Name: 定量的光学显微镜:测量细胞生物物理特性与标准光学显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: 学习使用标准光学显微镜和MATLAB图像处理技术定量测量活细胞的质量、体积和密度。该方法无需固定或染色，结合明场和微分干涉对比成像，为细胞生物学研究提供非侵入性分析工具。

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本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助（K.G.P. 和 O.J.T.M. 获 U54CA143906 项目资助，O.J.T.M. 获 R01HL101972 项目资助）以及俄勒冈医学研究基金会早期临床研究者奖（K.G.P.）。O.J.T.M. 是美国心脏协会认定的研究员（13EIA12630000）。我们感谢奈特癌症研究所的 Eric Anderson 博士为本研究准备的细胞样本。

1. 显微镜规格
为了正确进行成像，显微镜应具备以下规格：
<ol>
	<li>具备微分干涉差（DIC）和明场（BF）成像功能。</li>
	<li>具备计算机控制的Z轴移动功能。</li>
	<li>具备可调节的孔径光阑，以调节聚光镜的数值孔径。需要带有分级刻度或电子读数的光阑，以确定数值孔径的具体数值。数值孔径应能从NIQPM所需的0.1调节至HTDIC所需的0.9（或更高）。</li>
	<li>显微镜应配备窄带滤光片，用于明场成像。该滤光片用于固定折射率增量（refractive increment），该参数为波长依赖性因子，用于在NIQP中将相位信息转换为质量密度。</li>
</ol>
2. 差分干涉对比（DIC）Z轴层析成像采集
<ol>
	<li>打开 SlideBook 软件，并为图像采集创建一个新的载片。</li>
	<li>接着，打开对焦窗口。在滤光片组部分，选择DIC。在显微镜选项卡的聚光镜部分，将光圈滑块调整至最右侧位置（完全打开）。这将提供高数值孔径的照明，增强样本的光学切片效果。</li>
	<li>使用 DIC 物镜对样本进行对焦。调节卤素灯强度，直至样本清晰可见。为确保相机未发生饱和，请在对焦窗口中选择相机选项卡，并检查像素强度的直方图是否处于相机的动态范围之内。</li>
	<li>打开图像采集窗口。在采集类型部分，勾选3D选项。在3D 采集部分，选择围绕中心范围和返回当前位置选项，并设定 Z 方向范围、平面数量和步进大小。Z 方向范围应涵盖整个样本。</li>
	<li>在图像采集窗口的滤光片组部分，勾选DIC选项并设定曝光时间。在图像信息部分命名图像（可选），然后点击开始以启动成像。</li>
</ol>
3. 明场（BF）Z轴层扫采集
<ol>
	<li>显微镜完成样品的DIC Z轴扫描后，打开对焦窗口并选择 打开 在……之下 滤光片组 部分。调整 孔径 将滑块移至最左侧位置（完全关闭），以提供低数值孔径（NA）照明。</li>
	<li>将显微镜光路滤光片更换为绿色。调节卤素灯强度，直至样本可见。通过选择合适的参数确保相机无信号饱和 相机 在“聚焦窗口”中点击标签，并检查像素强度直方图是否处于指定范围内。</li>
	<li>打开图像采集窗口。 3D 捕获 DIC Z层扫描的设置将被显示。</li>
	<li>在 滤光片组 图像采集窗口的该部分，检查 公开 盒中并指定曝光时间。在 图像信息 切片，命名图像（可选），并选择 开始 开始Z轴层扫图像采集。</li>
</ol>
4. 导出Z轴层叠图像
<ol>
	<li>打开Z轴堆栈图像。将视图调整为100%。调节像素值的直方图，使其显示范围介于0与相机的最大像素值之间（12位相机为4,095，16位相机为65,535）。</li>
	<li>选择 查看 &#62; 导出 &#62; TIFF 系列这将把Z轴序列导出为一系列TIFF图像（每个Z平面一张）。将TIFF序列保存到一个单独的文件夹中，文件夹名称末尾需带有下划线（即&#160;“DIC 叠层 1_”）。对每个 DIC 或明场 Z 叠层重复此操作。</li>
</ol>
5. 体积测量
<ol>
	<li>打开名为“JoVE_HTDIC_v1.m”的HTDIC MATLAB程序。</li>
	<li>在 HTDIC 程序的第 0 节中，更新依赖目录变量。从资源管理器（PC）中复制包含 hilbert_transform_dic.m 和 sobel_edge_detect.m 文件的目录路径，并粘贴到“dependencies_directory =”后单引号之间。执行 JoVE_HTDIC_v1.m 程序的第 0 节。</li>
	<li>在第1节中，更新“images_directory”。再次将包含以 .tif 格式保存的离焦图像的目录复制粘贴到单引号之间。仅运行第1节一次。</li>
