Name: 使用差分动力学显微镜定量细胞骨架动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习使用差分动力学显微镜（DDM）定量分析重组细胞骨架网络的动力学特性。该方法利用PyDDM软件包，可表征波形蛋白网络的亚扩散动力学以及肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究的部分经费来自美国国立卫生研究院R15项目（美国国立普通医学科学研究所项目编号R15GM123420，授予R.M.R.-A.和R.J.M.）、科学进步研究公司颁发的科特雷尔学者奖（项目编号27459，授予R.J.M.）以及威廉·M·凯克基金会研究资助（授予R.M.R-A.）。GHK感谢荷兰科学研究委员会（NWO；NWO人才计划项目编号VI.C.182.004）提供的财政支持。

注意：可在以下 GitHub 仓库中找到与本方案各步骤相对应的 Jupyter Notebook 文件，https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples。该文件的 PDF 版本包含在补充文件 1中。此外，代码的详细说明以及每个函数和类的文档可在以下网站查阅：https://rmcgorty.github.io/PyDDM/。
1. 软件安装
<ol>
	<li>为了使用示例 DDM 分析文件，请安装 Jupyter Notebook 以运行代码。同时安装其他必需的常用 Python 包，包括 NumPy 和 Matplotlib。这些包均包含在 Anaconda 发行版中（参见 https://www.anaconda.com/products/individual）。</li>
	<li>安装 Python 包 xarray63。该包对于组织和存储元数据及分析参数是必需的。如果使用 Anaconda 发行版，可使用以下命令安装 xarray（及其推荐的依赖项）： 
	conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 bottleneck</li>
	<li>使用以下命令安装 PyYAML 包： 
	conda install -c anaconda yaml 
	该包对于读取待分析图像的元数据以及用户设置的分析和拟合参数是必需的。</li>
	<li>通过从 GitHub 仓库下载或使用 git 命令安装 PyDDM 包： 
	git clone https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git</li>
</ol>
2. 规划成像实验
<ol>
	<li>选择最合适的可用成像方式和光学设置。如前所述，差分动态显微技术（DDM）可与多种显微方法结合使用。</li>
	<li>为协助规划合适的物镜和图像尺寸，请根据像素大小和总图像尺寸确定将要探测的波数范围 q。基于这些计算结果，确认所选的放大倍数和视场范围是否最适合实验。在本研究分析的图像中，活性肌动蛋白-微管复合网络采用了60倍、数值孔径（NA）为1.4的物镜，图像尺寸为256 × 256像素，像素大小为0.83 µm；而在嵌入波形蛋白网络中的微球图像中，则使用了100倍、数值孔径为1.4的物镜，图像尺寸为512 × 512像素，像素大小为0.13 µm。 
	注意：最小波数 q 由 2π/NΔx 决定，其中图像尺寸（假设为正方形）为 N × N 像素，像素大小为 Δx。最大波数 q 取 π/Δx 与 2π NA/λ 中的较小值，其中 NA 为成像物镜的数值孔径，λ 为光的波长（对于明场成像，可将 NA 替换为 (NAobjective + NAcondenser)/2）。</li>
	<li>接下来，考虑需要研究的时间尺度范围。通常，DDM 分析需基于至少1000帧的图像序列进行。
	<ol>
		<li>为确定合适的帧率，需考虑样品中特征移动约等于最小可分辨长度尺度（对应最大 q 值）距离所需的时间。</li>
		<li>在考虑所探测时间尺度的上限时需注意，通常会对给定延迟时间 Δt 的数百个图像差分的功率谱进行平均，以获得足够的统计量从而降低噪声。因此，应采集比所探测的最大时间尺度更长的图像序列。 
		​注意：若已知预期的扩散系数 D 或速度 v，则可结合由视场和像素大小确定的 q 范围，利用 τ = 1/Dq2 或 τ = 1/vq 估算预期的特征衰减时间。在可访问的 q 范围内，预期 τ 值的范围有助于指导帧率和所需采集帧数的选择。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品制备与图像采集
注意：有关代表性结果部分所用数据的样品制备和成像设置的详细信息，请参见作者此前发表的文献11,51,64 以及 补充文件 2。
<ol>
	<li>根据所探测的时间和长度尺度考虑，应获取理想情况下超过 1000 帧的图像序列。 
	注意：该代码将分析图像中的方形区域或方形感兴趣区域，因此需相应调整帧的尺寸。</li>
	<li>将图像序列保存为三维灰度 TIFF 堆栈。或者，也可使用 Nikon Instruments 系统采用的 ND2 格式，所安装的软件包可读取该格式。若图像保存为其他格式，可使用 ImageJ 或其他图像处理程序将图像转换为 TIFF 堆栈。 
	​注意：若使用 ND2 文件，必须安装来自 https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader 的 nd2reader 软件包。</li>
</ol>
4. 参数设置
<ol>
	<li>在 PyDDM 代码仓库的 examples 文件夹中，复制示例参数文件 example_parameter_file.yml。使用如 NotePad++ 或 JupyterLab 中的文本编辑器打开该 YAML 文件。分析代表性结果部分所展示数据时所用的 YAML 参数文件示例，请参见补充文件 2。</li>
	<li>在复制的 YAML 文件中，填写待分析图像序列对应的数据目录路径和文件名。在 metadata 部分，填写像素尺寸和帧率。</li>
	<li>在 Analysis_parameters 部分，提供 DDM 矩阵计算方式的详细信息。其中部分参数为可选项。
	<ol>
		<li>至少需填写参数 number_lag_times 和 last_lag_time 的值。这两个参数分别表示计算 DDM 矩阵时所用的不同滞后时间点的数量，以及所用最长滞后时间（以帧为单位）。对于本研究中用于波形蛋白网络内示踪微球的数据，参数 number_lag_times 和 last_lag_time 分别为 60 和 1000。代码将从 1 帧（或若指定了可选参数 first_lag_time，则从指定的最小滞后时间）开始，以对数间隔计算至 last_lag_time 的 DDM 矩阵。 
		注意：若共采集了 M 帧图像，则理论上可计算最大为 M-1 的滞后时间对应的 DDM 矩阵。但在如此大的滞后时间下，统计信息较差，数据可能噪声较大。计算 DDM 矩阵的最大滞后时间取决于数据的具体情况，但我们建议尝试约为整个图像序列总时长三分之一的值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 Fitting_parameters 部分，提供 DDM 矩阵或中间散射函数（ISF）拟合方式的详细信息。在 model 参数下给出所选模型的名称。为所选模型中的每个拟合参数提供初始估计值、下限和上限。 
	​注意：要显示所有可用拟合模型的列表，可运行函数 print_fitting_models。这些模型也可在 PyDDM 网站的在线文档中找到。</li>
</ol>
5. 计算 DDM 矩阵
<ol>
	<li>初始化 DDM_Analysis 类的一个实例。为此，可通过传递包含完整文件路径的 YAML 文件名给 DDM_Analysis，以提供上述的元数据和分析参数；或者，也可以将元数据和参数作为 Python 字典数据结构传入。</li>
	<li>运行函数 calculate_DDM_matrix 以计算 DDM 矩阵。该计算可能需要数分钟或更长时间，具体取决于帧的大小和延迟时间的数量。典型的运行时间参见图2。</li>
	<li>检查返回的数据，其格式为 xarray 软件包中称为 Dataset 的数据结构。该数据结构存储在属性 ddm_dataset 下。 
	注意：此数据结构不仅存储 DDM 矩阵，还包含相关变量和元数据。此外，它将以网络通用数据格式（netCDF）保存到磁盘。</li>
	<li>查看生成并显示的图表和图像。这些图表和图像也将以 PDF 文件形式保存在数据目录中。
	<ol>
		<li>其中一个生成的图展示了傅里叶变换图像的集合平均平方模量，即 <img alt="静态结构因子方程，衍射图样分析中的 ⟨||I(q,t)||^2⟩ 符号。" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation031"> 随 q 的变化关系。默认情况下，代码使用该图来估计背景参数 B。可通过假设在 q 极大时 <img alt="静态结构因子方程，衍射图样分析中的 ⟨||I(q,t)||^2⟩ 符号。" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation031"> 趋近于 B/2 来估计背景值，其中 B 为背景参数。</li>
		<li>如果 <img alt="静态结构因子方程，衍射图样分析中的 ⟨||I(q,t)||^2⟩ 符号。" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation031"> 在大 q 下未趋于平台，则应采用其他方法估计 B。为此，可在 YAML 文件中设置参数 background_method，或作为 calculate_DDM_matrix 函数的可选关键字参数传入。有关估计 B 的各种方法的更多细节见代表性结果部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="计算时间比较；ISF 分析图；数据分箱；科学数据处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图 2"> 
