高分辨率显微镜（HREM） - 用于处理和可视化有机材料的简单和可靠的协议

该程序的总体目标是生成有机材料的数字体积数据。例如，生物医学模式生物的胚胎和胚胎组织，从成年动物和人类身上收获的组织块，包括皮肤或肌肉活检以及未涂布纸和皮肤替代品等材料。HREM 帮助回答医学和生物医学研究领域的基本问题。

它允许对器官和组织进行三维分析和可视化，例如，转基因小鼠胚胎或经过处理的雏鸡胚胎。它还允许分析癌症模型以及从人类或动物组织中提取的活检。HREM 的主要优点是它提供了一种简单的方法来生成接近组织学质量的图像堆栈。

这项技术的含义延伸到通过使用动物模型研究伤口愈合，以及旋转和修复人类的组织病理。演示该程序的是 BMR Marlene Rodler 和 Johannes Gunther。均来自维也纳医科大学解剖学系。

从固定的胚胎或不大于 5 x 5 x 5 立方毫升的胚胎组织开始。去除固定剂。并添加 PBS。

在 4 摄氏度下洗涤，持续摇晃 24 小时。将 70% 乙醇添加到含有组织的试管中，并将样品放在 4 摄氏度的旋转器上。2 到 3 小时后，继续在浓度递增的乙醇溶液中对样品进行脱水，每次 2 到 3 小时。

当样品脱水时，在烧杯中加入 0.3125 克过氧化苯甲酰和 0.1 克 ESN 到 25 毫升溶液 A 中，制备浸润溶液。在 4 摄氏度的磁力搅拌板上搅拌 2 到 3 小时，直到 ESN 和催化剂完全溶解。将样品放入浸润溶液中。

并在 4 摄氏度下摇动或旋转样品 12 至 24 小时。首先准备嵌入解决方案。将 1 毫升或溶液 B 添加到 25 毫升新鲜浸润溶液中。

准备好成型杯托盘后，用嵌入溶液填充模具的深腔。用勺子将样品转移到模具中。确保样品完全被包埋液覆盖，以避免滞留空气。

使用针或镊子将样品定位在模具内。在包埋过程中优化样品的方向并标记其在模块表面上的精确位置至关重要。这样，可以保持感兴趣的区域较小，并且可以使用具有最高放大倍率的物镜。

一旦包埋液开始变得粘稠，就将块架放在模具顶部，并通过块架的中心孔添加包埋液，直到包埋液升高到块架底部上方 1 到 2 毫米。用液体石蜡覆盖成型杯托盘，然后等到它变硬后再移动。将密封的成型杯托盘在室温下存放一到两天，让块完成聚合。

对于聚合后处理，将带有聚合块的成型杯托盘放入标准实验室烘箱中，并在 70 至 80 摄氏度下烘烤至少一到两天。从模具中取出块。然后通过将白光斜向块状表面来识别视野。

使用块状表面上的黑色标记跟踪样品的阴影。将树脂块安装在切片机上，并带有指示的视野，并将块支架移动到其停止位置。启动数码相机和数据生成软件并获取实时图像。

选择具有适当放大倍率的物镜以覆盖感兴趣区域。上下移动光学元件和切片机，直到感兴趣区域与计算机屏幕上显示的视野相匹配。对块进行切片，直到样品的第一个结构变得可见。

移动切片机以将块表面排列在光学元件的焦平面中。选择 0.5 到 5 微米之间的截面厚度。然后按照制造商的说明设置软件后，启动软件并开始数据采集。

该 HREM 切片图像显示了在胚胎第 9.5 天收获的小鼠胚胎的矢状切片。这个体积渲染的 3D 模型显示了这个胚胎的表面。该图像通过在胚胎第 15.5 天收获的小鼠胚胎颈部的体积渲染模型显示了虚拟矢状切片。

表面模型在雏鸡胚胎的所有组织的体积渲染中突出了心血管系统的管腔，这是发育中的汉堡汉密尔顿第 18 阶段。该图像显示了通过人体神经的 HREM 切片。嵌体放大了此图像的部分。

该图像显示了通过猪肝的 HREM 切片图像的一部分。该图像显示了从人类拇指垫采集的活检的体积渲染 3D 模型。该图像显示了通过 HREM 数据在虚拟切除前的真皮动脉、静脉和神经的表面渲染模型。

此动画显示了人类拇指垫的厚皮肤的体积渲染模型。不同的阈值，因此不同的真皮结构，例如血管、神经纤维、汗腺和汗腺导管。HREM 允许快速可视化纤维材料的结构。

此图像显示了原生真皮替代材料的体积渲染模型。此动画显示了真皮替代材料的体积渲染模型。注意纤维的不同形状和口径。

样品必须脱水、浸润并包埋在树脂中，因此整个过程可能需要长达几天的时间，但仅包括两到三个小时的作工作，包括制备溶液、更换溶液等。数据生成本身在 HREM 设备上是完全自动化的，可以在 2 到 3 小时内生成 1000 张图像。经过开发，HREM 为发育生物学领域的研究人员对突变小鼠胚胎的表型进行精确评分铺平了道路。

一个例子是破译发育障碍的机制或 DMDD 项目，其中 HREM 用于表型分析，以未知的细节对胚胎致命的小鼠胚胎进行表型分析。事实证明，HREM 也是位置光显微镜的绝佳替代品，用于检查人体组织样本中的血管、神经或纤维结构。