向上迁移：一种简单灵活的体外三维侵袭实验方案
2018年3月12日
本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验方法，可用于在三维环境中定量评估细胞的迁移和侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该实验适用于稀有和/或敏感细胞。
本侵袭实验的总体目标是在三维环境中定量评估稀有且敏感细胞的迁移和侵袭能力，同时不使细胞脱离其微环境。该方法有助于回答癌症研究领域中关于敏感细胞或罕见事件（如癌细胞融合产物）侵袭能力的关键问题。该技术的主要优势在于，可在三维环境下于细胞原有的微环境中对其进行分析。
该技术的意义延伸至癌症治疗领域，因为它可用于筛选能够抑制癌细胞侵袭和转移的药理学试剂。对该技术进行直观演示至关重要。胶原蛋白混合物的温度和pH值会影响其聚合，操作粗暴则会导致凝胶脱落。
首先，向一个带有10毫米玻璃底孔的35毫米培养皿中加入1毫升1摩尔的盐酸，以降低玻璃的疏水性。15分钟后，每次用1毫升PBS洗涤培养皿两次，随后用1毫升70%乙醇洗涤一次。接下来，用1毫升适用于目标细胞的培养基冲洗培养皿。
将目标细胞接种到培养板中，然后将培养板放入细胞培养箱中。当细胞达到100%融合度时，在冰上一个微量离心管中加入114.5 µL新配制的大鼠尾胶原蛋白、16.6 µL 10× DMEM培养基以及33.1 µL添加了目标趋化因子的培养液，混合均匀。
用14微升碳酸氢钠中和胶原混合物，并在细胞上覆盖80微升凝胶。将胶原置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育30分钟，使其聚合。随后，在凝胶上层加入2毫升含2%血清的减量细胞培养基，小心地将细胞放回培养箱中，进行相应实验所需的时间，注意避免扰动胶原凝胶。
孵育结束后，轻轻移除培养基，并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）小心冲洗凝胶。用一毫升4%多聚甲醛固定细胞15分钟，随后每次用一毫升PBS洗涤，共洗涤两次。然后在室温下用DAPI溶液对细胞染色20分钟，通过共聚焦显微镜观察体外三维胶原侵袭情况。
此处展示了乳腺癌细胞系及乳腺癌细胞融合产物在趋化因子作用下，于48小时迁移期内侵袭胶原凝胶的定量结果。值得注意的是，稀有的乳腺癌细胞融合产物在趋化因子刺激下向胶原凝胶内的迁移现象也被观察到。在整个胶原凝胶实验过程中，细胞保持良好的健康状态，这体现在凝胶聚合48小时后细胞数量稳定且形态正常。
这种垂直胶原凝胶实验还可通过Z轴系列成像来分析细胞侵袭过程中的迁移动力学，同时原位捕获迁移细胞的形态。在进行该操作时，需注意使用与显微镜兼容的培养皿。在完成该操作后，可引入其他变量，例如调整胶原蛋白的浓度强度或使用不同的趋化因子，以分别探究细胞外基质（ECM）相互作用对细胞侵袭的影响，或不同趋化因子对细胞侵袭的作用。
该技术问世后，为生物学和癌症领域的研究人员提供了筛选转移抑制药物以及在体内探索所有炎症反应中伤口愈合过程的新途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在三维环境中评估稀有且敏感细胞的迁移与侵袭能力，同时避免因微环境干扰而对细胞造成形变。请务必注意，操作人源癌细胞、盐酸、多聚甲醛和DAPI时具有极高危险性，因此在进行本实验时，必须采取相应防护措施，例如使用二级生物安全柜和通风橱。
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概述
本方案描述了一种倒置垂直侵袭实验，可在三维环境中定量评估稀有且敏感细胞的迁移与侵袭能力，同时保持细胞微环境的完整性。该方法在癌症研究中具有重要意义。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞迁移
- 癌症研究
- 侵袭实验
背景
- 该检测方法可用于分析细胞在其原始微环境中的状态。
- 该方法专为稀有且敏感的细胞设计。
- 理解细胞侵袭过程对于癌症治疗策略的开发至关重要。
- 该技术的可视化演示对于正确操作至关重要。
研究目的
- 定量分析细胞的迁移和侵袭能力。