图 2：计算 DDM 矩阵的计算时间。 在（A）和（B）中展示了计算 DDM 矩阵 <img alt="量子测量概率公式，表示为 D(a,Λt)=⟨|N(a,Λt)|²⟩ₖ。" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="Equation009"> 所需的时间。所有情况下使用的数据均为一段包含 5000 帧、图像尺寸为 512 × 512 像素的视频。DDM 矩阵针对 30 个对数间隔的延迟时间（从 1 帧（0.01 s）到 1000 帧（10 s））进行计算。程序运行于一台配备 32 GB 内存的 Intel i7-10700 2.90 GHz 台式计算机上。在（A）中，展示了在每个延迟时间下用于计算 DDM 矩阵的图像差异数量变化的影响。为此，图像被分箱处理，使图像尺寸变为 256 × 256。对于每个延迟时间 Δt，选取相隔 Δt 的图像进行相减，并对所得矩阵进行傅里叶变换。对于给定的 Δt，可使用所有相隔 Δt 的图像对（以蓝色表示），或仅使用非重叠的图像对（例如第 1 帧与第 10 帧、第 10 帧与第 19 帧等；以棕色表示），或每个 Δt 最多使用 300 对图像。在（B）中，展示了图像尺寸变化对计算时间的影响。图像分别通过合并 2 × 2、4 × 4 或 8 × 8 像素进行分箱处理，得到的图像尺寸分别为 256 × 256、128 × 128 和 64 × 64。每种情况下，在计算每个 Δt 的 DDM 矩阵时均使用约 300 对图像。（C）从 DDM 矩阵中可提取中间散射函数（ISF）。图中展示了（A）中的三种情况。蓝色数据点（无偏移）对应于每个 Δt 使用最大数量图像对时的 ISF；棕色数据点（偏移 0.1）对应于每个 Δt 使用非重叠图像对时的 ISF；粉色数据点（偏移 0.2）对应于每个 Δt 最多使用 300 对图像时的 ISF。使用非重叠图像对得到的 ISF 在长 Δt 处表现出噪声。在这种情况下，长 Δt 时使用的图像对数量较少（例如，当 Δt 为 1000 帧时，仅使用了 4 对图像）。（D）通过将 ISF 拟合到指数函数，可确定每个波数 q 对应的特征衰减时间 τ。粉色结果显示了将原始图像按 2 × 2 分箱后（图像尺寸为 256 × 256）的结果；灰色结果显示了按 8 × 8 分箱后（图像尺寸为 64 × 64）的结果。通过对数据进行分箱处理，会丢失高波数下的动力学信息，但计算 64 × 64 图像的 DDM 矩阵比计算 256 × 256 图像快约 16 倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 拟合 DDM 矩阵或 ISF
<ol>
	<li>初始化 DDM_Fit 类的实例。为此，需将包含图像元数据和拟合参数的 YAML 文件的文件名传递给 DDM_Fit。</li>
	<li>确定用于拟合数据的 DDM 矩阵或 ISF 的模型。通过执行函数 print_fitting_models 来列出可用模型。可在 YAML 参数文件中指定所用模型，或使用函数 reload_fit_model_by_name 进行设置。</li>
	<li>在提供的 YAML 参数文件中，为所选模型的每个参数设置初始猜测值和边界范围。如需更改任意参数的初始猜测值，可使用函数 set_parameter_initial_guess；使用函数 set_parameter_bounds 设置参数的边界。例如，如 补充文件 2 所示，在波形蛋白网络中示踪微球的数据分析中，衰减时间的初始猜测值设为 1 s，该参数的边界范围设为 0.01 s 至 2000 s。</li>
	<li>使用函数 fit 执行拟合。将该函数的输出赋值给一个变量，以便于访问结果。 
	​注意：此函数可接受多个可选参数。有关这些参数的列表及其在何种情况下应设置为非默认值的说明，请参见代码文档和提供的示例。</li>
</ol>
7. 解读拟合结果
<ol>
	<li>使用 fit_report 函数生成用于检查拟合结果及拟合参数随 q 变化关系的图表。 
	注意：该函数将生成一系列图表，并同时保存为 PDF 文件。可通过该函数的可选参数修改所生成的图表。</li>
	<li>生成的图表中将包含一个 2×2 子图，显示在四个 q 值（作为 fit_report 的可选参数指定）下的 DDM 矩阵或 ISF（取决于所选的拟合模型），以及利用模型和最佳拟合参数计算得到的 DDM 矩阵或 ISF。若要在交互式环境中绘制 DDM 矩阵或 ISF 及其最佳拟合结果，可在使用 Jupyter Notebook 环境时参考所提供的示例，使用 Browse_DDM_Fits 类。</li>
	<li>根据特征衰减时间 τ 与波数 q 的关系图，判断体系动力学行为属于扩散、亚扩散、弹道运动或其他类型的运动。可通过分析 τ 与 q 之间的幂律关系来实现。 
	​注意：由 fit_report 函数生成的 τ 与 q 的双对数图中，将显示三条直线，分别对应在指定 q 范围内的幂律拟合结果。实心黑色线表示将 τ 与 q 拟合为幂律关系 τ = 1 / Kqβ，其中 K 和 β 为自由参数；橙色虚线表示拟合为简单扩散关系 τ = 1 / Dq2，其中 D 为扩散系数；蓝色点划线表示拟合为 τ = 1 / vq，其中 v 为速度。</li>
</ol>
8. 保存结果
<ol>
	<li>拟合结果将保存在一个 xarray 数据集中。使用 xarray 的 to_netcdf 函数或 Python 内置的 pickle 模块将此数据结构保存到磁盘。使用 xarray 的 open_dataset 函数加载这些 netCDF 文件。</li>
	<li>使用 save_fit_results_to_excel 函数将拟合结果连同数据一起保存到工作表文件中。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Burla, F., Mulla, Y., Vos, B. E., Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. From mechanical resilience to active material properties in biopolymer networks. Nature Reviews Physics. 1 (4), 249-263 (2019).</li>
	<li>Amblard, F., Maggs, A. C., Yurke, B., Pargellis, A. N., Leibler, S. Subdiffusion and anomalous local viscoelasticity in actin networks. Physical Review Letters. 77 (21), 4470-4473 (1996).</li>
	<li>Mizuno, D., Tardin, C., Schmidt, C. F., MacKintosh, F. C. Nonequilibrium mechanics of active cytoskeletal networks. Science. 315 (5810), 370-373 (2007).</li>
	<li>Bendix, P. M. et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
	<li>Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Physical Review Letters. 102 (18), 188303 (2009).</li>
	<li>Stuhrmann, B., Soares e Silva, M., Depken, M., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Nonequilibrium fluctuations of a remodeling in vitro cytoskeleton. Physical Review E. 86 (2), 020901 (2012).</li>
	<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
	<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
	<li>Anderson, S. J. et al. Filament rigidity vies with mesh size in determining anomalous diffusion in cytoskeleton. Biomacromolecules. 20 (12),4380-4388 (2019).</li>
	<li>Anderson, S. J., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).</li>
	<li>Lee, G. et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), eabe4334 (2021).</li>
	<li>Wong, I. Y. et al. Anomalous diffusion probes microstructure dynamics of entangled F-actin networks. Physical Review Letters. 92 (17), 178101 (2004).</li>
	<li>K&#246;ster, S., Lin, Y.-C., Herrmann, H., Weitz, D. A. Nanomechanics of vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 6 (9), 1910-1914 (2010).</li>
	<li>Chandrakar, P. et al. Engineering stability, longevity, and miscibility of microtubule-based active fluids. Soft Matter. 18 (9), 1852-1835 (2022).</li>
