Name: 细胞侵袭和迁移过程的评价: 视频 Microscope-based 刮伤法与博伊登室法的比较 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学习使用博伊登室法和视频显微镜划痕法评估SQ20B细胞的侵袭与迁移过程。本方法为肿瘤转移及组织再生研究提供可重复且精确的比较分析工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

这些技术的开发得到了 LabEx PRIMES（ANR-11-LABX-0063）、在 ETOILE 科学框架内的国家-大区计划合同（CPER）（CPER 2009-2013）以及 Lyric 基金 INCa-DGOS-4664 的支持。

注意：未加入细胞外基质（ECM）的Boyden小室实验和平面划痕实验被称为迁移实验，而加入细胞外基质（ECM）的相同实验则被称为侵袭实验。
1. Boyden 小室实验
注意：本方案针对 SQ20B 细胞系进行优化，该细胞系源自复发性头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的喉癌，由美国马萨诸塞州波士顿的 John Little 提供。
第1天
<ol>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>在第1天前72小时，于175 cm2 培养瓶中加入12 mL培养基（CM），接种2×106个SQ20B细胞，使其生长至80%汇合度。
		<ol>
			<li>配制SQ20B细胞培养基（CM）时，需在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FCS）、0.04 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在超净工作台内对细胞进行胰酶消化：吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入2.5 mL含0.5 g/L乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶溶液，在37 °C孵育5分钟，随后加入12.5 mL预热至37 °C的CM终止反应。使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。</li>
		<li>将细胞以每种实验条件6×105个细胞的密度接种于25 cm2 培养瓶中，每瓶加入3 mL CM，于37 °C孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天
<ol start="2">
	<li>细胞饥饿处理及包被小室的准备
	<ol>
		<li>通过将每个培养瓶中的培养基更换为 3 mL 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的低胎牛血清（FBS）培养基（代替 FBS）来对细胞进行饥饿处理。将细胞在培养箱中饥饿培养 24 小时。
		<ol>
			<li>为制备饥饿条件培养基（s-CM），在 DMEM 中添加 0.1% BSA、0.04 mg/mL 氢化可的松、100 U/mL 青霉素和 0.1 g/L 链霉素。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行迁移实验时，进入步骤 1.3。</li>
		<li>进行侵袭实验时，在第 3 天前 12 小时，通过向每个包被的小室中加入 500 μL s-CM 来准备包被的 Boyden 小室。使用 commercially prepared coated Boyden chambers（商品化预包被 Boyden 小室），并在使用前将其保存于 4 °C。将每个 Boyden 小室放入配套板中，并于 37 °C 培养箱中孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第3天
<ol start="3">
	<li>在Boyden小室中接种细胞
	<ol>
		<li>使用配套培养板制备趋化因子。在24孔配套培养板的每个孔中加入750 μL含10% FBS、0.04 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素的完全培养基。
		<ol>
			<li>根据每种细胞系和每种处理条件调整趋化因子。为制备趋化因子条件培养基（ca-CM），在DMEM中添加10% FCS、0.4 mg/mL氢化可的松、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将上室转移至已预加液体的配套培养板中，注意避免产生气泡。</li>
		<li>进行侵袭实验时，小心从每个Boyden小室中移除450 μL的CM。</li>
		<li>在超净工作台内，用胰蛋白酶消化细胞。吸去培养基，用无菌PBS洗涤细胞，加入0.5 mL含0.5 g/L EDTA的胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。加入已预热至37 °C的CM终止反应。使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。</li>
		<li>将3×104个SQ20B细胞接种于500 μL含0.1% BSA的培养基中，最终稀释浓度为6×104个细胞/mL。 
		注意：应根据不同的细胞系调整细胞接种浓度。</li>
		<li>将培养板置于37 °C培养箱中孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第4天
<ol start="4">
	<li>细胞固定与染色
	<ol>
		<li>在细胞系特异的倍增时间之前固定细胞。SQ20B细胞需在24小时之前固定。</li>
		<li>从配套培养板中取出每个插件，并使用棉签小心清除上室中的细胞。特别需要注意彻底清除位于上室的所有细胞。</li>
		<li>使用提供的染色试剂盒对每个插件单独进行固定和染色，以获得瑞氏-吉姆萨染色（May-Grunwald Giemsa coloration）9。或者，可在另一个配套培养板中使用4%多聚甲醛进行30分钟的固定。</li>
		<li>将插件置于洁净的24孔配套培养板中，在生物安全柜内干燥每个室。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第5天
<ol start="5">
	<li>显微镜分析
	<ol>
		<li>将带有插入物的配套培养板置于20倍相差显微镜下，计数膜下表面的每一个迁移细胞。通过将物镜从底部向上移动，优化至最佳焦距位置，并将焦点停留在膜的底部区域。</li>
