使用差分动态显微镜定量细胞骨架动力学

我们的实验方案可利用多种光学显微镜技术对多种系统中的动态过程进行定量分析。我们重点阐述了该方法如何特别有助于表征重建的细胞骨架网络的动力学特性。使用我们开发的差分动态显微镜软件包的主要优势在于其具有完善的文档说明，提供多个示例分析文件，并且能够轻松地进行调整以研究不同类型的动态过程。

我们的软件包不仅可以用于量化重建的细胞骨架网络的动力学行为，还可用于其他软性且具有生物学意义的材料。根据所研究的时间和长度尺度，使用显微镜控制软件（如 Micro-Manager）采集超过 1,000 帧的图像序列。在 PyDDM 代码仓库提供的示例文件夹中，复制一个名为 example_parameter_file.yml 的参数文件。

使用记事本+或 JupyterLab 中的文本编辑器等文本编辑工具打开此 EML 文件。在复制的 EML 文件中，提供与待分析图像序列对应的数据目录和文件名。在元数据部分，填写像素大小和帧率。

在分析参数部分，选择用于计算 DDM 矩阵的参数，例如不同延迟时间的数量和最长延迟时间。在拟合参数部分，提供 DDM 矩阵或中间散射函数拟合的详细信息，例如模型名称和模型参数、初始估计值、下限和上限。通过传递包含完整文件路径的 EML 文件名至 DDM 分析，将元数据提供给分析参数，从而初始化 DDM 分析类的一个实例。

或者，将元数据和参数作为 Python 字典数据结构传入。运行该函数以计算 DDM 矩阵。通过相关的变量和元数据检查返回的数据，这些数据以 Xarray 软件包中的数据集形式存储。

然后，检查保存为 PDF 文件和数据目录中的图示和图表。其中一个图示展示了背景信号估算的默认方法。如有需要，可通过 EML 文件中的 background method 参数，或作为 calculate DDM matrix 函数的可选关键字参数，更改背景信号的估算方法。

通过传入包含图像元数据和拟合参数的 EML 文件的文件名，初始化 DDM 拟合类的实例。执行函数 print fitting models 以列出可用的模型。可通过在 EML 参数文件中指定模型，或使用函数 reload fit model by name 来选择要使用的模型。

对于所选模型中的每个参数，使用 set parameter initial guess 和 set parameter bounds 函数设置初始猜测值和边界，如果这些值与 EML 文件中指定的值不同。使用 fit 函数执行拟合。使用 fit report 函数生成图表，以检查拟合参数随 q 变化的关系。

检查输出结果，包括包含四个 q 值下 DDM 矩阵或 ISF 及其拟合结果的 2×2 子图。在 Jupyter Notebook 环境中使用类浏览 DDM 拟合功能，以交互方式绘制 DDM 矩阵或 ISF 及其最佳拟合曲线。点击衰减时间与波数关系图中的某个数据点，即可显示对应的数据和拟合结果。

检查保存在 Xarray 数据集中的拟合结果，并使用 two 函数或 Python 内置的 pickle 模块将此数据结构保存到磁盘。对波形蛋白网络中 0.6 微米微球的明场图像序列以及具有光谱分辨荧光标记的活性肌动蛋白-微管复合网络的共聚焦显微镜图像进行了 DDM 分析。在不同波数下，将中间散射函数绘制为滞后时间的函数，所用网络的波形蛋白浓度分别为 19 微摩尔和 34 微摩尔。

该函数在远高于零的值处出现较长的平台期，表明系统具有非遍历性。针对两种不同波形蛋白浓度的网络，衰减时间 tau 随 q 的变化关系显示为亚扩散或受限运动。对于含有 34 和 49 微摩尔波形蛋白的网络，非遍历性参数 c 随 q 的平方变化的关系表明，c 的对数与 q 的平方成正比，符合受限运动的预期特征。

均方位移随滞后时间变化的曲线图显示，通过差分动态显微技术（DDM）测得的数值与单颗粒追踪法所得结果高度一致。对于浓度较高的网络体系，该数值在较长滞后时间下趋于平稳。活性肌动蛋白-微管复合网络的DDM矩阵随滞后时间的变化表明，特定q值下的DDM矩阵在短滞后时间范围内出现平台期，随后上升并最终在长滞后时间范围内再次达到平台期。

对DDM矩阵拟合得到的特征衰减时间tau表明，tau与q之间的关系指示了弹道运动。在开发了该PyDDM软件包后，我们利用它研究了活性细胞骨架网络及其他系统的各向异性和随时间变化的动力学行为。