	<li>Alvarado, J., Cipelletti, L., H. Koenderink, G. Uncovering the dynamic precursors to motor-driven contraction of active gels. Soft Matter. 15 (42), 8552-8565 (2019).</li>
	<li>Linsmeier, I. et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).</li>
	<li>Stam, S. et al. Filament rigidity and connectivity tune the deformation modes of active biopolymer networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10037-E10045 (2017).</li>
	<li>Malik-Garbi, M. et al. Scaling behaviour in steady-state contracting actomyosin networks. Nature Physics. 15 (5), 509-516 (2019).</li>
	<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (5), e2115895119 (2022).</li>
	<li>Roostalu, J., Rickman, J., Thomas, C., N&#233;d&#233;lec, F., Surrey, T. Determinants of polar versus nematic organization in networks of dynamic microtubules and mitotic motors. Cell. 175 (3), 796-808.e714 (2018).</li>
	<li>Cerbino, R., Trappe, V. Differential dynamic microscopy: probing wave vector dependent dynamics with a microscope. Physical Review Letters. 100 (18), 188102 (2008).</li>
	<li>Giavazzi, F., Brogioli, D., Trappe, V., Bellini, T., Cerbino, R. Scattering information obtained by optical microscopy: differential dynamic microscopy and beyond. Physical Review E. 80 (3), 031403 (2009).</li>
	<li>Giavazzi, F., Cerbino, R. Digital Fourier microscopy for soft matter dynamics. Journal of Optics. 16 (8), 083001 (2014).</li>
	<li>He, K., Spannuth, M., Conrad, J. C., Krishnamoorti, R. Diffusive dynamics of nanoparticles in aqueous dispersions. Soft Matter. 8 (47), 11933-11938 (2012).</li>
	<li>Lu, P. J. et al. Characterizing concentrated, multiply scattering, and actively driven fluorescent systems with confocal differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 108 (21), 218103 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F. et al. Viscoelasticity of nematic liquid crystals at a glance. Soft Matter. 10 (22), 3938-3949 (2014).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Dark-field differential dynamic microscopy. Soft Matter. 12 (8), 2440-2452 (2016).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Robertson-Anderson, R. M., McGorty, R. Light-sheet microscopy with digital Fourier analysis measures transport properties over large field-of-view. Optics Express. 24 (18), 20881-20894 (2016).</li>
	<li>Richards, J. A., Martinez, V. A., Arlt, J. Particle sizing for flowing colloidal suspensions using flow-differential dynamic microscopy. Soft Matter. 17 (14), 3945-3953 (2021).</li>
	<li>Ferri, F. et al. Kinetics of colloidal fractal aggregation by differential dynamic microscopy. The European Physical Journal Special Topics. 199 (1), 139-148 (2011).</li>
	<li>Lanfranco, R. et al. Adaptable DNA interactions regulate surface triggered self assembly. Nanoscale. 12 (36), 18616-18620 (2020).</li>
	<li>Cho, J. H., Cerbino, R., Bischofberger, I. Emergence of multiscale dynamics in colloidal gels. Physical Review Letters. 124 (8), 088005 (2020).</li>
	<li>Giavazzi, F., Trappe, V., Cerbino, R. Multiple dynamic regimes in a coarsening foam. Journal of Physics: Condensed Matter. 33 (2), 024002 (2020).</li>
	<li>He, K. et al. Diffusive dynamics of nanoparticles in arrays of nanoposts. ACS Nano. 7 (6), 5122-5130 (2013).</li>
	<li>Jacob, J. D. C., He, K., Retterer, S. T., Krishnamoorti, R., Conrad, J. C. Diffusive dynamics of nanoparticles in ultra-confined media. Soft Matter. 11 (38), 7515-7524 (2015).</li>
	<li>Sentjabrskaja, T. et al. Anomalous dynamics of intruders in a crowded environment of mobile obstacles. Nature Communications. 7, 11133 (2016).</li>
	<li>Hitimana, E., Roopnarine, B. K., Morozova, S. Diffusive dynamics of charged nanoparticles in convex lens-induced confinement. Soft Matter. 18 (4), 832-840 (2022).</li>
	<li>Wilson, L. G. et al. Differential dynamic microscopy of bacterial motility. Physical Review Letters. 106 (1), 018101 (2011).</li>
	<li>Martinez, V. A. et al. Differential dynamic microscopy: a high-throughput method for characterizing the motility of microorganisms. Biophysical Journal. 103 (8), 1637-1647 (2012).</li>
	<li>Germain, D., Leocmach, M., Gibaud, T. Differential dynamic microscopy to characterize Brownian motion and bacteria motility. American Journal of Physics. 84 (3), 202-210 (2016).</li>
	<li>Croze, O. A. et al. Helical and oscillatory microswimmer motility statistics from differential dynamic microscopy. New Journal of Physics. 21 (6), 063012 (2019).</li>
