以显微镜为基础的方法评估上皮细胞迁移过程中的体外创面愈合
January 2nd, 2018
本手稿描述了如何在培养的上皮细胞单分子膜切口样病变, 方便模型伤口愈合在体外, 允许成像的共焦或激光扫描显微镜, 并能提供高质量定量和定性数据, 用于研究细胞行为和参与迁移的机制。
这些上皮细胞培养人工损伤程序的总体目标是从定量和定性的角度研究细胞迁移，从而评估感兴趣的特定治疗对伤口愈合的影响。这种方法可以帮助回答伤口愈合领域的关键问题，因为它们可以精确表征上皮破坏过程中特定迁移过程的作用。这种方法的主要优点是它允许将细胞迁移测量与相关分子标记的行为变化相关联。
这些技术的影响延伸到临床伤口的治疗，因为它为早期药物测试和伤口闭合提供了方便的设置。通常，这种方法将开始，因为难以在伤口中获得一致的再现性与一代。对于人工伤口划痕测定，首先在培养板的每个孔中接种 2 mL 感兴趣的上皮细胞，溶于完全培养基中。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养细胞 2 到 3 天，直到 100% 汇合。当细胞准备好后，用新鲜的无血清培养基洗涤细胞两次，然后在新鲜的无血清培养基中培养 24 小时。第二天，将板放在无菌工作区域，并将无菌微量移液器吸头的窄端拖过每个孔的底部两次，以产生十字形伤口。
通过施加恒定、牢固的压力，同时沿上皮表面平稳移动尖端，可以实现一致的伤口间隙。过大的压力会使尖端变形，导致伤口半径不规则。轻轻去除上清液以丢弃分离的细胞，并小心地向孔中加入新鲜的无血清培养基。
在连接到电荷耦合器件相机的倒置相差显微镜中，将显微镜视野的边缘与划痕的相邻交叉点对齐，以获得每个孔中划痕间隙的最多四个处理前参考图像。获取所有图像后，用新鲜培养基替换指定处理孔中的培养基，补充选定的感兴趣处理，然后将板放回细胞培养箱。当至少一种情况达到约 90% 划痕间隙闭合时，用 1 毫升 4% 福尔马林的 PBS 溶液轻轻替换上清液，在室温下孵育 15 分钟。
然后用 PBS 轻轻洗涤细胞至少 3 次，以去除任何多余的福尔马林，并像刚才所示的那样对孔进行成像，在抓挠后捕获的原始参考区域中使用相同的成像参数。要使用适当的图像处理软件分析图像，请打开录制的、感兴趣的预处理图像，然后在 Image 菜单下，将图像类型设置为 8 位。在 Process 菜单下，选择 Filters 子菜单并应用 Variance 筛选。
在 图像 菜单下，打开 调整 子菜单，并将 阈值 设置为 黑色 和 白色。在 Process 菜单中，选择 Binary 子菜单并应用 Fill Holes。在 Analyze 菜单下，选择 Set Measurements 并激活 Area。
然后绘制可测量区域，沿着迁移的边缘轮廓划定间隙。在 Analyze 菜单下，选择 Analyze Particles 并记录绘制区域表面的总面积值。要将每组单独样品的绝对迁移量化为间隙表面测量值之间的差异，请将处理前和处理后的总间隙表面积值导出到电子表格中，并绘制量化输出。
对于人工迁移前沿测定，在无菌条件下，将一层最多 33 个灭菌的圆形盖玻片添加到空的 10 厘米培养板中。当板表面完全覆盖时，在培养两到三天后，以允许 100% 汇合的浓度轻轻接种感兴趣的上皮细胞。如有必要，用无菌微量移液器吸头轻轻压下盖板，以防止漂浮。
当细胞达到汇合时，用无血清培养基替换上清液，再培养 24 小时。然后，使用无菌镊子小心地将一个盖玻片转移到含有新鲜无血清培养基的 10 厘米新板中，注意沿其外围固定盖玻片。要创建人工伤口，请在每个盖玻片上来回拖动消毒的剃须刀片，在每个细胞培养物的中心上形成 3 到 4 毫米的横向线，以完全去除中央单层条。
伤口时，注意将剃须刀片边缘重重地放在盖玻片表面上，以防止不规则的边缘形状和松动的上皮部分的产生。将最多四个伤口盖玻片（细胞面朝上）转移到含有至少 2 mL 无血清培养基的 6 孔板的各个孔中，并用新鲜的无血清培养基轻轻洗涤每个孔两次，以去除任何分离的细胞。丢弃所有分离的细胞后，用补充有目标处理的新鲜培养基轻轻更换洗涤培养基，并将板放入细胞培养箱中。
在适当的实验期结束时，如刚才所示，用 PBS 中的 4% 福尔马林固定细胞，并用适当的目标荧光偶联抗体对细胞进行染色。然后根据感兴趣的实验参数，通过荧光显微镜对迁移前缘发生的结构变化进行成像。在本实验中，用表皮生长因子（一种众所周知的上皮细胞增殖和迁移诱导剂）治疗前后测量伤口间隙。
然后将绝对迁移计算为处理前和处理后间隙表面积之间的差值。表皮生长因子处理增强了细胞骨架动力学，如在这些激光扫描显微镜图像中观察到的对照和生长因子刺激细胞的 F-肌动蛋白染色。此外，观察到 c-Jun 过表达，在与迁移前沿相邻的细胞中，蛋白质的表达明显增加。
在尝试此过程时，重要的是要记住检查伤口边缘的完整性，是否存在可能破坏迁移定量的上皮细胞瓣。看完这个视频后，你应该对如何定量和定性地评估
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概述
本文描述了一种使用培养上皮细胞单层上切口样损伤来模拟体外伤口愈合的方法。该方法允许进行成像，并提供了研究细胞行为和迁移机制的高质量数据。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 伤口愈合
- 细胞迁移
背景
- 伤口愈合是一个关键的生物过程。
- 理解细胞迁移对于开发治疗方法至关重要。
- 人工造伤技术可以提供对愈合机制的洞察。
- 在伤口模型中获得一致的可重复性通常具有挑战性。
研究目的
- 从定量和定性的角度研究细胞迁移。
- 评估特定治疗对伤口愈合的影响。
- 表征上皮破坏期间迁移过程的作用。
使用的方法
- 在上皮细胞单层上创建切口样损伤。
- 使用共聚焦或激光扫描显微镜进行成像。
- 将细胞迁移测量与分子标记行为相关联。
- 设置允许早期药物测试和伤口愈合评估。
主要结果
- 表征伤口愈合过程中的迁移过程。
- 对细胞在治疗响应中的行为的定量数据。
- 对临床伤口治疗的影响的洞察。
- 展示该方法的可重复性和可靠性。
结论
- 人工造伤方法对于研究上皮细胞迁移是有效的。
- 这种方法可以增进对伤口愈合机制的理解。
- 在伤口治疗的早期药物测试中的潜在应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing epithelial cell migration in vitro provides a scalable, reproducible platform for early-stage wound healing research, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates. Quantitative and qualitative readouts from scratch and migration front assays support target validation by linking cellular behavior to molecular marker changes. This approach improves predictive confidence in preclinical models by correlating migration dynamics with treatment effects, informing go/no-go decisions in wound therapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating cell migratory measurements with changes in relevant molecular markers.
