Name: 将小鼠大脑显微切割成功能和解剖学上不同的区域 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习小鼠大脑显微切割技术，通过系统性解剖分离特定脑区，保持组织分子完整性以进行转录组分析。该方法为神经科学研究提供可重复的标准化流程。

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感谢Seshmalini Srinivasan女士、Stephen Butler先生和Pamela Spellman女士提供的实验协助，以及Dana Youssef女士对稿件的编辑。谨此感谢美国陆军医学研究与发展司令部（USAMRDC）提供的经费支持。本研究还得到了日内瓦基金会的贡献，并由美国陆军研究办公室通过军事与作战医学研究领域指挥部III提供的资金予以支持。
免责声明：
材料已通过沃尔特·里德陆军研究所审查，对其展示和/或发表无异议。本文所含观点或主张仅为作者个人见解，不应被视为官方立场，亦不代表美国陆军部或国防部的真实观点。研究是在经批准的动物使用方案下，于AAALAC认证机构中开展的。&#160;符合《动物福利法》及其他有关动物及动物实验的联邦法规和条例的认证机构，并遵循下述声明中的原则 实验动物护理和使用的指南，NRC出版物，2011年版。

动物饲养和实验操作均遵循欧洲、国家和机构层面的动物护理指南。所有动物实验均经美国陆军环境健康研究中心（现为沃尔特·里德陆军研究所，WRAIR）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在获得国际实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）认证的设施中进行。 
注意：实验将使用通过颈椎脱位法处死的6至8周龄雄性C57BL/6j品系小鼠进行16本实验室未进行灌注操作，但本方案可能&#160;可进行修改，以通过灌注清除血管中的血液&#160;可进行操作。解剖所需的所有耗材均已列于下文 材料表解剖过程分为三个部分，包括&#160;脑的取出、垂体的摘除以及脑组织的解剖。脑组织采集的目的是在提取RNA后，将其用于转录组学分析。一旦完成特定脑区的解剖，我们立即把各脑区组织转移至预先标记好的冻存管中，随后将冻存管置于液氮或-80 °C保存。 
注意：进行此操作需要具备扎实的神经解剖学知识。必须学习并掌握脑组织的水平切面、纵向切面以及常规的横断切面。由于脑组织降解速度极快，操作过程中没有时间查阅解剖图谱。
1. 小鼠脑组织取出
<ol>
	<li>用止血钳夹住离体头部的上颌（图2i），并用纱布垫将头皮进一步向前推移，以在颅骨背侧形成干燥的操作区域（图2ii）。</li>
	<li>将精细弯剪插入枕骨大孔，以分离附着的脑膜。此处应将剪刀插入颅底的枕骨大孔开口，即脊髓穿出的位置，剪刀尖端垂直朝上（12点钟方向），紧贴基底骨（即枕鳞）内表面并与其平行，然后将剪刀刀片向左侧旋转45°，再向右侧旋转45°。</li>
	<li>继续旋转手腕，撬起基底骨，从残留骨质的中线剪开，并延伸至枕骨和顶间骨，左右撬动直至完全去除。以类似方式去除枕骨和顶间骨，以暴露小脑。 
	注意：此时可去除位于颅骨腹侧后部、包裹中耳和内耳部分结构的空心骨性结构——鼓泡，除非正在进行垂体前叶和后叶的解剖（图2iii）。</li>
	<li>使用弯头锐利剪刀去除颞嵴上的肌肉附着。将弯头锐利剪刀的一侧刀臂置于人字缝下方，插入横窦与矢状窦的交汇处（图2iv）。</li>
	<li>沿正中矢状缝将剪刀向前推进至前囟，同时小心向上提起，轻柔地剪开该缝，避免损伤大脑皮层。此步骤是整个操作的关键（图2v）。</li>
	<li>此时抬起并旋转顶骨，刮除骨内表面残留的脑膜附着物。抓住颞骨向外撬开，远离脑组织。使用弯剪或咬骨钳从两侧进入眼眶，沿与眶嵴成直角的方向行冠状位剪切，但不得超过中线（图2vii）。</li>
	<li>在矢状面上做两条平行切口，间距约4 mm（图2viii）。 
	注意：不要用单次操作同时切断两侧。</li>
	<li>去除额骨碎片时应避免损伤脑表面（图2ix）。此时可用精细剪刀剪开硬脑膜，该结构应可在嗅球之间清晰可见并易于操作。</li>
	<li>轻柔地将颅骨翻转，利用重力辅助脑组织脱离，同时继续识别并剪断残留的脑膜附着和颅神经。通过剪断连接于脑部的最大三叉神经（自颅盖基底部明显延伸而出）即可释放脑组织（图2x）。 
	&#8203;注意：将脑组织转移至冷盐溶液中（冰冻无RNase的柠檬酸钠溶液（0.9%）或生理盐水（0.9%）），以进行后续解剖。</li>