	<li>Safari, M. S., Vorontsova, M. A., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of weakly scattering and polydisperse protein-rich clusters. Physical Review E. 92 (4), 042712 (2015).</li>
	<li>Wang, J., McGorty, R. Measuring capillary wave dynamics using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 15 (37), 7412-7419 (2019).</li>
	<li>Cerbino, R., Giavazzi, F., Helgeson, M. E. Differential dynamic microscopy for the characterization of polymer systems. Journal of Polymer Science. 60 (7), 1079-1089 (2021).</li>
	<li>Cerbino, R., Cicuta, P. Perspective: differential dynamic microscopy extracts multi-scale activity in complex fluids and biological systems. The Journal of Chemical Physics. 147 (11), 110901 (2017).</li>
	<li>Drechsler, M., Giavazzi, F., Cerbino, R., Palacios, I. M. Active diffusion and advection in Drosophila oocytes result from the interplay of actin and microtubules. Nature Communications. 8 (1), 1-11 (2017).</li>
	<li>Burla, F., Sentjabrskaja, T., Pletikapic, G., Beugen, J. v., H. Koenderink, G. Particle diffusion in extracellular hydrogels. Soft Matter. 16 (5), 1366-1376 (2020).</li>
	<li>Regan, K., Wulstein, D., Rasmussen, H., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. M. Bridging the spatiotemporal scales of macromolecular transport in crowded biomimetic systems. Soft Matter. 15 (6), 1200-1209 (2019).</li>
	<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), eaay5912 (2019).</li>
	<li>Lee, G. et al. Active cytoskeletal composites display emergent tunable contractility and restructuring. Soft Matter. 17 (47), 10765-10776 (2021).</li>
	<li>Achiriloaie, D. H. et al. Kinesin and myosin motors compete to drive rich multi-phase dynamics in programmable cytoskeletal composites. arXiv:2112.11260 .(2021).</li>
	<li>Chen, X. et al. Coaxial differential dynamic microscopy for measurement of Brownian motion in weak optical field. Optics Express. 26 (24), 32083-32090 (2018).</li>
	<li>Reufer, M., Martinez, V. A., Schurtenberger, P., Poon, W. C. K. Differential dynamic microscopy for anisotropic colloidal dynamics. Langmuir. 28 (10), 4618-4624 (2012).</li>
	<li>Giavazzi, F., Haro-P&#233;rez, C., Cerbino, R. Simultaneous characterization of rotational and translational diffusion of optically anisotropic particles by optical microscopy. Journal of Physics: Condensed Matter. 28 (19), 195201 (2016).</li>
	<li>Cerbino, R., Piotti, D., Buscaglia, M., Giavazzi, F. Dark field differential dynamic microscopy enables accurate characterization of the roto-translational dynamics of bacteria and colloidal clusters. Journal of Physics: Condensed Matter. 30 (2), 025901 (2017).</li>
	<li>Safari, M. S., Poling-Skutvik, R., Vekilov, P. G., Conrad, J. C. Differential dynamic microscopy of bidisperse colloidal suspensions. npj Microgravity. 3 (1), 21 (2017).</li>
	<li>Giavazzi, F., Pal, A., Cerbino, R. Probing roto-translational diffusion of small anisotropic colloidal particles with a bright-field microscope. The European Physical Journal E. 44 (4), 61 (2021).</li>
	<li>Schwarz-Linek, J. et al. Escherichia coli as a model active colloid: a practical introduction. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 137, 2-16 (2016).</li>
	<li>Kurzthaler, C. et al. Probing the spatiotemporal dynamics of catalytic Janus particles with single-particle tracking and differential dynamic microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li>
	<li>Mandal, S., Kurzthaler, C., Franosch, T., L&#246;wen, H. Crowding-enhanced diffusion: an exact theory for highly entangled self-propelled stiff filaments. Physical Review Letters. 125 (13), 138002 (2020).</li>
	<li>Norouzisadeh, M., Chraga, M., Cerchiari, G., Croccolo, F. The modern structurator: increased performance for calculating the structure function. The European Physical Journal E. 44 (12), 146 (2021).</li>
	<li>Gu, M., Luo, Y., He, Y., Helgeson, M. E., Valentine, M. T. Uncertainty quantification and estimation in differential dynamic microscopy. Physical Review E. 104 (3), 034610 (2021).</li>
	<li>Hoyer, S., Hamman, J. xarray: N-D labeled arrays and datasets in Python. Journal of Open Research Software. 5 (1), 10 (2017).</li>
	<li>Aufderhorst-Roberts, A., Koenderink, G. H. Stiffening and inelastic fluidization in vimentin intermediate filament networks. Soft Matter. 15 (36), 7127-7136 (2019).</li>
	<li>Guo, M. et al. The role of vimentin intermediate filaments in cortical and cytoplasmic mechanics. Biophysical Journal. 105 (7), 1562-1568 (2013).</li>