- Operational Value: Provides quantitative gap closure data and qualitative front-edge imaging to de-risk targets involved in epithelial repair pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible wound models suitable for high-content screening of compounds affecting cell migration.
- Operational Value: Supports assay scalability through defined protocols for scratch and migration front generation, enabling cross-well and cross-plate consistency.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by capturing migration dynamics that reflect in vivo wound healing processes.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment, such as c-Jun or F-Actin reorganization, to validate mechanism of action in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification in wound healing programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking migration metrics to molecular marker behavior, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Screening: Delivers quantitative gap closure measurements and qualitative front-edge imaging, enabling reliable compound evaluation in migration-focused screens.
- Analytics: Provides quantifiable outputs (gap surface area differences) and imaging-based readouts that allow statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through fluorescence imaging of structural changes at the migrating front, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for assessing epithelial migration across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through correlation of migration dynamics with molecular marker changes, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined wounding protocols and imaging parameters, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked efficacy data, lowering late-stage biological risk in wound therapy development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative migration inhibition or stimulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture techniques, microscopy (phase contrast and fluorescence), and image analysis software for accurate wound quantification.
- Dependent on sterile tissue culture equipment, microscopes with CCD or fluorescence capabilities, and tools for precise wound generation (micropipette tips, razor blades).
- Necessitates standardization of wounding pressure, timing, and imaging fields across users and labs to ensure data comparability.
- Adaptation considerations include epithelial cell line variability, confluence requirements, and serum-free conditions to avoid confounding proliferation effects.
- Practical limitations include potential wound edge irregularities from excessive pressure or improper tool handling, which can disrupt migration quantification and require manual exclusion.
