高分辨率表层显微成像技术（HREM）——用于有机材料处理与可视化的简易且稳健的实验方案

本实验的总体目标是生成有机材料的数字体数据。示例包括生物医学模式生物的胚胎及胚胎组织、从成年动物和人体获取的组织块（包括皮肤或肌肉活检样本），以及未涂层纸张和皮肤替代物等材料。高分辨率显微成像技术（HREM）有助于回答医学和生物医学研究领域的基本科学问题。

它能够对基因修饰小鼠胚胎或经处理的鸡胚等样本的器官和组织进行三维分析与可视化。同时，也可用于癌症模型以及取自人或动物组织的活检样本的分析。HREM 的主要优势在于，它能够简便地生成接近组织学质量的连续图像序列。

该技术的应用包括利用动物模型研究伤口愈合，以及研究人类组织的损伤与修复病理。本次操作演示由维也纳医科大学解剖学系的 BMR Marlene Rodler 和 Johannes Gunther 完成。

以不超过 5 × 5 × 5 立方毫米的固定胚胎或胚胎组织开始。去除固定液，并加入 PBS。

在4 °C条件下持续振荡洗涤24小时。向含有组织的离心管中加入70%乙醇，并将样品置于4 °C旋转仪上。两至三小时后，继续用浓度递增的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每次两至三小时。

在样品脱水的同时，向烧杯中的25毫升溶液A中加入0.3125克过氧化苯甲酰和0.1克ESN，配制浸渍溶液。在4°C的磁力搅拌器上搅拌2至3小时，直至ESN和催化剂完全溶解。将样品放入浸渍溶液中。

在 4 °C 条件下将样品轻轻摇动或旋转 12 至 24 小时。首先准备包埋溶液，将 1 mL 溶液 B 加入 25 mL 新鲜渗透溶液中。

制备好包埋杯托盘后，将包埋液填充至模具的深腔中。使用勺子将样品转移至模具内。确保样品完全被包埋液覆盖，以避免产生气泡。

使用针或镊子在模具内调整样本的方向。包埋过程中优化样本的朝向，并在包埋块表面标记其精确位置至关重要。这样可使目标区域保持较小，从而能够使用尽可能高倍的物镜进行观察。

一旦包埋液开始变黏稠，立即将包埋模具架放在模具上，并通过模具架的中央孔加入包埋液，直至液面升至模具架底部上方1至2毫米处。用液体石蜡覆盖包埋杯托盘以密封，待其完全凝固后方可移动。将密封好的包埋杯托盘于室温下静置1至2天，使组织块完成聚合。

进行聚合后处理时，将含有已聚合块的模具杯托盘放入标准实验室烘箱中，在70至80摄氏度下烘烤至少一至两天。从模具中取出组织块，然后通过将白光斜射至组织块表面来确定视野。

用黑色记号笔在包埋块表面描出样品的阴影。将带有指定视野的树脂包埋块安装到切片机上，并移动块夹至其停止位置。启动数字相机和数据采集软件，获取实时图像。

选择适当放大倍数的物镜以覆盖目标区域。上下移动光学部件，同时横向移动切片机，直至目标区域与计算机屏幕上显示的视野重合。切削样本块，直到样本的首个结构可见为止。

移动切片机，使样品块表面位于光学系统的焦平面上。选择0.5至5微米之间的切片厚度。然后按照制造商的说明设置软件，启动软件并开始数据采集。

该HREM切片图像显示了在胚胎第9.5天获取的小鼠胚胎的矢状切面。此体积渲染的3D模型展示了该胚胎的表面。该图像显示了在胚胎第15.5天获取的小鼠胚胎颈部体积渲染模型的虚拟矢状切面。

表面模型突显了鸡胚所有组织的容积渲染中循环系统的管腔，该鸡胚处于发育的哈姆布格尔-汉密尔顿18期。此图像显示了通过人类神经的高分辨率表型成像切片。插图放大了该图像的局部区域。

该图像显示了通过猪肝脏的高分辨率表型成像（HREM）切片图像的一部分。该图像展示了从人拇指指腹获取的活检样本的体积渲染三维模型。该图像显示了基于HREM数据进行虚拟切除前方的真皮动脉、静脉和神经的表面渲染模型。

该动画展示了人类拇指指腹厚皮肤的容积渲染模型。通过不同的阈值，可以观察到不同的真皮结构，例如血管、神经纤维、汗腺以及汗腺导管。高分辨率表皮成像技术（HREM）能够快速可视化纤维性材料的结构。

此图像显示了天然真皮替代材料的体渲染模型。该动画展示了真皮替代材料的体渲染模型。请注意纤维的不同形态和直径。

样品必须经过脱水、渗透和树脂包埋，因此整个过程可能需要数天时间，但实际操作工作（如配制溶液、更换溶液等）仅需两到三个小时。数据采集本身在HREM仪器上完全自动化进行，可在两到三个小时内生成1000张图像。HREM技术问世后，为发育生物学领域的研究人员精确评估突变小鼠胚胎表型提供了有力工具。

一个例子是发育障碍或发育障碍机制解析（DMDD）项目，该项目利用高分辨率表型成像技术（HREM）对尚不明确的胚胎致死性小鼠胚胎进行表型分析。研究发现，HREM 还可作为位置光显微镜的优良替代方法，用于检测人组织样本中的血管、神经或纤维结构。