	<li>Lavenus, S. B., Tudor, S. M., Ullo, M. F., Vosatka, K. W., Logue, J. S. A flexible network of vimentin intermediate filaments promotes migration of amoeboid cancer cells through confined environments. Journal of Biological Chemistry. 295 (19), 6700-6709 (2020).</li>
	<li>Patteson, A. E. et al. Loss of vimentin enhances cell motility through small confining spaces. Small. 15 (50), 1903180 (2019).</li>
	<li>Lin, Y.-C. et al. Origins of elasticity in intermediate filament networks. Physical Review Letters. 104 (5), 058101 (2010).</li>
	<li>Pawelzyk, P., M&#252;cke, N., Herrmann, H., Willenbacher, N. Attractive interactions among intermediate filaments determine network mechanics in vitro. PLOS ONE. 9 (4), e93194 (2014).</li>
	<li>Schepers, A. V. et al. Multiscale mechanics and temporal evolution of vimentin intermediate filament networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (27), e2102026118 (2021).</li>
	<li>Wu, H. et al. Effect of divalent cations on the structure and mechanics of vimentin intermediate filaments. Biophysical Journal. 119 (1), 55-64 (2020).</li>
	<li>Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).</li>
	<li>Giavazzi, F., Malinverno, C., Scita, G., Cerbino, R. Tracking-free determination of single-cell displacements and division rates in confluent monolayers. Frontiers in Physics. 6, 120 (2018).</li>
	<li>Cho, J. H. Multiscale Probing of Colloidal Gelation Dynamics., Massachusetts Institute of Technology (2018).</li>
	<li>Krall, A. H., Weitz, D. A. Internal dynamics and elasticity of fractal colloidal gels. Physical Review Letters. 80 (4), 778-781 (1998).</li>
	<li>Bayles, A. V., Squires, T. M., Helgeson, M. E. Probe microrheology without particle tracking by differential dynamic microscopy. Rheologica Acta. 56 (11), 863-869 (2017).</li>
	<li>Edera, P., Bergamini, D., Trappe, V., Giavazzi, F., Cerbino, R. Differential dynamic microscopy microrheology of soft materials: a tracking-free determination of the frequency-dependent loss and storage moduli. Physical Review Materials. 1 (7), 073804 (2017).</li>
	<li>Wang, B., Kuo, J., Bae, S. C., Granick, S. When Brownian diffusion is not Gaussian. Nature Materials. 11 (6), 481-485 (2012).</li>
	<li>soft-matter/trackpy: Trackpy v0.5.0.&#160;Zenodo&#160;(2021).</li>
	<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
	<li>Nixon-Luke, R., Arlt, J., Poon, W. C. K., Bryant, G., Martinez, V. A. Probing the dynamics of turbid colloidal suspensions using differential dynamic microscopy. Soft Matter. 18 (9), 1856-1867 (2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的软件包利用差分动态显微技术（DDM）分析通过光学显微镜获取的图像中观察到的密度波动。首先展示了嵌入波形蛋白网络中的示踪粒子数据的代表性结果。此类数据的分析可用于表征网络的网孔尺寸和刚度，其方式类似于以往许多细胞骨架网络研究中所采用的单粒子追踪方法6,12,13。与单粒子追踪相比，DDM 的一个优势在于无需对粒子进行精确定位。因此，即使在粒子密度过高或粒子过小而难以定位和追踪的图像中，DDM 仍可确定其动力学行为。单粒子追踪更具优势的情况是需要考察粒子间个体差异时。使用 DDM 可获得系综平均的动力学信息，而使用单粒子追踪则可同时计算单个粒子的均方位移（MSD）以及系综平均的 MSD。然而，通过分析大视野中的多个感兴趣区域，DDM 也可用于研究非均质动力学行为。
接下来，展示了由两种不同荧光标记的细胞骨架纤维类型组成的活性网络中，荧光标记纤维数据的代表性结果11。利用这些数据，无需图像中存在可定位的特征，即可表征弹道运动。由于差分动态显微技术（DDM）能够以极少的用户输入提取整体平均的动力学信息，因此便于直接比较在不同条件下获取的图像序列（例如，比较肌动蛋白与微管蛋白比例不同的样品，或肌球蛋白浓度不同的样品，如文献50中所进行的实验）。此外，通过荧光成像，我们可以利用多色标记来研究网络中不同组分的动力学行为。文献11,50中已实现该方法，即在活性肌动蛋白-微管复合网络中，通过多色成像分别分析了肌动蛋白和微管的动力学。在本文的代表性结果部分，仅展示了微管通道的结果，但在先前的研究中，我们已对微管和肌动蛋白纤维的动力学进行了比较11。
我们注意到，这些代表性结果展示了被动亚扩散或主动弹道运动。重要的是，差分动态显微技术（DDM）可用于分析在中间时间或长度尺度上动力学类型发生转变的体系。例如，Kurzthaler 等人将 DDM 应用于主动 Janus 胶体体系，研究了短时间尺度下的主动定向运动以及长时间尺度下运动方向的随机化59；Giavazzi 等人将 DDM 用于粗化泡沫体系，发现动力学的转变对应于气泡的特征长度尺度33；Cho 等人将 DDM 用于胶体凝胶体系，发现在不同长度尺度下存在三个可区分的动力学区域，涵盖从分形团簇到整个网络的范围32。
代表性结果部分包含的数据是通过明场显微镜和激光扫描共聚焦显微镜获得的。然而，如前所述，差分动态显微技术（DDM）可与多种成像模式联用。无论采用何种成像方式，使用者均应考虑光学设置，例如光学切片程度或景深。较高的光学切片程度可减少来自离焦物体的信号，但会导致无法准确测量物体在景深范围外移动时间尺度以上的动态行为25,28。关于q依赖性景深如何影响DDM分析的更详细讨论，可参见文献22。对于明场成像，使用者还需考虑样品厚度。对于弱散射样品，较厚的样品可能提供更强的信号42，而浑浊样品则可能需要修改分析方法以考虑多重散射的影响81。最后，对于非线性空间不变的成像方法（即相机记录的物体强度取决于该物体在x-y样品平面中的位置），可能需要对线性空间变异进行校正，暗场DDM的应用已对此进行了演示27。
对于刚开始使用 DDM 的研究者，我们希望强调考虑空间和时间分辨率的重要性。在检查衰减时间随波数的变化时，标记分辨率的极限非常重要（即最大和最小延迟时间以及最大波数，如图5所示）。在采集数据之前，应仔细考虑这些限制，以便选择最合适的物镜、图像尺寸、帧率和视频持续时间。另一个重要考虑因素是如何估计背景参数 B。文献中已采用多种方法来估计背景，且先前的研究已描述了对 B 的高估或低估所产生的影响62,77。如图10所示，PyDDM 允许用户采用不同的方法来估计 B，我们建议新用户尝试这些方法，并评估哪些方法适用于其研究。
该软件包的一个优势是其详尽的文档和示例数据的操作指南，能够存储和组织元数据以追踪分析过程，并且在分析 DDM 矩阵方面具有灵活性（多种拟合模型、多种估计背景参数 B 的方法、以及计算均方位移 MSD 的能力）。然而，该代码仍有多方面可以改进。目前，代码尚未针对计算速度进行优化。已有文献报道了加快计算速度的方法61,62，这些方法将在未来的版本中实现。此外，我们计划引入近期报道的方法，以更准确地估计不确定性，并利用模拟帮助用户选择合适的 ISF 模型62。对于其他改进，我们希望用户能主动联系我们并提出建议。

