用数字全息显微镜 (DHM) 定量化低浓度微生物

本实验的总体目标是展示使用数字全息显微镜检测极低水平的微生物。该技术比传统的光学显微镜更灵敏，并提供有关细菌行为的实时信息。这种方法可以帮助回答生物学和宇宙学领域的关键问题，例如在冰冷的卫星上寻找水中的病原生物或太阳系内的生命。

该技术的主要优点是 DHM 是一种体积技术，这意味着我们可以立即捕获样品的三维信息，而无需物理重新聚焦。由于能够检测低细菌浓度，该技术的意义延伸到血流或脑脊液感染的诊断。要开始此过程，请在实验当天对细菌主培养物进行分光光度法读数，预计读数在 0.6 至 0.7 之间。

然后取主培养物样品，并使用 Petroff-Hausser 计数室直接对细胞进行计数，以计数活细胞和死细胞。用微量移液管将 10 微升未稀释的培养物样品转移到腔室中。使用相差在高干物镜显微镜下成像。

随后，将细菌计数至少 20 个方块并平均。将浓度计算为 20 平方乘以稀释因子的平均值。要仅计数活细胞，请将 20 微升细菌溶液转移到另一个孔中，并用 180 微升盐水稀释，用无菌 0.9% 盐水溶液对每个选定的细菌样品进行连续稀释。

重复该过程，直到最低浓度约为 10 比 3 个细胞/毫升。接下来，从至少两种稀释液中取出 100 微升样品，并将其接种在适当的固体培养基板上。用无菌撒布机铺展它们，并对每种稀释至少重复进行三次。

之后，将它们在适当的温度下孵育过夜或直到菌落生长。然后数菌落。计算菌落形成单位并在重复中平均。

在此过程中，对 DHM 的主培养物进行连续稀释，并在溶原肉汤培养基板上对 CFU 进行 DHM 后计数。将细菌稀释到 25 毫升基本培养基中，该培养基将促进运动但抑制细胞分裂，以便细胞浓度在实验过程中不会发生明显变化。要录制 DHM 视频，请使用无菌注射器吸入约 10 毫升感兴趣的稀释液。

然后使用无菌接头和管道将注射器连接到 DHM 样品室。使用注射泵将样品从注射器中连续流过样品室。当样品流经样品室时，以适当的帧速率连续采集全息图。

留出足够的时间让整个 10 mL 样品流过 DHM。为确保细菌在实验过程中不会生长或死亡，请在 DHM 图像捕获后用 100 微升的废培养基接种富集培养基板，方法是用无菌撒布机涂抹。然后在适当的温度下孵育 24 小时，然后再对菌落进行计数。

准确的细胞计数对于定量确定检测限至关重要。重要的是使用校准的微量移液器非常小心地进行所有稀释，并通过光密度、电镀和在 Petroff-Hausser 室中直接计数来确认所有计数。要分析获取的全息图视频中细菌存在的数据，请先将图像转换为 32 位格式，以执行中等减去筛选。

然后计算中值像素值。最后，从每个相应的像素中减去这个中值，以消除全息图中的静止伪影。之后，手动计算可见区域环和聚焦单元格的数量。

每个全息影像系列都将附带一个时间戳文件。使用时间戳文件计算捕获图像时泵送的样品总量。随后，通过将检测到的细胞总数除以成像的样品总体积来计算细胞密度。

平均 5 到 10 帧以获得准确的统计数据。此图显示了基于 365 微米 x 365 微米 x 1 毫米的样品体积的每个视场的预测细胞。对于每个视场细胞数低于 1 的浓度，需要多张图像才能实现检测。

这是粘质沙雷氏菌培养物的 DHM 全息图序列，每毫升 2， 100 个细胞，通过平板计数测量。该序列大约每 1 到 2 秒显示一个单元格，这与预测非常吻合。这是粘质沙雷氏菌培养物的另一个 DHM 全息图序列，每毫升 620 个细胞，通过平板计数测量。

此序列大约每 6 到 7 秒显示一个单元格。使用数字全息显微镜对细胞进行成像时，请记住使用过滤器灭菌技术来准备所有溶液。这将避免将颗粒物引入仪器。

在尝试此程序时，请务必记住准备健康的细胞培养物，并准备好额外的生长培养基、板和运动培养基。按照此程序，可以执行其他方法（如荧光染色）来回答其他问题，例如活细胞与死细胞的百分比。经过开发，这项技术为微生物学领域的研究人员探索培养细胞和环境样品中的三维运动铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何使用全息显微镜对细菌进行计数并使用其他计数技术验证结果有很好的了解。不要忘记，使用细菌培养物可能非常危险。在生长和处理活体生物体时，应始终采取适当的生物安全预防措施。