- 探究敏感细胞的侵袭能力。
- 筛选抑制癌细胞侵袭和转移的药理学制剂。
使用的方法
- 倒置垂直侵袭实验
- 三维细胞培养
- 细胞微环境中的细胞分析
- 温度和pH对胶原蛋白聚合影响的评估
主要结果
- 展示了在三维环境中分析细胞行为的能力。
- 强调了维持细胞微环境的重要性。
- 提供了关于癌细胞侵袭能力的深入见解。
- 显示出在筛选治疗药物方面的潜力。
结论
- 该检测方法是癌症研究中的重要工具。
- 它可保护敏感细胞的微环境。
- 有助于开发靶向癌症侵袭和转移的治疗方法。
常见问题
执行层面的行业相关性
该检测方法使生物制药研发团队能够在生理相关的三维微环境中评估稀有且敏感细胞模型的侵袭潜能，同时不破坏细胞与细胞外基质（ECM）的天然相互作用。通过维持细胞原有的微环境，该方法有助于对与转移相关的靶点进行机制性风险评估，并提高早期靶点验证的预测可靠性。该技术解决了临床前筛选中的一个关键瓶颈，即传统检测方法会破坏微环境的完整性，从而增强了从发现到先导化合物优化阶段的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在天然微环境条件下评估罕见细胞或融合来源细胞模型的侵袭性，能够验证治疗假设。
- 操作价值：减少因细胞位移引起的人为变异，提高不同实验间侵袭表型的可重复性。
- 预测价值：在三维环境中将分子扰动与功能性侵袭结果关联，支持靶点风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成标准化的定量侵袭性指标，可与高内涵成像和自动化分析工作流程兼容。
- 可重复性：通过在检测建立过程中避免对细胞层进行机械性破坏，最大限度减少孔间变异。
- 可扩展性：适用于不同浓度的胶原蛋白和趋化因子，可用于转移抑制剂的构效关系（SAR）研究。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：利用成纤维细胞-上皮细胞杂交模型模拟人类癌症侵袭过程，反映体内间质-肿瘤相互作用。
- 转化连续性：通过保留对侵袭行为至关重要的微环境信号，将体外研究发现与临床前验证有效衔接。
- 风险调整决策：提供功能性侵袭数据，有助于优先选择或化合物筛选，降低因微环境建模不足导致后期研发失败的风险。
流程与工作流整合
该检测方法适用于从早期靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，为与转移相关的研究项目提供了替代 Boyden 小室或 transwell 系统的、可保持微环境特征的方案。
- 发现生物学：通过在生理胶原凝胶中对细胞迁移进行实时z轴层析成像，支持对侵袭通路的假设驱动型验证。
- 筛选：提供适用于化合物文库筛选的侵袭终点数据，尤其适用于靶向细胞外基质重塑或趋化信号通路的药物筛选。
- 分析：可对侵袭细胞数量进行定量，并开展形态计量学分析，为结构-功能相关性研究提供多参数读数。
- 转化研究：利用间充质干细胞-癌细胞杂交模型模拟基质介导的侵袭过程，支持与生物标志物关联的机制研究。
- 企业级复用：适用于多种癌症类型及基质细胞共培养体系，可在转移和伤口愈合研究项目中实现平台的重复利用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少微环境破坏导致的假阳性，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过标准化的凝胶聚合和覆盖层操作流程，增强检测的稳健性。
- 战略价值：在研发早期提供具有生理相关性的侵袭数据，提升“推进/终止”决策的质量。
- 项目组合影响：基于功能性三维侵袭谱，实现转移抑制剂的风险分层推进。
实施注意事项
- 需要具备三维细胞培养和共聚焦显微镜技术的专业知识，以实现准确的侵袭定量。
- 依赖于胶原蛋白制备过程中精确的温度和pH控制，以确保凝胶聚合的一致性。
- 需要标准化的趋化因子剂量和低血清培养基条件，以获得可重复的趋化反应。
- 若改用其他细胞外基质蛋白（如Matrigel、纤维蛋白），可能需要优化凝胶动力学和浓度。
- 仅适用于能够向上穿过凝胶覆盖层进行侵袭的贴壁或半贴壁细胞；非贴壁悬浮细胞可能需要进行方法修改。
