肿瘤细胞系基因表达的条件性击倒研究单核/巨噬细胞在微环境中的招募
2017年11月23日
本议定书作为一个计划, 建立一个功能性的癌症细胞系的系统, 并随后使用, 特别是研究肿瘤细胞源性蛋白质在招募单核/巨噬细胞到肿瘤微环境的作用。
该方案的总体目的是利用癌细胞中基因表达的条件性敲低来研究单核细胞和巨噬细胞在体外向肿瘤微环境的募集。这种方法可以帮助回答肿瘤微环境领域中关于癌细胞和免疫系统细胞之间交叉存量性质的关键问题。该技术的主要优点是此处使用的系统需要单载体克隆，允许快速生成多个克隆，并且表现出非常低的厚度。
还展示了一种无需直接接触抗体即可纯化人单核细胞的方法，该方法避免了意外激活，同时产生超过 95% 纯度的人单核细胞群。为了产生病毒颗粒，用 25 μg pLKO-tet-on shRNA、25 μg psPAX 包装质粒和 5 μg 包膜表达质粒 pMD2 转染 70% 汇合的 150 mm 培养皿 HEK-293 细胞。G 按照标准方案使用转染试剂。
将混合物加入 150 毫米的培养皿中。第二天，通过将培养基更换为补充有 10 毫摩尔丁酸钠和 20 毫摩尔 HEPES 的 DMEM，诱导细胞中产生慢病毒。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 8 小时。
8 小时后，用 PBS 洗涤细胞，并加入 25 毫升新鲜的 DMEM 培养基，含 20 毫摩尔的 HEPES，不含丁酸钠。孵育 48 小时后，用移液管小心收集含病毒的培养基。为了产生稳定的细胞系，首先将 HCT-116 结肠癌细胞和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞接种到 12 孔板中，每孔 50， 000 个细胞。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。当细胞汇合度为 60-70% 时，用 PBS 洗涤细胞，并向每个孔中加入 1 毫升含病毒的培养基。第二天，通过抽吸小心去除含病毒的培养基。
然后，在用 PBS 洗涤细胞后，加入含有不含四环素的 FBS 的培养基。72 小时后，像以前一样洗涤细胞，并加入补充有 1 μg/mL 嘌呤霉素的培养基，以筛选病毒转染的细胞。通过在嘌呤霉素存在下培养细胞 3 至 14 天来选择病毒转导的细胞。
观察嘌呤霉素在病毒转导细胞中的孔部分杀伤。未转导的细胞在嘌呤霉素存在下不会生长。当这些对照细胞死亡时，在抗生素存在下继续培养条件调节的细胞系两周，以产生条件调节的细胞系。
通过添加含有不同浓度多西环素的培养基并培养细胞 72 小时，验证嘌呤霉素耐药的 HCT-116 结肠癌和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中的条件性敲低效率。制备细胞裂解物后，通过 western blot 分析验证敲低水平。此处显示了 PAI-1 的水平。
为了分离外周血单核细胞，首先准备三支含有 15 mL 密度梯度溶液的 50 mL 试管。然后使用设置在重力流上的移液器控制器，将 30 毫升稀释的血液缓慢地铺在密度梯度溶液上。在水平转子中，在室温下以 400 g 离心，不间断离心 25 分钟。
离心后，处理顶层，将含有外周血单核细胞的中间层转移到新鲜的 50 毫升试管中，并添加补充 FBS 的 PBS 至 50 毫升。在室温下以 120 g 离心 10 分钟。离心后，除去含有血小板的上清液。
在最后一次离心和收集后，将沉淀重悬于 50 毫升补充有 FBS 的 PBS 中，并使用血细胞计数器计数外周血单核细胞。以 120 g 离心细胞后，将沉淀重悬于含有 1 毫摩尔 EDTA 的 FBS 补充 PBS 中，最终浓度为每毫升 5000 万个细胞。然后，通过为每毫升细胞悬液添加 50 μL 阴性选择抗体混合物来开始富集单核细胞并混合。
在室温下孵育 10 分钟。孵育后，每毫升加入 50 μL 磁珠，混合并再孵育 10 分钟。然后加入含 FBS 和 EDTA 的 PBS 至 25 mL，并将外周血单核混合物放入可容纳 50 mL试管的磁铁中。
在室温下孵育 10 分钟后，磁珠将粘附在试管壁上，并将非单核细胞从溶液中隔离出来。使用 25 毫升移液器从试管中去除含有单核细胞的溶液，同时注意不要用移液器接触试管的侧面。离心并去除上清液后，将含有单核细胞的沉淀重悬于含有 10% 不含 TET 的 FBS 和 1% pen-strep 的 RPMI 培养基中。
通过将 40， 000 个 HCT-116 或 MDA-MB-231 细胞以 0.5 毫升体积接种在 24 孔板的孔中，一式三份开始测定。第二天，向井中添加过滤器。然后将 8， 000 个单核细胞以 0.3 毫升体积接种到放置在癌细胞顶部的 BSA 处理的多孔膜插入物上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。
48 小时后收集插入片段。甩掉多余的培养基，然后用棉签涂抹器精确擦拭内表面，以去除未迁移的细胞。使用 Wright-Giemsa 方法对插入物的外侧进行染色。
将迁移的巨噬细胞面朝上安装过滤器后，使用具有 20 倍物镜的光学显微镜对载玻片进行成像。拍摄每个过滤器的 9 个字段的照片，并计数所有字段中迁移的巨噬细胞。Boyden Chamber 测定法用于量化单核细胞向癌细胞的迁移。
在 MDA-MB-231 乳腺癌细胞存在下，在共培养物中加入多西环素下调 PAI-1 后，单核细胞迁移被抑制 33%。在 HCT-116 结肠癌细胞存在的情况下，这种对单核细胞迁移的抑制更为明显，其中多西环素给药敲低 PAI-1 使单核细胞迁移减少 74%当将多西环素处理的癌细胞的条件培养基作为趋化剂的来源放置在孔底部时，观察到类似的结果。看完这个视频，您应该对如何使用功能性 tet-on 系统在人癌细胞系中进行基因表达敲低，以研究癌症来源的分泌蛋白 PAI-1 对人单核细胞的趋化作用有一个很好的了解。
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概述
本协议概述了一个用于癌细胞系的功能性Tet-ON系统，重点关注肿瘤细胞衍生蛋白在单核细胞/巨噬细胞招募到肿瘤微环境中的作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 免疫学
- 癌症研究
背景
- 了解癌细胞与免疫细胞之间的相互作用对癌症研究至关重要。
- 单核细胞和巨噬细胞在肿瘤微环境中发挥重要作用。
- 条件性敲低技术可以提供对这些相互作用的洞察。
- 人类单核细胞的纯化方法对于准确的研究至关重要。
研究目的
- 调查免疫细胞对肿瘤的招募机制。
- 利用Tet-ON系统在癌细胞中进行条件性基因表达。
- 增进对肿瘤-免疫细胞相互作用的理解。
使用的方法
- 癌细胞中的条件性基因表达敲低。
- 单载体克隆用于快速生成多个克隆。
- 不接触抗体的人类单核细胞纯化。
- 转染HEK-293细胞以产生病毒颗粒。
主要结果
- 成功在癌细胞系中建立了Tet-ON系统。
- 在人类单核细胞群体中达到95%以上的纯度。
- 在体外证明了免疫细胞的有效招募。
- 提供了对肿瘤微环境动态的洞察。
结论
- Tet-ON系统是研究癌症-免疫相互作用的有价值工具。
- 条件性敲低技术可以阐明特定基因的作用。
- 了解单核细胞招募可以为治疗策略提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
Conditional gene knockdown in cancer cell lines enables mechanistic interrogation of tumor-immune interactions, specifically the role of secreted factors like PAI-1 in monocyte recruitment. This approach supports target validation by allowing time-dependent modulation of gene expression to avoid lethal phenotypes and assess functional contributions to the tumor microenvironment. The method provides predictive confidence in de-risking immunomodulatory targets by linking gene suppression to measurable immune cell migration in vitro.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by conditionally regulating gene expression to assess impact on monocyte recruitment without confounding cytotoxic effects.
