定量的光学显微镜:测量细胞生物物理特性与标准光学显微镜

该程序的总体目标是使用标准光学显微镜和图像处理量化细胞标本的基本物理特征，包括质量和体积。这是通过首先将生长在玻璃盖玻片上的细胞标本安装在显微镜载玻片上来实现的。接下来，通过聚焦获得明场和微分干涉对比图像。

然后，将每个 Z 堆栈图像输入到单独的 MATLAB 图像处理程序中，以提取物理数据。最终，通过在明场对比和微分干涉对比显微镜下进行聚焦强度测量来获得细胞标本的基本物理特性。与荧光显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是细胞标本不需要固定、渗透或染色。

该方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，例如在细胞周期中或不同细胞群之间如何组织亚细胞密度，从而导致疾病状态使用具有 DIC 和明场功能以及根据文本协议的附加规格的显微镜，首先打开幻灯片软件并创建用于图像采集的新载玻片。接下来，打开对焦窗口，在滤镜组部分下选择 DIC 在聚光镜部分下的示波器选项卡上，将光圈滑动条调整到最右边的位置。这提供了高数值孔径照明并增强了样品的光学切片。

捕获样本的 DIC 堆栈后，打开焦点窗口并选择 open。在滤镜设置部分下，将光圈滑杆调整到最左侧的位置，一直关闭，以提供低 NA 照明。调整信号强度后，打开图像捕获窗口。

DICZ 堆栈采集的 3D 捕获设置将显示在图像捕获窗口的过滤器集部分。选中打开的框并指定曝光时间。在图像信息部分，为图像命名并选择 start 以启动 Zack 图像采集。

然后根据文本协议导出 Z 堆栈，在名为 JoVE HT DCO V one M 的 H-T-D-C MATLAB 程序中执行一次体积测量在第 0 节下，通过复制和粘贴包含 hilbert 的目录来更新 dependencies 目录变量。转换 DM 和 sobel edge 从资源管理器检测 M 文件。在单引号之间，以下 dependencies 目录等于 execute joco HT DCO V one M 程序的第 0 节。

在第一部分中，通过复制并粘贴包含点 TIF 形式的聚焦图像的目录来更新 images 目录。在单引号之间，仅运行此部分一次以对齐和旋转图像。对于 hilbert 变换，运行代码的第二部分：将出现一个标题为"定义 HT DIC 参数"的对话框。

然后输入样品的 DIC 图像聚焦的焦平面数、横向分辨率、轴向分辨率、执行希尔伯特变换所需的 DIC 图像的旋转角度，最后输入感兴趣区域的大小。然后单击 Ok.由焦平面编号指定的 DIC 焦平面图像将带有一个蓝色框。

将框放置在感兴趣的特征（如像元）上。将框定位在所需区域上后，双击 B 内部，图像的对比度应使深色特征显示在左侧，而亮特征显示在右侧。将蓝色框拖动到感兴趣区域上，并根据需要重塑形状。

接下来，在第三节下，要生成矩形蒙版，取消注释行 1 6 7 和注释行 1 7 0 通过单击图像并拖动鼠标开始定义矩形蒙版来执行程序的第三部分。然后双击该框以接受它。要生成手绘掩码，请在执行第三节之前注释行 1 6 7 并取消注释行 1 7 0 通过单击并用鼠标绘制所需的掩码，在运行第四节后双击掩码以接受它，以根据文本协议构建希尔伯特转换的图像堆栈运行第五节。

优化感兴趣区域的 xz 横截面图像的图像分割。程序生成的图 500 出现，显示三种不同类型的对比度。算法能否成功找到单元格的边界取决于所使用的掩码和程序第 2、2、9 行的阈值（以值 0.5 开头）的组合，并调整阈值并重新运行程序的此部分，直到在其中一列中实现正确的轮廓。

如果第一列的大纲最好，则在 DIC 分段中，使用第 6 部分来确定体积。如果第二列给出了最佳结果，则运行第七部分以确定希尔伯特的细胞体积，转换 DIC 图像如果第三列给出了最佳结果，使用经过 Forer 过滤的希尔伯特变换 DIC 图像，同时运行第八部分以确定在 NIQ PM MATLAB 程序中进行质量测量的体积，并在第 0 部分下命名为 JO VCO NI qpm V1 M。运行第一部分后，更新三个目录依赖项的位置，BRIGHTFIELD 和 DIC 目录，在标题为定义 N-I-Q-P-M 参数的对话框中运行第二部分，输入样品明场图像聚焦的焦平面数、横向分辨率、轴向分辨率和感兴趣区域大小。

然后单击 Ok.由焦平面编号指定的明场焦平面图像将显示一个蓝色框。如有必要，通过重新运行第二部分调整焦点后，拖动图像周围的框并选择框的节点并拖动它以调整其大小，然后在框内双击以接受它。

通过运行第三部分构建了一堆明场图像后，运行第四部分以生成相位图、伪 DIC 图像以及与明场图像和真实 DIC 图像的比较，当伪 DIC 和真实 DIC 图像尽可能相似时，运行第五部分 A 或第五 B 部分，允许用户勾勒出单元以生成质量密度图， 细胞密度的总质量和直方图正确。聚焦图像采集过程中的样品照明对于成功实施 N-I-Q-P-M 和 H-T-D-I-C 算法至关重要。该图说明了聚苯乙烯球体和人结直肠腺癌细胞系 SW six 在 DIC 和明场对比下的低 NA 和高 NA 照明 20。

这些面板展示了 N-I-Q-P-M 的最佳成像，并且这些面板显示了 HT DIC 的最佳成像。这些图像演示了 NIQ PM 算法的参数依赖性，突出显示了成功和不成功的实施。在这里，我们探讨了直径为 4.8 微米的聚苯乙烯球体的相位分布。

预期的曲线在理论上是已知的，因此可以直接与 NIQ PM 重建进行比较。这些面板在球体边界和内部都为球体衍射效应提供了可获得的最佳重建，从而阻止了球体上所有点的稳定重建。球体的中心区域可以用 N-I-Q-P-M 捕获，百分比误差为 1% 到 5%，如在相位特性未知的 L 组蜂窝标本中看到的那样。

可以使用 NIQ PMM 结合将伪 DIC 图像与实际 DIC 图像进行比较的程序来重建先验。N-I-Q-P-M 有一个 free 参数。右场图像堆栈中计算居中的平面。

应调整此中央焦平面，直到伪 DIC 和真 DIC 图像看起来尽可能相似。这里展示了一个失焦伪 DIC 图像、一个最佳伪 DIC 图像和以 0.9 的照明 NA 拍摄的细胞的相应 DIC 图像。有趣的是，最佳相位图和相应的伪 DIC 图像不一定对应于这些面板所示的聚焦明场图像。

最后，这里显示的是 H-T-D-I-C 图像处理算法中涉及的步骤，在 NA 等于 0.9 照明下通过聚焦图像，执行希尔伯特变换以去除 DIC 图像的基本浮雕。这会沿光轴带来一些模糊，可以从高通 Forer 滤波中去除。这些最终图像很容易分割以确定标本每个横截面平面中的面积，从而推断出总细胞体积。

在尝试此程序时，重要的是要记住此程序后明场矿石差分对比成像的正确照明。可以执行其他方法，如荧光显微镜，以便使用地板力与样品密度图的共定位来回答其他问题。