使用差分动力学显微镜定量细胞骨架动力学
June 15th, 2022
差分动态显微镜（DDM）结合了动态光散射和显微镜的特征。本文介绍了利用DDM通过量化维门汀网络中颗粒的亚扩散和笼中动力学以及活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动来表征重构细胞骨架网络的过程。
我们的实验方案可以使用一系列光学显微镜技术量化许多系统中的动力学。我们强调这种方法如何特别有助于表征重构细胞骨架网络的动力学。使用我们的差分动态显微镜软件包的主要优点是它具有良好的文档记录，具有多个示例分析文件，并且可以轻松适应研究不同类型的动力学。
我们的软件包不仅可用于量化重构的细胞骨架网络中的动力学，还可用于量化其他软质和生物学相关材料的动力学。根据时间和长度尺度，使用显微镜控制软件（如Micro-Manager）采集超过1， 000帧的图像序列。在 PyDDM 代码存储库中提供的示例文件夹下，创建名为 example_parameter_file.yml 的参数文件的副本。
使用文本编辑器（如记事本+）或JupyterLab中的文本编辑器打开此EML文件。在复制的 EML 文件中，提供与要分析的图像序列对应的数据目录和文件名。在元数据部分下，提供像素大小和帧速率。
在分析参数部分下，选择DDM矩阵的计算参数，如不同滞后次数和最长滞后时间。在拟合参数部分中提供有关 DDM 矩阵或中间散射函数的拟合的详细信息，例如模型和模型参数的名称、初始猜测、下限和上限。通过将 EML 文件的文件名与完整文件路径传递给 DDM 分析，在分析参数中提供元数据，从而初始化 DDM 分析类的实例。
或者，将元数据和参数作为 Python 字典数据结构传递。运行函数以计算 DDM 矩阵。使用关联的变量和元数据检查返回的数据，这些变量和元数据作为数据集存储在 Xarray 包中。
然后，检查另存为 PDF 文件和数据目录的绘图和图形。其中一个图显示了如何估计背景的默认方法。如果需要，请使用 EML 文件中的参数背景方法或作为函数计算 DDM 矩阵的可选关键字参数来更改估计背景的方法。
通过传递包含图像元数据和拟合参数的 EML 文件的文件名来初始化 DDM 适合类的实例。通过执行函数打印拟合模型列出可用模型。指定要在 EML 参数文件中使用的模型，或使用函数按名称重新加载拟合模型。
对于所选模型中的每个参数，如果与 EML 文件中指定的值不同，则使用函数设置初始猜测和边界，设置参数初始猜测和边界。使用函数拟合执行拟合。使用函数拟合报告生成用于检查拟合参数 q 依赖性中的拟合曲线的拟合图。
检查输出，包括带有二乘二子图的数字，该子图显示了 DDM 矩阵或 ISF 在四个 q 值下以及拟合。使用类浏览 DDM 拟合在 Jupyter 笔记本环境中以交互方式绘制 DDM 矩阵或 ISF 以及最佳拟合。单击衰减时间与波数图中的点将显示数据和拟合。
检查保存在 Xarray 数据集中的拟合结果，并使用函数 two netCDF 或 Python 的内置泡菜模块将此数据结构保存到磁盘。对活体蛋白网络中0.6微米微米微球的明场图像系列进行了DDM分析，并对来自具有光谱独特荧光标记的活性肌动蛋白 - 微管复合网络的共聚焦显微镜图像进行了分析。将中间散射函数绘制为不同波数下滞后时间的函数，以及具有19微摩尔和34微摩尔的维门汀浓度的网络。
值远高于零时函数的长滞后时间平台表示非遗传性。对于具有不同维门汀浓度的两个网络，作为q的函数绘制的衰变时间tau显示亚扩散或受限运动。将非能性参数c绘制为具有34和49微摩尔vimentin的网络的q平方函数，表明c的对数与限制运动的预期q平方成正比。
均方位移与滞后时间图表明，从DDM确定的值与通过单粒子跟踪找到的值非常吻合。对于更集中的网络，值在较长的滞后时间内稳定下来。活性肌动蛋白-微管复合网络的DDM矩阵与滞后时间的比较表明，特定q值的DDM矩阵在低滞后时间具有平台，然后在大滞后时间进一步趋于稳定。
从拟合到DDM矩阵的特征衰减时间tau表明tau和q之间的关系表示弹道运动。在开发该PyDDM软件包后，我们用它来研究活性细胞骨架网络和其他系统的各向异性和时变动力学。
概述
本文介绍了一种利用差分动态显微镜（DDM）分析重组细胞骨架网络动力学的协议。该方法量化了中间体网络中的亚扩散和限制动力学，并检查了活性肌球蛋白驱动的肌动蛋白-微管复合物的弹道运动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 细胞生物学
背景
- 差分动态显微镜结合了动态光散射和显微镜技术。
- 它对于表征软质和生物相关材料的动力学非常有效。
- 该软件包记录完善，可适用于各种动态研究。
- 使用显微镜控制软件可以分析超过1,000帧的图像序列。
研究目的
- 量化重组细胞骨架网络的动力学。
- 提供在各种系统中使用DDM的详细方法。
- 研究活性细胞骨架网络的各向异性和时间变化的动力学。
使用的方法
- 利用PyDDM软件包进行DDM分析。
- 图像元数据和拟合参数在EML文件中指定。
- 分析包括计算DDM矩阵和拟合中间散射函数。
- 结果通过绘制图表和图形可视化，并保存为PDF文件。
主要结果
- DDM分析揭示了不同浓度的中间体网络中的非平稳性。
- 衰减时间图表指示了具有不同中间体浓度的网络中的亚扩散运动。
- 在活性肌动蛋白-微管复合物中观察到弹道运动。
- DDM的结果与单粒子跟踪数据很好地一致。
结论
- DDM是分析细胞骨架动力学的强大工具。
- 该方法提供了对复杂生物材料行为的洞察。
- PyDDM软件促进了对动态过程的全面分析和可视化。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of cytoskeleton dynamics is critical for de-risking early-stage discovery and engineering of biomaterials with tunable mechanical properties. Differential Dynamic Microscopy (DDM) enables robust, reproducible measurement of network dynamics across diverse cytoskeletal systems, supporting predictive confidence in target validation and material design. This capability strengthens portfolio decisions by providing standardized, scalable dynamic readouts for both fundamental research and translational applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cytoskeletal network dynamics for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of biopolymer targets by measuring dynamic responses to composition changes.