- Operational Value: Supports functional target validation through inducible knockdown that clarifies pathway involvement in tumor-immune crosstalk.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking gene suppression to reduced monocyte migration, informing go/no-go decisions in immunomodulatory programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated cancer cell lines with inducible shRNA expression for consistent, reproducible assessment of chemoattractant activity.
- Operational Value: Enables standardization of monocyte migration assays using purified primary cells and Boyden chamber readouts for quantitative comparison across conditions.
- Scalability: Facilitates platform reuse across cancer models (e.g., HCT-116, MDA-MB-231) and secreted factors beyond PAI-1.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical work by modeling human tumor-monocyte interactions in a controlled, reproducible system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether secreted proteins act as direct chemoattractants, reducing ambiguity in biomarker or target prioritization.
- Predictive Continuity: Supports risk-adjusted advancement by providing functional data on immune modulation before in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The Tet-ON conditional knockdown system fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling iterative testing of immunomodulatory mechanisms in physiologically relevant cancer cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing temporal control of gene expression to dissect dynamic tumor-stroma interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, inducible cell lines that produce quantifiable outputs (e.g., migrated macrophage counts) for compound or genetic perturbation screening.
- Analytics: Generates measurable dependent variables (monocyte migration inhibition %) that enable statistical comparison between control and knockdown conditions.
- Translational Research: Models human-relevant tumor microenvironment dynamics using primary monocytes and cancer cell lines, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for studying various secreted factors in immune recruitment, adaptable across oncology indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-immunology studies by enabling conditional, reversible gene suppression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized viral transduction, selection, and induction protocols across cell lines.
- Strategic Value: Improves target prioritization by providing functional evidence of gene contribution to immune evasion or infiltration.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted resource allocation by validating targets whose modulation alters monocyte behavior in vitro.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, cell culture, and antibiotic selection for stable line generation.
- Dependent on transfection efficiency and viral titer for consistent transduction in cancer cell lines.
- Necessitates validation of knockdown efficiency via Western blot or qPCR post-induction to confirm on-target effects.
- Requires optimization of doxycycline concentration and timing to avoid leaky expression or cytotoxicity.
- Relies on aseptic technique and density gradient centrifugation for high-purity monocyte isolation without activation.
