发育小鼠垂体的解剖和冠状切片制备
2017年11月16日
我们提出了解剖垂体腺和准备垂体冠状区的发展小鼠的协议。
该程序的总体目标是从发育中的小鼠中获得适当的垂体冠状切片，并具有保存完好的组织结构。该程序可以帮助回答垂体发育领域的关键问题，例如垂体组织学、细胞分化、增殖和细胞凋亡。该技术的主要优点是可以解剖发育中的小鼠垂体而不会造成明显损伤，并且可以正确定向以获得冠状切片。
当我们发现，对于发育小鼠垂体，在技术上很难获得适当的冠状切片，我们第一次有了这种方法的想法。根据文本方案麻醉和固定小鼠后，用剪刀切开颅骨。接下来，用镊子轻轻地将后脑从颅底提起。
然后，在蝶鞍的第一个迹象处，停止抬起但握住后脑，用细剪刀剪断连接到大脑底部的垂体柄和神经纤维。继续抬起并移除整个大脑，以完全暴露垂体。垂体位于蝶骨的背侧，外侧被三叉神经包围。
然后用剪刀剪断整个鞍区，包括垂体、外侧三叉神经和蝶骨下方。将组织放入含有 4% PFA 的 35 毫米培养皿中，并在 4 摄氏度下孵育 40 分钟至 3 小时，具体取决于年龄。然后使用 10 mL PBS 洗涤固定组织，每次 15 分钟，更换 5 次。
将固定的组织转移到含有 1 mL PBS 的 35 mm 培养皿中，并在立体显微镜下分离垂体。对于 P5 至 P14 垂体，用细镊子和剪刀去除神经和骨骼之间的结缔膜，并小心地将垂体与外侧三叉神经作为一个整体隔离，但留下蝶鞍。对于 P21 和成人垂体，去除垂体周围的神经和结缔膜，并将腺体从周围组织中释放出来。
根据文本方案进行脱水、二甲苯透明化和蜡浸润后，在组织包埋控制台系统上，从包埋盒中取出标本，并将其放入半装满熔融石蜡的基模中。对于 P21 和成人垂体，使用加热的细镊子定位垂体，其短轴垂直于基模的底面。对于 P0 至 P4 垂体，将标本定向，使其蝶骨垂直于基模的底面。
对于 P5 至 P14 垂体，使标本的三叉神经垂直于基模的底面。放置腺体后，使用加热的细镊子轻轻地将组织保持在所需位置，直到蜡在冷却板上变成半固体。用熔融的石蜡加满模具。
让石蜡块冷却，直到蜡完全凝固。将石蜡块在零下 20 摄氏度下冷却 10 到 20 分钟，然后用切片机将其切成薄片，在切片过程中微调石蜡块的位置。根据文本方案进行免疫标记。
如图所示，为了从新生小鼠中解剖垂体腺，从颅底解剖出包含垂体、三叉神经和下方蝶骨的整个蝶区。在这个过程中，微小而脆弱的垂体保持完整。对于超过 5 天的小鼠，分离附着在外侧三叉神经上的垂体。
从 P7 小鼠分离的垂体腺生长结构保存完好。在这里，P21 小鼠的垂体被成功分离，在去除其周围组织的同时没有明显的损伤。在该图中，正确定向的冠状切片的 H&E 染色显示 P0、P7 和 P21 垂体腺中腺垂体和神经垂体的形态保存完好。
最后，处理后的玻片也与免疫荧光标记兼容。例如，腺垂体和神经垂体分别显示出 GH 和 GFAP 的特异性免疫标记。一旦掌握，成年小鼠从解剖到包埋的过程可以在 7.5 小时内完成，如果作得当，年轻小鼠甚至更短。
在尝试此手术时，重要的是要记住解剖整个鞍区，以避免用任何手术工具接触垂体。按照此程序，也可以分离未添加前缀的垂体。在这种情况下，应更加小心以避免任何意外损坏。
腺体也应尽快解剖。看完这个视频，你应该对如何解剖小鼠垂体和准备不同发育阶段的垂体冠状切片有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种解剖发育中小鼠垂体并制备冠状切片的协议。该方法旨在在促进垂体发育研究的同时保存组织结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 组织学
背景
- 了解垂体发育对于洞察激素调节至关重要。
- 在从发育中的小鼠垂体获得适当的冠状切片存在挑战。
- 组织学分析可以揭示关于细胞分化和增殖的信息。
- 正确的技术对于在解剖过程中保持组织完整性至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的解剖垂体的方法。
- 确保冠状切片中的组织结构保存良好。
- 促进对垂体组织学和相关发育过程的研究。
使用的方法
- 发育中小鼠的麻醉和固定。
- 解剖头骨以接触到垂体。
- 小心地提起后脑以避免损伤。
- 为组织学分析准备冠状切片。
主要结果
- 该协议允许成功地解剖小鼠垂体。
- 冠状切片有效地保持了组织结构。
- 该方法可以应用于各种垂体发育研究。
- 结果有助于理解细胞分化和细胞凋亡。
结论
- 所呈现的协议是神经科学和发育生物学研究人员的宝贵工具。
- 它解决了以前在获得高质量冠状切片方面的挑战。
- 未来的研究可以利用这种方法探索垂体功能和疾病。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable dissection and coronal sectioning of developing mouse pituitary glands, supporting endocrine and neurodevelopmental research. By preserving tissue architecture across developmental stages, it facilitates mechanistic studies of hormone-secreting cell differentiation and proliferation. The method addresses a key technical barrier in pituitary biology, improving reproducibility in preclinical target validation and biomarker discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of pituitary developmental pathways and endocrine cell specification.
- Operational Value: Provides standardized tissue preparation for consistent histological and molecular readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible coronal sections suitable for immunohistochemistry and immunofluorescence screening.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent orientation and preservation of adenohypophysis and neurohypophysis structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links developmental phenotypes to hormonal regulation mechanisms relevant to endocrine disorder modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal analysis across postnatal developmental windows (P0-P21) for phenotype tracking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing intact pituitary tissue for downstream analysis, supporting target validation and phenotypic screening in endocrine-related disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pituitary cell differentiation and proliferation through preserved coronal sections.
- Screening: Enables quantitative immunohistochemical and immunofluorescence assays with consistent tissue morphology.
- Analytics: Facilitates morphometric and molecular readouts that allow comparison across developmental stages and experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to endocrine function, supporting preclinical modeling of pituitary-related disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection and sectioning protocol applicable across multiple pituitary development studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in pituitary developmental studies by ensuring tissue integrity and section quality.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and developmental timepoints.
- Strategic Value: Reduces technical failure rates in endocrine research, improving resource efficiency and timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in hormonal regulation pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse dissection and histological processing techniques.
- Dependent on access to microtome, embedding consoles, and histological staining infrastructure.
- Necessitates standardization of dissection timing and fixation protocols across developmental stages.
- Requires adaptation of embedding orientation based on age-specific anatomical landmarks (sphenoid bone, trigeminal nerves).
- Limited by tissue fragility in early developmental stages, necessitating careful handling to avoid damage.
