克/毫升的庆大霉素。

最后，将感染的BMDM在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育至预定时间点。首先，在使用前立即加入DTT和细胞松弛素B，并根据制造商建议加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，配制所需体积的吞噬体分离缓冲液A。在预定时间点移除感染细胞的培养基，并用预热至室温的无菌PBS洗涤细胞。

然后向培养皿中加入 750 微升吞噬体分离缓冲液 A，冰上孵育 20 分钟。注意期间需偶尔轻轻摇动培养板。接着，加入 250 微升吞噬体分离缓冲液 B，随后轻轻摇动培养板，确保缓冲液完全覆盖表面。

使用橡胶刮棒轻轻刮取细胞，将细胞从培养皿上脱离，并转移至预冷的1.5毫升离心管中。随后，用1毫升注射器将细胞悬液通过26号针头反复吹打至少15次。接着，将细胞悬液置于磁力架上静置5分钟。

附着在磁珠上的颗粒是含有编码伤寒沙门氏菌（S.Typhimurium）的吞噬体。随后将含有其余细胞组分的悬液转移至新标记为“胞质溶胶”（Cytosol）的1.5毫升离心管中。从磁力架上取下含有分离吞噬体的离心管，加入1毫升无菌PBS重悬。

将试管放回磁力架上静置五分钟，随后移除 PBS。用 PBS 重复洗涤一次后，移除 PBS，最后将含有沙门氏菌的吞噬体重新悬浮于所需缓冲液中。为通过共聚焦显微镜评估鼠伤寒沙门氏菌生物素标记的效果，使用经生物素标记的 mCherry 鼠伤寒沙门氏菌感染 BMDM。

固定并用Cy5-链霉亲和素孵育后，通过Cy5-链霉亲和素的荧光信号确认了生物素标记的成功。该信号仅在生物素标记的mCherry鼠伤寒沙门氏菌中观察到，而在未进行生物素标记的mCherry鼠伤寒沙门氏菌中则无信号。对分离的吞噬体进行免疫封闭分析显示，与胞质组分相比，表达mCherry的鼠伤寒沙门氏菌在吞噬体中显著富集。

使用内体和溶酶体标志物对分离的吞噬体进行免疫阻断分析显示，与感染后30分钟相比，感染后4小时分离的吞噬体中所检测的标志物显著富集。当该方案应用于金黄色葡萄球菌时，成功实现了对表达GFP的金黄色葡萄球菌的生物素标记。一旦掌握，该技术所需时间约为一个半小时，具体时长取决于研究者选择的感染孵育时间。

为了确保成功分离含有吞噬体的细菌，请务必确保缓冲液中含有指定浓度的成分，并且培养板需轻轻摇动以保证细胞均匀覆盖。在刮取细胞以及将细胞悬液通过针头时，操作应轻柔。按照本方案操作后，可对分离得到的吞噬体进行蛋白质组学或代谢组学等其他技术分析，以研究病原体在相关致病因素作用下引起的改变。