肿瘤细胞系基因表达的条件性击倒研究单核/巨噬细胞在微环境中的招募

该方案的总体目的是利用癌细胞中基因表达的条件性敲低来研究单核细胞和巨噬细胞在体外向肿瘤微环境的募集。这种方法可以帮助回答肿瘤微环境领域中关于癌细胞和免疫系统细胞之间交叉存量性质的关键问题。该技术的主要优点是此处使用的系统需要单载体克隆，允许快速生成多个克隆，并且表现出非常低的厚度。

还展示了一种无需直接接触抗体即可纯化人单核细胞的方法，该方法避免了意外激活，同时产生超过 95% 纯度的人单核细胞群。为了产生病毒颗粒，用 25 μg pLKO-tet-on shRNA、25 μg psPAX 包装质粒和 5 μg 包膜表达质粒 pMD2 转染 70% 汇合的 150 mm 培养皿 HEK-293 细胞。G 按照标准方案使用转染试剂。

将混合物加入 150 毫米的培养皿中。第二天，通过将培养基更换为补充有 10 毫摩尔丁酸钠和 20 毫摩尔 HEPES 的 DMEM，诱导细胞中产生慢病毒。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养 8 小时。

8 小时后，用 PBS 洗涤细胞，并加入 25 毫升新鲜的 DMEM 培养基，含 20 毫摩尔的 HEPES，不含丁酸钠。孵育 48 小时后，用移液管小心收集含病毒的培养基。为了产生稳定的细胞系，首先将 HCT-116 结肠癌细胞和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞接种到 12 孔板中，每孔 50， 000 个细胞。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。当细胞汇合度为 60-70% 时，用 PBS 洗涤细胞，并向每个孔中加入 1 毫升含病毒的培养基。第二天，通过抽吸小心去除含病毒的培养基。

然后，在用 PBS 洗涤细胞后，加入含有不含四环素的 FBS 的培养基。72 小时后，像以前一样洗涤细胞，并加入补充有 1 μg/mL 嘌呤霉素的培养基，以筛选病毒转染的细胞。通过在嘌呤霉素存在下培养细胞 3 至 14 天来选择病毒转导的细胞。

观察嘌呤霉素在病毒转导细胞中的孔部分杀伤。未转导的细胞在嘌呤霉素存在下不会生长。当这些对照细胞死亡时，在抗生素存在下继续培养条件调节的细胞系两周，以产生条件调节的细胞系。

通过添加含有不同浓度多西环素的培养基并培养细胞 72 小时，验证嘌呤霉素耐药的 HCT-116 结肠癌和 MDA-MB-231 乳腺癌细胞中的条件性敲低效率。制备细胞裂解物后，通过 western blot 分析验证敲低水平。此处显示了 PAI-1 的水平。

为了分离外周血单核细胞，首先准备三支含有 15 mL 密度梯度溶液的 50 mL 试管。然后使用设置在重力流上的移液器控制器，将 30 毫升稀释的血液缓慢地铺在密度梯度溶液上。在水平转子中，在室温下以 400 g 离心，不间断离心 25 分钟。

离心后，处理顶层，将含有外周血单核细胞的中间层转移到新鲜的 50 毫升试管中，并添加补充 FBS 的 PBS 至 50 毫升。在室温下以 120 g 离心 10 分钟。离心后，除去含有血小板的上清液。

在最后一次离心和收集后，将沉淀重悬于 50 毫升补充有 FBS 的 PBS 中，并使用血细胞计数器计数外周血单核细胞。以 120 g 离心细胞后，将沉淀重悬于含有 1 毫摩尔 EDTA 的 FBS 补充 PBS 中，最终浓度为每毫升 5000 万个细胞。然后，通过为每毫升细胞悬液添加 50 μL 阴性选择抗体混合物来开始富集单核细胞并混合。

在室温下孵育 10 分钟。孵育后，每毫升加入 50 μL 磁珠，混合并再孵育 10 分钟。然后加入含 FBS 和 EDTA 的 PBS 至 25 mL，并将外周血单核混合物放入可容纳 50 mL试管的磁铁中。

在室温下孵育 10 分钟后，磁珠将粘附在试管壁上，并将非单核细胞从溶液中隔离出来。使用 25 毫升移液器从试管中去除含有单核细胞的溶液，同时注意不要用移液器接触试管的侧面。离心并去除上清液后，将含有单核细胞的沉淀重悬于含有 10% 不含 TET 的 FBS 和 1% pen-strep 的 RPMI 培养基中。

通过将 40， 000 个 HCT-116 或 MDA-MB-231 细胞以 0.5 毫升体积接种在 24 孔板的孔中，一式三份开始测定。第二天，向井中添加过滤器。然后将 8， 000 个单核细胞以 0.3 毫升体积接种到放置在癌细胞顶部的 BSA 处理的多孔膜插入物上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。

48 小时后收集插入片段。甩掉多余的培养基，然后用棉签涂抹器精确擦拭内表面，以去除未迁移的细胞。使用 Wright-Giemsa 方法对插入物的外侧进行染色。

将迁移的巨噬细胞面朝上安装过滤器后，使用具有 20 倍物镜的光学显微镜对载玻片进行成像。拍摄每个过滤器的 9 个字段的照片，并计数所有字段中迁移的巨噬细胞。Boyden Chamber 测定法用于量化单核细胞向癌细胞的迁移。

在 MDA-MB-231 乳腺癌细胞存在下，在共培养物中加入多西环素下调 PAI-1 后，单核细胞迁移被抑制 33%。在 HCT-116 结肠癌细胞存在的情况下，这种对单核细胞迁移的抑制更为明显，其中多西环素给药敲低 PAI-1 使单核细胞迁移减少 74%当将多西环素处理的癌细胞的条件培养基作为趋化剂的来源放置在孔底部时，观察到类似的结果。看完这个视频，您应该对如何使用功能性 tet-on 系统在人癌细胞系中进行基因表达敲低，以研究癌症来源的分泌蛋白 PAI-1 对人单核细胞的趋化作用有一个很好的了解。