- Facilitates predictive confidence in material behavior for downstream engineering or therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated dynamic readouts for high-content screening of cytoskeletal modulators.
- Standardizes assay outputs through reproducible, quantitative DDM analysis across imaging modalities.
- Enables scalable evaluation of compound effects on network mechanics and dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns dynamic measurements with disease-relevant cytoskeletal phenotypes when modeling pathophysiology.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling direct comparison of network dynamics across systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying dynamic biomarkers in engineered or native networks.
Pipeline & Workflow Integration
DDM-based quantification integrates from early discovery through assay development and preclinical research, providing a reusable analytical capability for cytoskeletal and soft material systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying dynamic responses to perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic screening campaigns targeting cytoskeletal function.
- Analytics: Provides robust statistical measurements such as decay times, nonergodicity parameters, and mean squared displacement for comparative analysis.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro dynamic phenotypes with disease models when supported by system relevance.
- Enterprise Reuse: Offers a documented, open-source software package adaptable across diverse imaging platforms and biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeletal target validation.
- Operational Value: Standardizes dynamic measurements and enhances reproducibility across teams and platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, scalable dynamic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biomaterial and cytoskeletal modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy and basic familiarity with Python-based analysis workflows.
- Needs access to imaging infrastructure capable of acquiring high-frame-count time series.
- Demands cross-team standardization of metadata and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to a range of cytoskeletal and soft material systems with appropriate labeling or tracer strategies.
- Dependent on image quality and acquisition parameters for optimal dynamic resolution.