细胞骨架是由贯穿真核细胞细胞质的蛋白质丝组成的网络结构，连接细胞表面与细胞核。它具有独特的材料特性，既能提供机械保护以抵抗大而反复的机械负荷，又能驱动细胞形态的动态变化1。重建的细胞骨架网络可产生多种有趣的动态行为，从对嵌入颗粒的笼效应到由分子马达驱动的弹道运动2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。分析此类网络动态的方法包括追踪嵌入的示踪微球的运动6,7,12,13,14、通过图像分析追踪蛋白质富集簇随时间的尺寸变化8、动态光散射15、粒子图像测速法4,16,17,18,19、计算图像随时间变化的功率谱密度19，以及动图分析（kymograph analysis）20。随着越来越多关于重建细胞骨架网络的研究开展，无论是为了理解细胞力学还是活性物质，对稳健、无偏且可重复的动态表征方法的需求日益增加。差分动态显微技术（Differential dynamic microscopy, DDM）21,22是一种相对较新的用于研究细胞骨架动态的技术，该技术仅需少量用户自定义参数即可高效量化动态过程。通过本文所述的软件包，即使缺乏编程或图像分析经验的研究人员也能将其应用于自身研究工作。
DDM 是一种用于提取样品动力学信息的图像分析技术。与粒子追踪或粒子图像测速法类似，DDM 需要一系列时间序列图像（通常为数千幅图像），这些图像通常通过显微镜记录获得。与粒子追踪不同的是，DDM 不需要在图像中对单个特征或示踪微粒进行定位（也无需可定位）。与粒子追踪和粒子图像测速法均不同的是，DDM 可在仅需较少用户设定参数的情况下，恢复系统的整体动力学行为。在 DDM 中，图像在傅里叶空间中被分析，以确定密度涨落的衰减时间。&#160;在一系列波数范围内 q，其中 q = 2&#960;u，以及 u 空间频率的大小, <img alt="公式004" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq004.png" />. 获得类似散射的信息，但图像是通过显微镜获取的实空间图像21,22,23因此，可以利用显微镜的多种产生对比度的方法，例如宽场荧光22,24，共聚焦荧光25，极化的26，暗视野27，或光片荧光28 显微镜技术。此外，用于差分动态显微术分析的图像还可用于粒子追踪或粒子图像测速，以提供互补信息。
动态光散射与光学显微镜技术的这一结合，使差分动态显微术（DDM）成为一种强大且多功能的方法。自2008年Cerbino和Trappe首次描述该技术以来21，DDM已被用于测量73 nm胶体颗粒的扩散行为，并进一步应用于流动胶体29、胶体聚集30,31、向列型液晶的黏弹性26、胶体凝胶的动力学32、粗化泡沫33、受限环境中纳米颗粒的运动34,35,36,37、细菌运动性38,39,40,41、弱散射蛋白簇的扩散42、流体界面的毛细波43以及其他多种体系。希望了解DDM应用相关更完整文献列表的读者，可参考该领域内详尽的综述论文22,23,44,45。
DDM 还被用于研究生物网络的动力学。Drechsler 等人利用 DDM 测量了活体 Drosophila 卵母细胞中肌动蛋白的动力学46。Burla 等人量化了透明质酸及透明质酸-胶原复合网络中示踪粒子的动力学47。已有多个研究报道了 DDM 在重建细胞骨架网络中示踪粒子动力学9,10、DNA 分子在该类网络中的运输48,49，以及活性重建网络动力学研究中的应用11,50,51。DDM 在测量此类系统动力学方面的一个优势在于，无需对单个粒子或分子进行定位和追踪。因此，即使在拥挤环境中难以追踪微小且非球形的分子，仍可利用 DDM 测量 DNA 分子的动力学。此外，结合荧光显微镜，可通过多色标记选择性地测量复杂复合体系中各个组分的动力学行为。
进行差分动力学显微术（DDM）时，需随时间采集一系列图像，即 I(x,y,t)。对于给定的延迟时间 Δt，找出所有（或部分）间隔该延迟时间的图像对。计算每对图像差值的平方傅里叶变换，
<img alt="公式007" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq007.png" style="margin-bottom: 0px;" />
进行计算并取平均。该量<img alt="Equation008" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq008.png" style="margin-bottom: 0px;" />在动力学行为为各向同性的情况下进行径向平均，得到DDM矩阵（也称为图像结构函数）<img alt="Equation009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;" />。此过程如图1所示。为了从该DDM矩阵中确定样品的动力学特性，假设DDM矩阵具有如下形式：
<img alt="公式010" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq010.png" style="margin-bottom: 0px;" />
其中 A 是振幅，其值取决于显微镜的细节和样品的结构， B 是背景，它取决于图像中的噪声，以及 f&#160;(q, &#916;t) 是中间散射函数（ISF），其中包含有关动力学的信息21,22在简单情况下，
<img alt="公式014" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq014.png" style="margin-bottom: 0px;" />
其中&#160;&#964; 是一个特征衰减或去相关时间。这种强度自相关函数已在多项针对稀释胶体悬浮液等遍历系统的 DDM 研究中被使用21,24,27,37,40,52然而，也可以使用ISF的其他形式来模拟各种类型的动力学行为。例如，可以采用累积量展开法对多分散样品的ISF进行建模
<img alt="公式016" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq016.png" style="margin-bottom: 0px;" />
其中&#160;&#956; 是多分散性的度量指标42,53；如果密度涨落通过两种不同的模式衰减，可以使用类似ISF的形式
<img alt="Equation018" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq018.png" style="margin-bottom: 0px;" /> 26, 54, 55, 56, 57；
其他ISF也可用于游泳的微生物或其他活性颗粒38,39,40,41,58,59。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2.jpg" /> 
图1：DDM 分析概述。 从图像的时间序列中，计算图像差分的傅里叶变换以得到 DDM 矩阵。通过对 DDM 矩阵进行模型拟合，可确定在一系列 q 值范围内密度波动的时间尺度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文介绍了一种使用 Python 开发的 DDM 分析软件包 PyDDM。该软件包基于我们研究实验室及其他研究团队在过去几年中已发表的研究成果构建而成。开发此软件包的主要动机包括：(1) 需要追踪和存储分析过程中使用的元数据与参数；(2) 提供从头到尾完整记录的详细分析示例，实现充分的文档化；(3) 提供一种简便的方法来应用不同的（或创建新的）数学模型对数据进行拟合（例如，添加散射强度函数（ISF）模型，如近期为活性纤丝开发的模型60，将变得非常直接）。目前也存在其他用于 DDM 分析的软件包，但并非所有软件包都具备完善的文档说明，或使用开源编程语言编写。例如，已有基于 GPU 计算的 C++ 代码（https://github.com/peterlu/ConDDM）25，使用时间域傅里叶变换以加速计算的 C++ 代码（https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro）61，MATLAB 和 Python 版本的实现（https://github.com/MathieuLeocmach/DDM）40，MATLAB 代码（https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html）27，以及包含不确定性量化的 MATLAB 代码（https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ）62。由于该 PyDDM 软件包具有良好的文档支持，并在 DDM 矩阵的计算与分析方式上提供了高度灵活性，因此有望为希望应用 DDM 技术的研究人员提供帮助，无论其是否具备编程或图像分析背景。&#160;
该方案展示了如何利用此软件包对动态过程进行量化分析 体外 重构的细胞骨架网络。该方法利用两组不同的成像数据：（1）通过明场显微镜获取的嵌入波形蛋白网络中的亚微米示踪颗粒的图像；（2）通过激光扫描共聚焦显微镜获取的荧光标记的肌动蛋白与微管纤维在含有肌球蛋白驱动活性的缠结复合网络中的图像。对这两组数据的分析突显了差分动态显微技术（DDM）的显著优势，包括其能够分析多种成像模式（如明场或共聚焦荧光）所获得的图像，从嵌入的示踪颗粒或标记的纤维中提取动力学信息，以及量化多种类型的动力学行为（如亚扩散、受限运动或弹道式运动）。