	<li>用于希尔伯特变换的图像对齐与旋转 运行代码的第2节。此时将弹出一个名为“Define HTDIC Parameters”的对话框。用户需要输入五个参数：样品DIC图像清晰对焦的焦平面编号、横向分辨率（图像中的单位为μm/像素）、轴向分辨率（若以0.1 μm轴向步长采集图像，则该值为0.1）、执行希尔伯特变换所需的DIC图像旋转角度，典型值为45和-135。最后，输入感兴趣区域的大小，该参数定义后续出现的方框边长，典型值为400。点击 好的.</li>
	<li>指定焦平面编号的微分干涉差（DIC）焦平面图像将显示一个蓝色方框。将该方框定位在目标特征上方， 例如 一个细胞。该方框不必为正方形。将方框定位至目标区域后，双击框内区域。</li>
	<li>现在将出现另一幅图像：该图像包含上一步所选感兴趣区域的裁剪和旋转版本。图像的对比度应调整至暗部特征位于左侧，亮部特征位于右侧。将蓝色框拖动至感兴趣区域，并根据需要调整其形状。</li>
	<li>第3部分为z轴堆栈立方体生成掩膜。可选的掩膜类型有两种：矩形掩膜，用于在细胞周围创建矩形区域；以及手绘工具，用于手动勾勒出目标细胞的轮廓。</li>
	<li>要生成一个矩形掩膜，取消注释第167行并注释第170行（通过在该行开头添加“%”来注释）。执行程序的第3部分。在图像中单击并拖动鼠标，开始定义矩形掩膜。双击该矩形框以确认接受。</li>
	<li>要生成手绘掩膜，请注释第167行，取消注释第170行，并执行第3节。使用鼠标点击并绘制所需掩膜。双击掩膜以确认接受。</li>
	<li>运行第4节以构建感兴趣区域的希尔伯特变换DIC图像栈及相应的DIC图像栈。当第179行的“maskON”设置为1时，第3节中构建的掩膜将被应用于希尔伯特变换DIC图像栈和常规DIC图像栈；若将“maskON”设置为0，则构建图像栈时不应用掩膜。</li>
	<li>运行第5节以优化感兴趣区域的xz截面图像的图像分割。程序生成的图500将显示三种不同类型的对比度。算法成功识别细胞边界的程度取决于所用掩膜与程序第229行中“threshold”（阈值）参数的组合。初始值设为0.5，调整阈值参数并重新运行程序的该部分，直至某一列中呈现出理想的轮廓效果。</li>
	<li>如果第1列的轮廓效果最佳，请使用第6节通过DIC图像分割确定体积。如果第2列结果最优，则运行第7节，基于希尔伯特变换的DIC图像确定细胞体积。如果第3列结果最优，则运行第8节，利用傅里叶滤波的希尔伯特变换DIC图像确定体积。</li>
	<li>程序根据所选择的体积测量方式，生成图600、700或800，其标题中显示的样品测量体积单位为立方微米（μm³，fl）。</li>
</ol>
6. 质量测量
<ol>
	<li>打开名为“JoVE_NIQPM_v1.m”的NIQPM MATLAB程序。</li>
	<li>在 NIQPM 程序的第 0 节中，更新运行该程序所需的三个目录的位置。这些目录分别为“dependencies_directory”、“brightfield_directory”和“dic_directory”。</li>
	<li>接下来，运行第1节。此部分代码将生成整套图像全视场的明场图像立方体。第1节仅可运行一次。</li>
	<li>接下来，运行第2节。此时将出现一个名为“Define NIQPM Parameters”的对话框。用户需要输入四个参数：样本明场图像清晰对焦的焦平面编号、横向分辨率（图像中 μm/像素）、轴向分辨率（若图像以0.1 μm轴向步长采集，则该值为0.1），以及感兴趣区域大小（该参数定义后续出现的方框边长，典型值为200）。点击 好的.</li>
	<li>由焦平面编号指定的明场焦平面图像将带有一个蓝色框显示。
	<ol>
		<li>如果图像未对焦，请双击蓝色框并重新运行第 2 部分，务必在对话框中调整焦平面编号。</li>
		<li>如果图像已对焦，拖动图像周围的蓝色框，并通过选择框的节点并根据需要拖动来调整其大小。将框定位在目标特征周围。 例如 一个细胞。该方框无需为正方形。双击方框内部以确认。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接下来，运行第3节以构建裁剪至目标区域的明场图像堆栈。</li>
	<li>要生成相位图、伪微分干涉差（DIC）图像，并与明场图像及真实的DIC图像进行比较，请运行第4节。</li>
	<li>伪微分干涉相差（DIC）图像与真实DIC图像尽可能相似后，可通过运行第5a节或第5b节来确定细胞的质量密度图、总质量以及细胞密度直方图。第5a节执行视场的自动边界检测——在第300行优化“threshold”（阈值）参数，典型取值范围为0.1–1；可根据需要重复运行本节以优化阈值。第5b节执行质量测定。 等等。 在用户标出目标细胞后。</li>
</ol>