		<li>计算迁移细胞数与接种细胞数之间的比值。每种处理条件下均需重复计数三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 划痕伤口实验：细胞迁移
注意：必须针对每种类型的细胞调整说明。
第1天
<ol>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>在第1天前72小时，于175 cm2培养瓶中加入12 mL完全培养基（CM），接种2 × 106个SQ20B细胞，培养至细胞融合度达到80%。</li>
		<li>在超净工作台内对细胞进行胰酶消化：吸除培养基，用无菌PBS洗涤细胞，加入2.5 mL胰酶-EDTA溶液（0.5 g/L），于37 °C孵育5分钟。加入12.5 mL预热至37 °C的完全培养基终止反应。使用细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
		<li>制备预稀释细胞悬液，调整细胞密度为4 × 105/mL，使每孔加入100 μL后最终密度为4 × 104个细胞。该浓度需根据不同的细胞系进行优化，通常应控制在1 × 104至6 × 104个细胞之间。</li>
		<li>取100 μL步骤2.1.2中制备的细胞悬液，接种至96孔板的每个孔中。</li>
		<li>将培养板置于室温静置5分钟，使细胞在孔底均匀分布。</li>
		<li>将培养板放入培养箱，在37 °C条件下孵育12至16小时（最长），使细胞充分贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天
<ol start="2">
	<li>划痕伤口实验
	<ol>
		<li>从培养箱中取出步骤 2.1 中准备好的培养板。</li>
		<li>在生物安全柜内，根据生产商提供的操作说明，使用商用划痕工具制造伤口。</li>
		<li>立即使用带有适配锥形吸头的移液器吸除每个孔中的培养基，注意不要触碰伤口区域。</li>
		<li>用预热至 37 °C 的 100 μL 条件培养基（CM）对细胞进行两次洗涤，每次均重复吸除操作。</li>
		<li>洗涤步骤完成后，使用带有适配锥形吸头的移液器吸除 CM。</li>
		<li>向每个孔中加入 100 μL 针对不同处理条件的特定培养基。</li>
		<li>尽量避免在孔中产生气泡。此时可采用反向移液技术；或者使用注射器针头手动去除气泡。</li>
		<li>将培养板放入视频显微镜专用的支架中。</li>
		<li>为提高图像质量，在首次扫描前应让培养板预热至少 15 分钟，以避免培养板底面产生冷凝水。</li>
		<li>使用视频显微镜软件设置扫描程序，每个孔采集一张图像。对于侵袭-迁移实验，扫描间隔不得超过 2 小时；若实验目的是生成延时视频，则建议扫描间隔不超过 30 分钟。</li>
		<li>实验结束后，仔细清洗划痕工具，并严格按照生产商推荐的四个清洗步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第3、4和5天
<ol start="3">
	<li>使用视频显微镜分析细胞迁移
	<ol>
		<li>持续监测并检查细胞迁移，时间不少于24小时，最长可达5天。</li>
		<li>使用针对每种细胞类型优化的细胞掩模（cell mask）来分析细胞迁移。为获得适用于每种细胞系的细胞掩模，需利用特定的细胞图像集合，通过软件生成相应的细胞处理定义。</li>
		<li>绘制迁移轨迹曲线，并将数据导出至电子表格，用于后续结果的分析与比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 划痕伤口实验：细胞侵袭
注意：每种细胞类型的说明必须进行相应调整。
第1天
<ol>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>采用与步骤 2.1 中所述相同的细胞接种方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天
<ol start="2">
	<li>准备细胞外基质（ECM）
	<ol>
		<li>使用前在 4 °C 下解冻基质至少 12 小时。确保无可见的聚集物。若存在聚集物，需将基质在 4 °C 下继续保存更长时间，直至聚集物消失。操作过程中将基质置于冰上，并使用预冷的移液器吸头。 
		注意：若未保持在 4 °C，基质会凝固。</li>
		<li>将微量离心管置于冰上预冷 5 分钟。</li>
		<li>从冰箱中取出已冷却至 4 °C 的培养基（CM），在预冷的微量离心管中稀释基质，使其终浓度为 300 μg/mL。</li>
		<li>将已预稀释的基质微量离心管放回 4 °C 冰箱中。 
		注意：使用适用于微量离心管的冷却架有助于在整个实验过程中维持管内温度为 4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第2天
<ol start="3">
	<li>划痕伤口实验及细胞外基质处理
	<ol>
		<li>从培养箱中取出步骤 3.1 中制备的培养板。</li>
		<li>在生物安全柜中，根据生产商的操作说明，使用商用划痕装置制造伤口。</li>
		<li>立即使用带锥形吸头的移液器小心吸去每孔中的培养基，注意不要触碰伤口区域。</li>
		<li>用 37 °C 预热的完全培养基（CM）重复吸除操作，清洗细胞两次，每次 100 μL。</li>
		<li>第二次清洗后，将培养板置于 4 °C 培养箱中平衡温度 5 分钟。</li>
		<li>使用带锥形吸头的移液器小心从每孔边缘吸除冷培养基，避免触碰伤口。</li>
		<li>使用预冷至 4 °C 的锥形吸头，向每孔加入 50 μL 预先稀释的基质溶液。</li>
		<li>将培养板放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。 
		注：使用预热至 37 °C 的支撑架有助于加快 96 孔板的升温过程。</li>
		<li>从培养箱中取出培养板，根据各处理条件的要求，向每孔加入 100 μL 适配的完全培养基（CM）。</li>
		<li>尽量避免在孔中产生气泡。此处可采用反向移液技术。或者，可用注射器针头去除气泡。</li>
		<li>将培养板放入视频显微镜中适配的支架内。</li>
		<li>为提高图像质量，在首次扫描前让培养板至少预热 15 分钟，以避免培养板底面产生冷凝水。</li>
		<li>使用视频显微镜软件设置扫描程序，在“划痕伤口”扫描模式下对每孔采集一张图像。对于侵袭-迁移实验，最大扫描间隔为 2 小时；若实验目的是生成视频，则推荐最大扫描间隔为 30 分钟。</li>