<table><tbody><tr><td>CMOS 相机，Orca-Flash 4.0</td><td>Hamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-127 Pluronic</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康 Ti-Eclipse 显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-生物素</td><td>SuSos AG, D&amp;uuml;本多夫，瑞士</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯微球</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛋白质透析微型盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyDDM</td><td>圣迭戈大学</td><td>N/A</td><td>开源软件，可从 https://github.com/rmcgorty/PyDDM 获取</td></tr></tbody></table>

使用差分动态显微镜定量细胞骨架动力学

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

细胞能够爬行、自我修复并调节其刚度，这得益于其高度动态的细胞骨架。因此，重构细胞骨架生物大分子网络可能带来一系列具有活性和适应性的材料。然而，要精确调控此类材料的性能，需要测量其动态行为如何依赖于网络组成和合成方法。由于复合网络在时间、空间和配方空间上存在变异性，对这类动态行为的量化面临挑战。本文所述方案介绍了一种傅里叶分析技术——差分动力显微术（DDM），可用于量化生物大分子网络的动力学特性，尤其适用于细胞骨架网络的研究。DDM 可应用于多种显微成像模式获取的时间序列图像，包括激光扫描共聚焦显微镜、宽场荧光显微镜和明场成像。从这些图像序列中，可以提取出在不同波矢范围内密度涨落的特征去相关时间。本文还开发了一个用户友好的开源 Python 软件包，用于执行 DDM 分析。利用该软件包，可以测量标记的细胞骨架组分或嵌入的示踪粒子的动力学行为，本文以中间丝（波形蛋白）网络和活性肌动蛋白-微管网络的数据为例进行了演示。即使没有编程或图像处理经验的用户，也能借助该软件包及其配套文档完成 DDM 分析。