<ol><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Technische+Physik%22%5BJournal%5D)">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li>
<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+contrast%2C+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Physica%22%5BJournal%5D)">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li>
<li>Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li>
<li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinterf%C3%A9rom%C3%A8tre+diff%C3%A9rentiel+%C3%A0+ondes+polaris%C3%A9es%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Radium%22%5BJournal%5D)">Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li>
<li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Zeiss+Inform%22%5BJournal%5D)">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li>
<li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-enhanced+contrast%2C+differential+interference+contrast+%28VEC-DIC%29+microscopy%3A+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+processing+greatly+enhances+contrast%2C+quality%2C+and+speed+in+polarization-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li>
<li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+shape+change+and+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+microscopy+and+mass+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li>
<li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractometry+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li>
<li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li>
<li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li>
<li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide%E2%80%90field+differential+interference+contrast+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li>
<li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+%28TI-DIC%29+microscopy+for+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering-phase+theorem%3A+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li>
<li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Carr%C3%A9+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li>
<li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li>
<li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li>
<li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((non-iterative+phase+retrieval+by+Green%E2%80%99s+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">non-iterative phase retrieval by Green’s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li>
<li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quantification+of+cellular+mass%2C+volume%2C+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li>
<li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single+cell+refractive+index%2C+dry+mass%2C+volume%2C+and+density+using+a+transillumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li>
<li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li>
<li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cell+membrane+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li>
<li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li>
<li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22SLIM%29.+Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li>
<li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li>
<li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li>
<li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li>
<li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li>
</ol>