		<li>实验结束后，仔细清洗划痕装置，并按照生产商指示完成全部四个清洗步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
第3、4和5天
<ol start="4">
	<li>使用视频显微镜分析细胞侵袭。
	<ol>
		<li>重复步骤 2.3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-enhanced+cell+migration%2Finvasion+process%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review.</a> Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).</li>
<li>Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+E-cadherin+and+integrins+in+mesoderm+differentiation+and+migration+at+the+mammalian+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak.</a> Development. 118 (3), Cambridge, England. 829-844 (1993).</li>
<li>Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+cancer+stem%28-like%29+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).</li>
<li>Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases%3A+biologic+activity+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications.</a> J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).</li>
<li>Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+to+mesenchymal+transition+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).</li>
<li>Chen, H. -C. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/922b/e08c04a3ad311a32ca0fc52644681f1bf8b7.pdf">Boyden chamber assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 15-22 (2005).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576902">Wound-healing assay.</a> Meth Mol Biol. 294, Clifton, N.J. 23-29 (2005).</li>
<li>Piaton, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+recommendations+and+best+practice+guidelines+for+May-Gr%C3%BCnwald-Giemsa+staining%3A+literature+review+and+insights+from+the+quality+assurance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Path%22%5BJournal%5D)">Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance.</a> Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance%3A+cancer+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+lett%22%5BJournal%5D)">Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell.</a> Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li>
<li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+ion+irradiation+withstands+cancer+stem+cells%E2%80%99+migration%2Finvasion+process+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+%28HNSCC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC).</a> Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).</li>
<li>Gilormini, M., Wozny, A. -S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Subpopulation+Having+Stem+Cell+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics.</a> J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了两种不同的方法用于研究细胞侵袭和迁移过程。分析该过程对于理解与转移性复发相关的因素至关重要，这种复发可能由一类称为癌症干细胞的癌细胞亚群运动能力增强所导致10,11。
Boyden小室实验是研究细胞侵袭和迁移最常用的技术之一。该方法的一个优点是可重复性好，但实验结果在很大程度上依赖于操作者的经验。细胞计数为手动完成，不同操作者之间可能存在差异。许多关键步骤必须标准化并仔细执行，例如确保使用适合每种细胞系的特定趋化因子和饥饿培养基。使用棉签小心去除上层膜上的细胞也至关重要，以获得最佳结果，并避免出现图2A所示的次优结果。如果该实验用于评估细胞通过三维（3D）多孔膜的运动、侵袭和迁移能力，则无法通过延时成像实验对细胞进行动态追踪。此外，带有多孔膜的商用插入式培养小室通常价格昂贵。
本文介绍的基于视频显微镜的划痕伤口实验是一种评估细胞迁移和侵袭能力...

