细胞侵袭和迁移过程的评价: 视频 Microscope-based 刮伤法与博伊登室法的比较

本研究报告了两种不同的细胞浸润和迁移分析方法: 博伊登室法和体外视频 microscope-based 伤口愈合试验。对这两种实验的协议进行了描述, 并对它们的优缺点进行了比较。

本实验的总体目标是报告和比较用于研究细胞侵袭和迁移的两种测定法，即 Boyden 室测定法和基于体外视频显微镜的优化划痕测定法。这些实验可以帮助回答入侵和迁移研究领域的关键问题，例如选择最相关的方法。这种基于体外视频显微镜的优化划痕检测的主要优点是它提供了治疗条件之间的可重复和精确的比较。

虽然这种方法可以评估细胞迁移和侵袭，但它也可以应用于其他研究领域，例如愈合或组织再生。在测定的第一天前 72 小时制备 SQ20B 细胞，方法是在 175 平方厘米的烧瓶中的 25 毫升培养基中接种 1/6 细胞两次 10 次。让细胞在 37 摄氏度下生长至 80% 细胞汇合。

在胰蛋白酶消化和细胞计数后的第一天，将细胞以 6 倍 10 的细胞密度接种到 3 毫升培养基中的 1/5 细胞中，以评估每种条件。将细胞在 37 摄氏度下孵育 24 小时。第二天，用 3 mL 低胎牛血清培养基替换每个培养瓶中的培养基，使细胞饥饿。

将细胞在 37 摄氏度的培养箱中饥饿 24 小时。对于侵袭测定，在细胞饥饿开始后 12 小时准备包被的 Boyden 腔室。将每个 Boyden 腔室放在伴侣板中。

向每个包被室中加入 500 μL 饥饿细胞培养基。第二天，即第 3 天，使用配套板制备趋化因子。用 750 微升含 10% FBS、氢化可的松、青霉素和链霉素的完全培养基填充 24 孔伴侣板的每个孔。

将上腔室转移到预装的配套板中，注意避免气泡。对于侵袭测定，小心地从每个 Boyden 室中取出 450 微升培养基。在胰蛋白酶消化和计数饥饿的 SQ20B 细胞后，在 500 微升 0.1% BSA 培养基中接种 3 乘以 10 到 1/4 细胞中，最终稀释为 6 乘以 10 到 1/4 细胞/毫升。

将 Boyden 腔室置于 37 摄氏度的培养箱中 24 小时。第四天，从伴侣板中取出每个插入物，并使用棉签小心地从上腔室中取出细胞。随后，根据制造商的说明，使用染色试剂盒单独固定和染色每个插入物以获得 May-Grunwald Giemsa 着色。

在第 5 天进行显微镜分析。将带有插入物的伴侣板插入 20 倍相差显微镜上，并对膜下部每个迁移的细胞进行计数。在测定的第一天前 72 小时，将 10 个 SQ20B 细胞接种两次，放入 175 平方厘米培养瓶中的 25 毫升培养基中，并让细胞生长至 80% 细胞汇合。

在胰蛋白酶消化和细胞计数后的第一天，以 4 乘以 10 至 1/5 个细胞/毫升的密度生成预稀释的 SQ20B 细胞样品。将 100 微升细胞溶液分配到 96 孔板的每个孔中，使每个孔中每 100 微升 1/4 个细胞的最终密度为 4 乘以 10。将板放入 37 摄氏度的培养箱中，让细胞粘附在板上 12 至 16 小时。

第二天，使用商用伤人装置将板带到引擎盖进行伤人。取下伤口制造器的顶部并将其放入清洗船溶液中。将板插入底板支架并取下板盖。

通过将销块的后销钉引导到底板的后孔中来更换销块。按住黑色拉杆并提起销块，同时继续按住黑色拉杆。使用带有适配锥形尖端的移液器立即从每个孔中取出培养基，注意不要接触伤口。

向每个孔中加入 100 μL 加热至 37 摄氏度的细胞培养基，洗涤细胞。第二次洗涤后，使用带有适配锥形尖端的移液器吸出细胞培养基。接下来，向每个孔中加入 100 微升特定于每种处理条件的培养基，确保避免在孔中产生任何气泡。

将 96 孔板放入视频显微镜的适配架中。使用视频显微镜软件以每孔一张图像对扫描计划进行编程。对于迁移入侵实验，最长需要 2 小时的间隔。

如果实验的目标是生成视频，则最好使用最长 30 分钟的间隔。使用适合每种细胞类型的适当细胞掩模监测和检查细胞迁移至少 24 小时和最多 5 天，以分析细胞迁移。要获得适用于每种细胞系的细胞掩码，请使用特定的细胞图像集合从软件生成细胞处理定义。

跟踪曲线并将数据导出到电子表格中，该电子表格可用于分析和比较结果。以与细胞迁移测定相同的方式制备细胞侵袭测定接种 SQ20B 细胞，并在培养箱中孵育 96 孔板。在测定的第二天，准备细胞外基质。

使用前将基质在 4 摄氏度下解冻至少 12 小时，并确保没有可见的聚集体。将微量离心管在冰上冷却 5 分钟。在预冷的微量离心管中，用预冷至 4 摄氏度的锥形尖端稀释基质，冷却至 4 摄氏度的细胞培养基，以获得 300 μg/mL 的最终浓度。

将带有预稀释基质的微量离心管保存在冰箱中 4 摄氏度。从培养箱中取出 96 孔板。如前所述，根据制造商的协议，使用商用伤人装置在引擎盖下制作伤口。

使用带有适配锥形尖端的移液器立即从每个孔中取出培养基，并注意不要接触伤口。使用加热至 37 摄氏度的 100 μL 细胞培养基洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将板放在冰上 5 分钟以平衡其温度。

从每个孔中取出冷介质，注意小心地从边缘移液，避免接触伤口。使用在 4 摄氏度下预冷的锥形吸头，向每个孔中加入 50 μL 预稀释的基质。将板放入 37 摄氏度的培养箱中 30 分钟。

30 分钟后，按照每种处理条件的要求，向每个孔中加入 100 μL 适应的细胞培养基。将板放入视频显微镜中合适的架子中。随后对扫描进行编程并执行视频显微镜分析，如细胞迁移测定所示。

显示了细胞固定后 Boyden 膜的代表性结果。次优膜在膜的上侧有细胞簇，结果无法解释。相比之下，最佳膜的下部有可计数的细胞被染成蓝色。

这些在零小时、15 小时和 30 小时伤口愈合的图像说明了划痕测定的最佳结果。质量实验的标准是线性伤口、在伤口中未观察到细胞片段以及最佳细胞汇合度。如图 A 所示，90% 汇合度是伤口愈合测定的最佳细胞密度，图 C 显示了低细胞密度的示例，图 B 显示了由于细胞沉淀洗涤不足而导致的细胞簇。

使用视频显微镜软件获得的伤口愈合的图形表示显示了四种治疗条件下根据时间对伤口细胞汇合参数的量化。据观察，联合治疗显着降低了细胞迁移。观看此视频后，您应该对如何评估细胞迁移和侵袭过程有很好的了解。