作者对所展示的工作没有经济利益关系。

总体而言，NIQPM 是一种衍射受限的技术，已在0.25-44.7范围内的光程长度上得到验证。验证实验使用直径为0.11-9.8 μm、悬浮于Fluoromount&#160;G中的n = 1.596聚苯乙烯微球（未展示数据）进行。细胞的光程长度范围接近0-7。
在测量样品的密度分布时，可能会发现伪DIC图像效果良好，而密度图却存在不希望的背景贡献。这是由于用作NIQPM算法输入的明场图像中存在噪声所致。可通过两种对NIQPM方法的改进来消除这些不希望的背景贡献：首先，可采用更长的曝光时间以提高明场图像的信噪比，这在对光学薄样品成像时尤为关键；其次，可将z轴堆栈采集的轴向间距从0.1 μm减小至0.05 μm，并在输入NIQPM算法前对2–3个层面进行平均处理。
基于HTDIC的体积测定方法已在直径范围为1-20 μm的聚苯乙烯微球上得到验证，并已通过共聚焦荧光显微镜进行交叉验证35。由于光学系统点扩散函数相关的衍射效应，该技术会对小于系统衍射极限的物体体积产生高估。
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光学显微镜的使用如今已广泛应用于细胞生物的研究中。由于细胞在可见光波段具有较低的内源性吸收和微弱的散射特性，它们对穿过其中的光波振幅影响较小，因此在标准明场显微镜下成像时呈现半透明状态。然而，细胞样本确实会减缓穿过它们的光波传播速度，这种减缓程度与光波所经过空间区域的局部质量密度呈线性关系。利用显微样本透射光波所产生的这种非均匀时间延迟或“相位”分布的特性，最早由弗里茨·泽尼克（Frits Zernike）于1935年提出1，并在1942年由泽尼克本人首次实现实验验证2。泽尼克因此项成就荣获1953年诺贝尔奖。蔡司（Zeiss）公司于1945年将该技术实现商业化3。&#160;1955年，史密斯（Smith）和诺马尔斯基（Nomarski）发表了关于微分干涉差（differential interference contrast, DIC）显微镜应用4与理论5的初步研究，该技术利用相位的空间梯度作为对比度生成机制。蔡司公司于1965年与诺马尔斯基密切合作，将DIC技术推向商业化6。1981年，两个实验室通过将摄像机整合到DIC显微镜的光路中，首次实现了活细胞DIC动态成像的记录7,8。活细胞成像时代由此开启。
自那以后，商用显微镜上相位差和微分干涉差（DIC）技术的实现基本未发生改变。生物学家主要利用这些方法对细胞进行定性成像，用于观察细胞形态、追踪亚细胞结构以及研究膜动力学9。在“即装即用”的配置下，这些技术属于定性方法，因为相位差和DIC图像均为光源强度、照明光学系统设置以及CCD相机增益、伽马值和曝光时间设置的任意函数。
一小群物理学家和光学工程师致力于使商业成像模式实现定量分析。最早的努力可追溯至1952年和1953年发表在《Nature》上的两封来信，其中由医生转行的生物物理学家罗伯特·巴勒（Robert Barer）展示了如何利用相位显微镜，通过商用相位显微镜估算不同类型细胞的相位偏移，从而测定细胞的干质量10,11。&#160;在此后的数十年中，该领域发展出多种技术，主要围绕三种基本的无标记对比机制：相位显微镜10,11、微分干涉差显微镜（DIC显微镜）12-17 和明场显微镜18-22，用于测定光程差、相位、质量密度、折射率以及细胞体积。
与此同时，自20世纪50年代以来，人们还开发了大量定制的光学仪器，实现了广泛而深远的光学测量，应用范围涵盖寄生虫生长23、细胞周期记录24，以及红细胞膜动力学研究25。&#160;特别是过去十年中，出现了大量无标记定量显微技术，包括衍射相位显微术26、层析相位显微术27、数字全息显微术28、相位敏感光学相干显微术29、空间光干涉显微术30、希尔伯特相位显微术31和定量相位显微术32。尽管这些技术取得了 collectively 的成功，但由于其仪器系统复杂且计算需求较高，尚未在更广泛的生物研究领域中得到普及。
本文介绍了利用标准光学显微镜，结合明场与微分干涉差（DIC）成像，对细胞样本进行质量、体积和密度定量测量的方法。文中提出了两种主要方法：非干涉定量相位显微术（NIQPM），用于测量细胞总质量和亚细胞密度分布；希尔伯特变换微分干涉差显微术（HTDIC），用于测定细胞体积。NIQPM 与 HTDIC 的主要优势在于其技术上的易实现性。实现这两种方法所需的成像条件均在大多数商用显微镜的常规操作范围之内。此外，其后处理算法稳定、快速且鲁棒性强——在可能的情况下，均已基于快速傅里叶变换（FFT）算法在 MATLAB 中实现。
NIQPM 是一种从明场图像中重建细胞样本相位及其轴向积分质量密度的方法。将该轴向积分质量密度在样本面积上求和，即可得到样本的总干质量含量。NIQPM 协议基于 Paganin 和 Nugent18,19 建立的实验基础——他们已证明细胞的相位分布可以从样本的离焦明场图像序列中重建——以及 Frank、Altmeyer 和 Wernicke20 在以高效基于快速傅里叶变换（FFT）方法求解近轴波模型方面的理论工作。相位与干质量密度之间的关联则基于 Barer10,11 和 Popescu33 的研究成果。
在高数值孔径（NA）照明条件下，通过沿光轴对样品进行光学切片，可以从离焦差干涉（DIC）图像中获取体积信息。对DIC图像堆栈进行希尔伯特变换处理，能够显著增强边缘检测算法，从而在三维空间中精确定位样品边界，其原理是将样品强度的灰度值与背景的灰度值分离开来。该方法最初由Arinson&#160;et al.34提出，但我们引入了傅里叶滤波方法以增强对比度，并采用基于Sobel的边缘检测方法，实现了对样品的自动化体积分析。我们此前已在尺寸从衍射极限到直径20 μm的聚苯乙烯微球上验证了HTDIC方法的有效性36。
尽管由于在商用显微镜上开发，NIQPM 和 HTDIC 两种技术均具有较高的可及性，但这些方法从根本上受到显微镜硬件配置的限制。这些技术的主要局限性有两个方面：首先，商用显微镜在进行 z 轴层扫时需移动整个样品载物台，而非仅移动物镜，导致采集速度较慢，目前限制了对快于约每分钟1帧的现象进行研究；其次，衍射效应将 NIQPM 和 HTDIC 的适用范围分别限制在直径约为 0.2 至 10 μm 和 0.2 至 20 μm 的样品范围内。因此，待测样品及其关注的时间动态过程必须满足一定的尺寸和时间尺度限制，才能在典型的“即装即用”仪器上应用这些方法。令人振奋的是，大多数固定的细胞样品均可直接利用这些方法进行研究。
NIQPM 和 HTDIC 协议的概述见图 1。图 2展示了在低数值孔径（NA）和高数值孔径（NA）照明条件下，明场和微分干涉相差（DIC）成像中最佳与次佳的离焦成像效果。图 3和图 4展示了 NIQPM 算法的参数依赖性，突出了成功与失败的算法实现情况。图 5说明了 HTDIC 图像处理算法所涉及的步骤，并展示了该算法的最优实现以确定细胞体积。