细胞侵袭和迁移参与了癌细胞的播散过程，这是导致治疗耐药性的主要原因1，并可能在癌症治疗后引起局部区域复发或远处转移2。上皮-间质转化（EMT）是细胞侵袭-迁移的起始过程，其中癌细胞从上皮表型转变为间质表型。E-钙黏蛋白（E-Cadherin）是上皮表型的细胞外标志物3，而N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）表达升高则是间质表型的特征4。细胞迁移还依赖于癌细胞通过基质金属蛋白酶的作用降解细胞外基质（ECM）而实现内在侵袭能力5。
这种侵袭-迁移机制已在多个部位的癌症中被描述，尤其在头颈部癌症中已有报道6。许多研究人员致力于研究癌细胞的迁移和侵袭过程，以更深入地理解癌细胞的播散机制，希望这些知识能够推动新型治疗策略的开发。至关重要的是，这些研究必须采用可靠且可重复的检测方法进行。
体外分析细胞运动能力可能具有挑战性。Boyden 小室实验早在多年前即已开发，被公认为侵袭-迁移分析的标准方法7。然而，该方法耗时较长，且结果常不够准确。另一种检测方法是划痕愈合实验8，该方法通过在细胞单层培养物上制造划痕，并在固定时间间隔内拍摄细胞侵袭和迁移的图像。由于连续两次实验结果之间存在较大变异，该技术曾受到广泛批评。然而，现代技术的应用，尤其是显微镜技术的进步，已显著提高了划痕实验的可重复性。视频显微镜可直接置于培养箱中，实时获取细胞迁移图像。这些设备可记录显微数据，并自动分析随时间变化的伤口区域细胞汇合度。本文旨在介绍 Boyden 小室实验和优化后的划痕实验，并讨论每种方法的优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清金标</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>水溶性氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100 X</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 营养混合物 (1X) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>该溶液必须在使用前立即配制，因其极不稳定</td></tr><tr><td>Z1 库尔特颗粒计数器</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B 细胞系</td><td>由 John Little&amp;rsquo;s 实验室惠赠</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>伤口生成仪</td><td>Essen Bioscience</td><td>4494</td><td>存放于安全干燥处</td></tr><tr><td>96 孔 ImageLock 培养板</td><td>Essen Bioscience</td><td>4379</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 96F 系统配 CoolSink 96F</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox 配 M30 系统</td><td>Essen Bioscience</td><td>1500-0078-A00</td><td></td></tr><tr><td>Boyden 小室插入物</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>包被型 Boyden 小室插入物</td><td>Dominique Dutcher</td><td>354483</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>24 孔配套培养板</td><td>Dominique Dutcher</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel 标准品</td><td>BD BioScience</td><td>BD 354234</td><td>于 -20&amp;deg;C 保存&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RAL 555 染色试剂盒</td><td>RAL Diagnostics</td><td>&amp;nbsp;361550</td><td>存放于安全干燥处</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>33511</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与boyden小室实验的比较

