发育小鼠垂体的解剖和冠状切片制备

该程序的总体目标是从发育中的小鼠中获得适当的垂体冠状切片，并具有保存完好的组织结构。该程序可以帮助回答垂体发育领域的关键问题，例如垂体组织学、细胞分化、增殖和细胞凋亡。该技术的主要优点是可以解剖发育中的小鼠垂体而不会造成明显损伤，并且可以正确定向以获得冠状切片。

当我们发现，对于发育小鼠垂体，在技术上很难获得适当的冠状切片，我们第一次有了这种方法的想法。根据文本方案麻醉和固定小鼠后，用剪刀切开颅骨。接下来，用镊子轻轻地将后脑从颅底提起。

然后，在蝶鞍的第一个迹象处，停止抬起但握住后脑，用细剪刀剪断连接到大脑底部的垂体柄和神经纤维。继续抬起并移除整个大脑，以完全暴露垂体。垂体位于蝶骨的背侧，外侧被三叉神经包围。

然后用剪刀剪断整个鞍区，包括垂体、外侧三叉神经和蝶骨下方。将组织放入含有 4% PFA 的 35 毫米培养皿中，并在 4 摄氏度下孵育 40 分钟至 3 小时，具体取决于年龄。然后使用 10 mL PBS 洗涤固定组织，每次 15 分钟，更换 5 次。

将固定的组织转移到含有 1 mL PBS 的 35 mm 培养皿中，并在立体显微镜下分离垂体。对于 P5 至 P14 垂体，用细镊子和剪刀去除神经和骨骼之间的结缔膜，并小心地将垂体与外侧三叉神经作为一个整体隔离，但留下蝶鞍。对于 P21 和成人垂体，去除垂体周围的神经和结缔膜，并将腺体从周围组织中释放出来。

根据文本方案进行脱水、二甲苯透明化和蜡浸润后，在组织包埋控制台系统上，从包埋盒中取出标本，并将其放入半装满熔融石蜡的基模中。对于 P21 和成人垂体，使用加热的细镊子定位垂体，其短轴垂直于基模的底面。对于 P0 至 P4 垂体，将标本定向，使其蝶骨垂直于基模的底面。

对于 P5 至 P14 垂体，使标本的三叉神经垂直于基模的底面。放置腺体后，使用加热的细镊子轻轻地将组织保持在所需位置，直到蜡在冷却板上变成半固体。用熔融的石蜡加满模具。

让石蜡块冷却，直到蜡完全凝固。将石蜡块在零下 20 摄氏度下冷却 10 到 20 分钟，然后用切片机将其切成薄片，在切片过程中微调石蜡块的位置。根据文本方案进行免疫标记。

如图所示，为了从新生小鼠中解剖垂体腺，从颅底解剖出包含垂体、三叉神经和下方蝶骨的整个蝶区。在这个过程中，微小而脆弱的垂体保持完整。对于超过 5 天的小鼠，分离附着在外侧三叉神经上的垂体。

从 P7 小鼠分离的垂体腺生长结构保存完好。在这里，P21 小鼠的垂体被成功分离，在去除其周围组织的同时没有明显的损伤。在该图中，正确定向的冠状切片的 H&E 染色显示 P0、P7 和 P21 垂体腺中腺垂体和神经垂体的形态保存完好。

最后，处理后的玻片也与免疫荧光标记兼容。例如，腺垂体和神经垂体分别显示出 GH 和 GFAP 的特异性免疫标记。一旦掌握，成年小鼠从解剖到包埋的过程可以在 7.5 小时内完成，如果作得当，年轻小鼠甚至更短。

在尝试此手术时，重要的是要记住解剖整个鞍区，以避免用任何手术工具接触垂体。按照此程序，也可以分离未添加前缀的垂体。在这种情况下，应更加小心以避免任何意外损坏。

腺体也应尽快解剖。看完这个视频，你应该对如何解剖小鼠垂体和准备不同发育阶段的垂体冠状切片有一个很好的了解。