<table><tbody><tr><td>蔡司 Axio Imager 2 显微镜</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td><td>Axio Imager D2</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>绿色滤光片 (&amp;lambda; = 540 &amp;plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>绿色滤光片</td></tr><tr><td>SlideBook 5.5 软件</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>图像采集软件</td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>聚苯乙烯小球</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>封片介质</td></tr></tbody></table>

定量光学显微镜技术：利用标准光学显微镜测量细胞生物物理特性

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

我们介绍如何利用标准光学显微镜，结合明场与微分干涉差（DIC）成像技术，对细胞样本进行质量、体积和密度的定量测量。本文提出了两种主要方法：非干涉定量相位显微术（NIQPM），用于测量细胞总质量和亚细胞密度分布；以及希尔伯特变换微分干涉差显微术（HTDIC）&#160;，用于测定体积。NIQPM基于一种简化的光波传播模型，称为近轴近似，其包含三个基本假设：低数值孔径（NA）照明、弱散射以及样本对光的弱吸收。幸运的是，未染色的细胞样本通常满足这些假设，且在商用显微镜上易于实现低NA照明。HTDIC则用于在高NA照明条件下，从沿焦平面扫描获得的DIC图像序列中提取三维体积信息。高NA照明可增强沿光轴方向的光学切片能力。对DIC图像堆栈进行希尔伯特变换处理，能够有效分离样本强度与背景的灰度值，从而显著提升边缘检测算法在三维空间中定位样本边界的能力。NIQPM与HTDIC的主要优势在于其技术可及性，仅需使用“即买即用”的常规显微镜设备即可实现。然而，这两种方法也存在两个基本局限：目前商用显微镜的z轴堆栈采集速度较慢，限制了对快于每分钟1帧的动态过程的研究；其次，衍射效应使得NIQPM和HTDIC仅适用于直径在0.2至10 μm（NIQPM）和20 μm（HTDIC）范围内的样本。因此，待测样本及其关注的时间动态过程必须满足一定的尺寸和时间尺度约束，方可适用这些方法。值得期待的是，大多数固定的细胞样本均可方便地通过这些方法进行研究。