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究致力于探索细胞的迁移与侵袭能力，以揭示癌细胞扩散的机制，从而为开发新的治疗策略提供依据。对这些能力的细胞与分子基础进行分析，已促进了对细胞运动性以及细胞骨架和细胞微环境理化特性的深入理解。多年来，Boyden小室实验和划痕损伤实验一直是研究细胞侵袭与迁移的标准技术。然而，这两种技术均存在局限性：Boyden小室实验操作复杂且耗时较长，而划痕损伤实验的可重复性较低。随着现代技术的发展，尤其是显微成像技术的进步，划痕损伤实验的可重复性已得到显著提升。借助强大的分析系统， &#34;在培养箱内&#34; 视频显微镜可用于对细胞迁移和侵袭进行自动且实时的分析。本文旨在报告并比较两种用于研究细胞侵袭和迁移的实验方法：Boyden小室实验与一种优化的 体外 基于视频显微镜的划痕伤口愈合实验

本文报道了两种不同的细胞侵袭和迁移分析方法。图1展示了Boyden小室实验。将插入物置于含有趋化培养基的配套培养板中，并在CM中接种细胞。膜可以不包被（迁移实验）或进行包被（侵袭实验）。将细胞接种至上方小室的s-CM中，下方小室则加入CM作为趋化剂。在细胞倍增时间之前对细胞进行固定。
图2显示了细胞固定后的Boyden小室膜。图2A显示结果不理想，膜的上侧存在细胞团簇。图2B显示结果理想，细胞已固定并染成蓝色，附着于膜上。
图3展示了划痕...