差分动态显微镜（DDM）结合了动态光散射和显微镜技术的特点。本文介绍了利用DDM通过量化波形蛋白网络中粒子的亚扩散和受限运动，以及活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动，来表征重建细胞骨架网络的过程。

细胞能够爬行、自我修复并调节其刚度，这得益于其高度动态的细胞骨架。因此，重建细胞骨架网络……

我们的实验方案可利用多种光学显微镜技术对多种系统中的动态过程进行定量分析。我们重点阐述了该方法如何特别有助于表征重建的细胞骨架网络的动力学特性。使用我们开发的差分动态显微镜软件包的主要优势在于其具有完善的文档说明，提供多个示例分析文件，并且能够轻松地进行调整以研究不同类型的动态过程。我们的软件包不仅可以用于量化重建的细胞骨架网络的动力学行为，还可用于其他软性且具有生物学意义的材料。根据所研究的时间和长度尺度，使用显微镜控制软件（如 Micro-Manager）采集超过 1,000 帧的图像序列。在 PyDDM 代码仓库提供的示例文件夹中，复制一个名为 example_parameter_file.yml 的参数文件。使用记事本+或 JupyterLab 中的文本编辑器等文本编辑工具打开此 EML 文件。在复制的 EML 文件中，提供与待分析图像序列对应的数据目录和文件名。在元数据部分，填写像素大小和帧率。在分析参数部分，选择用于计算 DDM 矩阵的参数，例如不同延迟时间的数量和最长延迟时间。在拟合参数部分，提供 DDM 矩阵或中间散射函数拟合的详细信息，例如模型名称和模型参数、初始估计值、下限和上限。通过传递包含完整文件路径的 EML 文件名至 DDM 分析，将元数据提供给分析参数，从而初始化 DDM 分析类的一个实例。或者，将元数据和参数作为 Python 字典数据结构传入。运行该函数以计算 DDM 矩阵。通过相关的变量和元数据检查返回的数据，这些数据以 Xarray 软件包中的数据集形式存储。然后，检查保存为 PDF 文件和数据目录中的图示和图表。其中一个图示展示了背景信号估算的默认方法。如有需要，可通过 EML 文件中的 background method 参数，或作为 calculate DDM matrix 函数的可选关键字参数，更改背景信号的估算方法。通过传入包含图像元数据和拟合参数的 EML 文件的文件名，初始化 DDM 拟合类的实例。执行函数 print fitting models 以列出可用的模型。可通过在 EML 参数文件中指定模型，或使用函数 reload fit model by name 来选择要使用的模型。对于所选模型中的每个参数，使用 set parameter initial guess 和 set parameter bounds 函数设置初始猜测值和边界，如果这些值与 EML 文件中指定的值不同。使用 fit 函数执行拟合。使用 fit report 函数生成图表，以检查拟合参数随 q 变化的关系。检查输出结果，包括包含四个 q 值下 DDM 矩阵或 ISF 及其拟合结果的 2×2 子图。在 Jupyter Notebook 环境中使用类浏览 DDM 拟合功能，以交互方式绘制 DDM 矩阵或 ISF 及其最佳拟合曲线。点击衰减时间与波数关系图中的某个数据点，即可显示对应的数据和拟合结果。检查保存在 Xarray 数据集中的拟合结果，并使用 two 函数或 Python 内置的 pickle 模块将此数据结构保存到磁盘。对波形蛋白网络中 0.6 微米微球的明场图像序列以及具有光谱分辨荧光标记的活性肌动蛋白-微管复合网络的共聚焦显微镜图像进行了 DDM 分析。在不同波数下，将中间散射函数绘制为滞后时间的函数，所用网络的波形蛋白浓度分别为 19 微摩尔和 34 微摩尔。该函数在远高于零的值处出现较长的平台期，表明系统具有非遍历性。针对两种不同波形蛋白浓度的网络，衰减时间 tau 随 q 的变化关系显示为亚扩散或受限运动。对于含有 34 和 49 微摩尔波形蛋白的网络，非遍历性参数 c 随 q 的平方变化的关系表明，c 的对数与 q 的平方成正比，符合受限运动的预期特征。均方位移随滞后时间变化的曲线图显示，通过差分动态显微技术（DDM）测得的数值与单颗粒追踪法所得结果高度一致。对于浓度较高的网络体系，该数值在较长滞后时间下趋于平稳。活性肌动蛋白-微管复合网络的DDM矩阵随滞后时间的变化表明，特定q值下的DDM矩阵在短滞后时间范围内出现平台期，随后上升并最终在长滞后时间范围内再次达到平台期。对DDM矩阵拟合得到的特征衰减时间tau表明，tau与q之间的关系指示了弹道运动。在开发了该PyDDM软件包后，我们利用它研究了活性细胞骨架网络及其他系统的各向异性和随时间变化的动力学行为。

quantifying-cytoskeleton-dynamics-using-differential-dynamic

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用差分动力学显微镜定量细胞骨架动力学

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。...

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB...

利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

利用成像衍生的均方位移（iMSD）分析来研究巨胞饮泡，以突出其在结构和动态特性方面随时间演变的内在特性。随后将巨胞饮泡与胰岛素分泌颗粒（ISGs）进行比较，后者作为具有时间不变平均结构/动态特性的亚细胞结构的参照。...

通过时空涨落光谱探测转运亚细胞纳米结构的结构与动态特性

本方案旨在通过EB3蛋白转染实现微管正端的可视化，以研究其在原代细胞培养中的动态特性。该方案已应用于源自亨廷顿病患者的原代人皮肤成纤维细胞。...

基于人原代皮肤成纤维细胞的亨廷顿病模型中微管正端动态可视化

本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。...

利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

在本视频中，我们演示了用于制备适用于细胞培养的柔性、细胞外基质（ECM）包被基底的实验技术，这些基底可用于牵引力显微镜检测，并可用于观察细胞外基质刚度对细胞行为的影响。...

用于量化细胞收缩的投诉基质的制备

学习使用差分动力学显微镜（DDM）定量分析重组细胞骨架网络的动力学特性。该方法利用PyDDM软件包，可表征波形蛋白网络的亚扩散动力学以及肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动。

使用差分动态显微镜定量细胞骨架动力学

探索更多视频