在焦平面扫描图像采集过程中，正确的样品照明对于成功实现NIQPM and HTDIC算法至关重要。在图2中，我们展示了聚苯乙烯微球和人结肠直肠腺癌细胞系SW620在微分干涉差（DIC）和明场对比模式下，低数值孔径（NA）和高数值孔径（NA）照明的成像效果。图2A、2C、2I和2K展示了适用于NIQPM的最佳成像条件。图2F、2H、2N和2P展示了适用于HTDIC的最佳成像条件。
图3和图4展示了NIQPM算法的参数依赖性，突出了成功与不成功的实现情况。在图3中，我们研究了一个直径为4.8 μm的聚苯乙烯微球的相位分布——该分布的理论预期值已知，因此可直接与NIQPM重建结果进行比较。图2I-L展示了该微球可获得的最佳重建结果。由于微球边界及内部的衍...

我们描述了如何使用标准光学显微镜，结合明场和微分干涉对比成像，对细胞质量、体积和密度进行定量测量。

我们描述了如何利用标准光学显微镜，通过一种...方法对细胞样本进行质量、体积和密度的定量测量。

本实验的总体目标是利用标准光学显微镜和图像处理技术，对细胞样本的基本物理特征（包括质量与体积）进行定量分析。首先将生长在玻璃盖玻片上的细胞样本固定于显微镜载玻片上，随后获取明场和微分干涉差（DIC）的多焦平面图像。然后，将每组Z轴堆叠图像分别输入独立的MATLAB图像处理程序，以提取物理数据。最终，通过明场对比和微分干涉差显微镜下的焦点扫描强度测量，获得细胞样本的基本物理特性。该技术相较于荧光显微镜等现有方法的主要优势在于，细胞样本无需固定、透化或染色。该方法有助于回答细胞生物学领域中的一些关键问题，例如细胞周期中亚细胞密度是如何组织的，或在导致疾病状态的不同细胞群体中亚细胞密度有何差异。使用具备微分干涉差（DIC）和明场成像功能的显微镜，并根据文本方案中的附加规格，首先打开载玻片成像软件，创建一个新的载玻片用于图像采集。接着，打开对焦窗口，在滤光片组部分选择DIC。在显微镜控制标签页的聚光镜部分，将孔径滑块调节至最右侧位置。这将提供高数值孔径的照明，增强样本的光学切片效果。采集样品的微分干涉差（DIC）图像序列后，打开对焦窗口并选择“打开”。在滤光片组部分，将光圈滑块调整至最左侧位置，完全关闭以提供低数值孔径（NA）照明。调整信号强度后，打开图像采集窗口。从DICZ堆栈采集获得的3D捕获设置将显示在图像采集窗口的滤光片组部分。勾选打开的复选框，并指定曝光时间。在图像信息部分，为图像命名，然后选择“开始”以启动Zack图像采集。然后根据文本协议导出Z层图像，以便在名为 JoVE HT DCO V one M 的 H-T-D-I-C MATLAB 程序中进行体积测量。在“第零节”中，通过从资源管理器中复制并粘贴包含 hilbert_transform_DM.m 和 sobel_edge_detect.m 文件的目录路径，更新 dependencies_directory 变量，将其填入 dependencies_directory = 后面的单引号之间。随后执行 joco HT DCO V one M 程序的第零节。在第一部分，通过复制并粘贴包含点对焦图像（以 TIF 格式）的目录来更新图像目录。单引号之间仅运行此部分一次，以对齐和旋转图像。对于希尔伯特变换，请运行代码的第二部分，此时将出现一个名为“定义 HT DIC 参数”的对话框。然后输入样品DIC图像处于焦平面的焦平面编号、横向分辨率、轴向分辨率、进行希尔伯特变换所需的DIC图像旋转角度，最后输入感兴趣区域的大小。然后点击“确定”。将显示由焦平面编号指定的DIC焦平面图像，并带有蓝色框。将方框置于目标特征（如细胞）上方。当方框已定位至目标区域后，在 B 区域内双击。图像的对比度应调整至暗部特征显示在左侧，亮部特征显示在右侧。将蓝色方框拖动至感兴趣区域，并根据需要调整其形状。接下来，在第三部分中，为了生成

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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