本研究报道了两种用于分析细胞侵袭和迁移的不同方法：Boyden小室实验和 体外 基于视频显微镜的伤口愈合实验。本文描述了这两种实验的方案，并比较了它们的优缺点。

细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较

肿瘤细胞的侵袭和迁移能力是癌症进展和复发的主要因素。许多研究已探讨了细胞迁移……

本实验的总体目标是报告并比较用于研究细胞侵袭和迁移的两种实验方法：Boyden 小室实验和一种优化的基于体外视频显微镜的划痕伤口实验。这些实验有助于回答侵袭与迁移研究领域中的关键问题，例如选择最相关的方法。这种优化的基于体外视频显微镜的划痕伤口实验的主要优势在于，它能够在不同处理条件下提供可重复且精确的比较。尽管该方法可用于评估细胞迁移和侵袭能力，但也适用于其他研究领域，如伤口愈合或组织再生。在实验第一天前72小时，将SQ20B细胞以每175平方厘米培养瓶中接种2×10⁶个细胞的密度，接种于25毫升培养基中进行培养。在37°C条件下培养，使细胞生长至80%融合度。在消化和细胞计数后的第一天，将细胞以每3毫升培养基中6×10⁵个细胞的密度接种至25平方厘米的培养瓶中，每种实验条件均需设置。将细胞在37°C下培养24小时。次日，通过将每个培养瓶中的培养基更换为3毫升低胎牛血清培养基，对细胞进行饥饿处理。在37摄氏度培养箱中将细胞饥饿处理24小时。在细胞饥饿开始12小时后，准备包被的Boyden小室用于侵袭实验。将每个Boyden小室放入配套培养板中。向每个包被的培养室中加入 500 微升饥饿细胞培养基。在次日，即第三天，使用配套培养板制备趋化因子。向 24 孔配套培养板的每孔中加入 750 微升含 10% FBS、氢化可的松、青霉素和链霉素的完全培养基。将上室转移至预装好培养基的伴生板中，注意避免产生气泡。对于侵袭实验，小心地从每个Boyden小室中移除450微升培养基。在对饥饿处理的SQ20B细胞进行胰酶消化并计数后，将3 × 10⁴个细胞接种至500微升含0.1% BSA的培养基中，最终稀释浓度为每毫升6 × 10⁴个细胞。将Boyden小室置于37摄氏度培养箱中孵育24小时。第4天，从配套培养板中取出每个插入式小室，用棉签小心去除上室中的细胞。随后，按照生产商说明书，使用染色试剂盒对每个插入式小室分别进行固定和染色，以获得瑞氏-吉姆萨染色结果。在第五天进行显微镜分析。将含有插入物的配套培养板置于20倍相差显微镜下，计数膜下表面的每一个迁移细胞。在检测第一天前72小时，将2 × 10⁶个SQ20B细胞接种于175平方厘米培养瓶中的25毫升培养基中，让细胞生长至80%汇合度。消化并计数细胞后的第一天，将SQ20B细胞配制成预稀释液，密度为每毫升4 × 10⁵个细胞。取100 µL细胞悬液加入96孔板的每个孔中，使每孔终浓度为100 µL中含有4 × 10⁴个细胞。将培养板置于37 °C培养箱中，孵育12至16小时，使细胞充分贴壁。第二天，将培养板移至生物安全柜中，使用商用划伤装置进行划伤操作。取下划伤装置的上部，并将其置于清洗槽溶液中。将培养板插入底座板架中，并移除培养板盖。 通过将针块的后部定位销插入底板的后部孔中，来更换针块。按住并保持黑色杠杆向下，同时抬起针块，并在此过程中持续按住黑色杠杆。使用带有适配锥形吸头的移液器，立即从每个孔中移除培养基，注意不要触碰划痕区域。向每个孔中加入100微升预热至37摄氏度的细胞培养基以洗涤细胞。第二次洗涤后，使用带有锥形吸头的移液器吸取细胞培养基。接着，向每个孔中加入100微升针对各处理条件的特定培养基，注意避免在孔中产生气泡。将96孔板放入视频显微镜的适配架中。使用视频显微镜软件，设置扫描程序，每个孔采集一张图像。对于迁移侵袭实验，最长扫描间隔为两小时。如果实验目的是生成视频，则建议采用最长30分钟的时间间隔。使用适用于每种细胞类型的细胞掩模，监测并检查细胞迁移，时间至少24小时，最长可达五天，以分析细胞迁移情况。为获得适用于每种细胞系的细胞掩模，需利用特定的细胞图像集合，通过软件生成细胞处理定义。描记曲线并将数据导出至电子表格，用于分析和比较结果。为进行细胞侵袭实验，以与细胞迁移实验相同的方式接种 SQ20B 细胞，并将 96 孔板放入培养箱中孵育。在实验的第二天，制备细胞外基质。使用前，在4°C条件下解冻基质至少12小时，并确保无可见的聚集物。将微量离心管置于冰上预冷5分钟。使用预冷至4°C的锥形吸头，在预冷的微量离心管中用冷却至4°C的细胞培养基稀释基质，以获得终浓度为300微克/毫升的溶液。将含有预稀释基质的微量离心管置于4°C冰箱中保存。从培养箱中取出96孔板。在通风橱内，按照制造商说明书以及之前演示的方法，使用商用划痕工具制造伤口。使用带有适配锥形吸头的移液器立即从每个孔中移除培养基，并注意不要触碰伤口。用 100 微升预热至 37 摄氏度的细胞培养基将细胞洗涤两次。第二次洗涤后，将培养板置于冰上五分钟，以平衡其温度。从每个孔中移除冷的培养基，注意小心从孔的边缘吸取，避免触碰伤口。使用预先在4摄氏度冷却的锥形吸头，向每孔中加入50 µL预稀释的基质。将培养板放入37 °C培养箱中孵育30分钟。30 分钟后，根据每种处理条件的要求，向每个孔中加入 100 微升的适配细胞培养基。将培养板放入视频显微镜的适配架中。随后按照细胞迁移实验所示的方法设定扫描程序并进行视频显微镜分析。图示为细胞固定后Boyden小室膜的典型结果。次优的膜在膜的上侧存在细胞团簇，导致结果无法解读。相比之下，理想的膜在膜的下侧可见可计数的蓝色染色细胞。划痕伤口实验的最佳结果由以下图像展示，分别为0小时、15小时和30小时的伤口愈合情况。高质量实验的标准包括：伤口呈线性、伤口区域内无细胞碎片、细胞汇合度适宜。如图A所示，90%汇合度是进行伤口愈合实验的最佳细胞密度。图C显示了细胞密度过低的示例，图B则显示了由于细胞沉淀洗涤不充分导致的细胞簇形成。利用视频显微镜软件获得的伤口愈合的图形化表示，展示了四种处理条件下随时间变化的伤口细胞汇合度参数的定量结果。观察发现，联合处理显著降低了细胞迁移。观看本视频后，您应能够充分理解如何评估细胞迁移和侵袭过程。

evaluation-cell-invasion-migration-process-comparison-video

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

细胞侵袭和迁移过程的评价: 视频 Microscope-based 刮伤法与博伊登室法的比较

本文描述了常用于体外研究细胞迁移和侵袭的高通可及性方法。in vitro...

体外 细胞迁移与侵袭实验

研究早期内皮细胞（EEC）迁移对于理解某些疾病的病理生理机制以及潜在发现新的治疗干预策略具有重要意义。以下方案描述了已针对EEC研究进行优化的细胞迁移评估技术。...

暴露于有毒化学物质后内皮细胞迁移能力的评估

本方案详细介绍了一种可定制的方法，用于测量细胞在趋化因子作用下的迁移行为，该方法也可用于测定药物从聚合物基质中扩散的速率。...

一种可定制的细胞迁移测量装置

本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。...

向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案

本文描述了在培养的上皮细胞单层上制造类似切口的损伤，可便捷地模拟伤口愈合过程...

基于显微镜的上皮细胞迁移评估方法 体外 伤口愈合

在此，我们描述了一种检测细胞迁移的方法 体外...

优化的划痕实验方法 体外 使用自动化光学相机检测细胞迁移

本文介绍了活细胞成像技术，用于在不同处理条件下，随时间定量测量胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移和侵袭能力。...

活细胞成像实验用于研究胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移与侵袭

本方案描述了一种集成化方法，可在单一平台上实时研究癌细胞的迁移与侵袭，为细胞运动性及形态学研究提供了一种易于重复且高效省时的选择。...

使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

本文介绍了一种利用原代成纤维细胞进行体外划痕实验的方法，以及一种在小鼠中进行的体内皮肤伤口愈合实验方案。这两种实验均为评估体外和体内伤口愈合的简便方法。...

体外与体内伤口愈合分析的划痕迁移实验与背侧皮肤折叠腔技术

我们提出了一种经济高效的划痕迁移实验方法，为测定细胞迁移提供了一种无需依赖高成本设备的新途径。尽管本实验方案使用了成纤维细胞，但该方法可经调整后用于研究其他细胞类型及影响细胞迁移的因素。...

一种经济高效且可灵活调整的划痕迁移实验方法

本研究介绍了二维（2D）划痕伤口迁移实验和三维（3D）球状体出芽实验，以及相应的下游分析方法，包括RNA提取和免疫细胞化学，这些实验是研究血管生成的适宜方法 体外.

利用划痕伤口迁移实验和球体出芽实验在功能和分子水平上研究血管生成

学习使用博伊登室法和视频显微镜划痕法评估SQ20B细胞的侵袭与迁移过程。本方法为肿瘤转移及组织再生研究提供可重复且精确的比较分析工具。

细胞侵袭与迁移过程的评估：基于视频显微镜的划痕伤口实验与Boyden小室实验的比较

探索更多视频