</ol>
2. 垂体前叶和垂体后叶的分离
注意：垂体被一层非常坚韧的、类似帐篷状的膜覆盖，该膜在左右三叉神经之间横向延伸形成一条脊状结构。垂体组织极为柔软而脆弱，因此建议在颅骨内原位分阶段分别解剖垂体的后叶和前叶。in situ（原位）分离后，应立即将相应的垂体组织转移至预先标记好的小瓶中，并将小瓶置于液氮中保存，若无液氮则最好保存于 -80 °C 环境中。垂体正好位于枕骨与基蝶骨交界处上方；若发生弯曲或变形，垂体的结构将遭到破坏。
<ol>
	<li>保持听泡完整，以确保垂体解剖结构完整且易于识别（图 2ix）。</li>
	<li>从颅骨其余部分分离垂体后叶，随后分离垂体前叶。</li>
	<li>在膜性小脑幕脊两侧各做极小的旁矢状切口，用超细镊子提起垂体后叶，注意不要破坏垂体前叶组织（图 2x）。</li>
	<li>在垂体前叶外侧缘与邻近三叉神经之间做矢状切口，随后取出垂体前叶（图 2x）。</li>
</ol>
3. 小鼠脑组织解剖
注意：在取出脑组织和垂体后，应立即在预冷的不锈钢板上进行进一步解剖（图3）。解剖完成后，将脑区组织转移至预先标记好的样品管中，并最好将样品管置于液氮中，否则应保存于-80 °C。自上而下法可获取的脑区结构（按操作顺序）可能包括以下部分：小脑（CB）、脑干/后脑（脑桥和延髓）（HB）、嗅球（OB）（作为附属嗅球）、内侧前额叶皮层（MPFC）、外侧前额叶皮层（FCX）、前部和后部纹状体（ST）、由伏隔核（NAC）和嗅结节（OT）组成的腹侧纹状体（VS）、隔区（SE）、视前区、梨状皮层（PFM）、下丘脑（HY）、杏仁核（AY）、海马（HC）、后扣带皮层（CNG）、内嗅皮层（ERC）、中脑（MB）（含丘脑）以及其余大脑皮层（ROC）（Table 1）。下文将按照分离顺序，以单侧大脑半球为例，逐一讨论特定脑区的处理方法。
<ol>
	<li>从颅骨中取出脑组织时需格外小心，以免损伤解剖标志，尤其应避免造成任何撕裂。此步骤操作时须佩戴面部防护装备， specifically 使用7倍放大头戴式额镜（7x jewelers visor），并由置于解剖者双肩上方的手术灯提供照明。大部分解剖操作将使用钝头小型弯镊（即Graefe镊）完成。</li>
	<li>将脑组织置于不锈钢板上（图 4i 和 图4ii）。将组织块置于冰和冰冻生理盐水中以保持低温。定期用冰冻生理盐水润湿组织，以保存其结构。</li>
	<li>将脑组织置于大脑皮层朝上的位置。使用小型弯头镊子，轻轻将小脑（CB）翻开，暴露小脑上、中、下脚，然后予以切除 CB (图 4iii 和 图 4iv).</li>
	<li>从背部开始，在正中矢状面进行切割 OB 和大脑半球（图4v）并确保不要超过前连合。此时，小脑蚓部可轻松与外侧部分分离 HB 将在脑桥前缘通过冠状切口获取。</li>
	<li>在脑桥后缘处进行冠状切面，分离延髓。 
	注意：此时，间脑（前脑的后部，包含上丘脑、丘脑、下丘脑、腹侧丘脑和第三脑室）将被翻转至腹侧朝上，并从视交叉处向前进行正中矢状切开。随后解剖分离大脑半球并予以移除 OB 来自其中一个半球的样本在此步骤中图 4v 和 图4vi).</li>
	<li>分离大脑半球（图4v) 在进一步解剖间脑之前（图 4v）。将采用背侧入路，通过精细的钝性分离以保护关键的中线解剖标志。在切断任何结构前，需先辨识每一条大脑半球间连接，以最大限度减少偏离中线的可能性。 
	注意：在此步骤中，其中一个大脑半球（半脑）可以被保存，而第二个半球可用于进一步解剖</li>
	<li>将小型弯头镊子的闭合镊尖插入胼胝体下方，轻轻撑开，以双侧牵开新皮层。胼胝体是一束宽阔的神经纤维，连接两侧大脑半球，可用镊子夹捏进行钝性分离，注意避免扰动其下方的中线结构。 
	注意：大脑半球内侧面可见多个标志结构，如胼胝体膝部、穹窿和前连合等有髓鞘结构。此外，虽位于中线外侧数毫米处，乳头丘脑束和后屈束也可能可见。</li>
	<li>横切穿过中线的多个结构，包括胼胝体、前连合、腹侧穹窿连合、后连合、背侧穹窿连合、乳头体上交叉、上丘连合、腹侧穹窿连合以及室周丘脑纤维。</li>
	<li>在此步骤中，需特别注意中线区域，该区域可能因背侧入路方法而部分受损。若操作不慎，所有后续结构均面临风险。</li>
	<li>移除&#160;OB （楔形且颜色较浅）以及副嗅球，随后进行采集 内侧前额叶皮层 （扣带皮层区域1、前肢部、下肢部、内侧眶部以及次级运动皮层 [M2]）和 FCX 在胼胝体膝部前方1毫米处进行冠状切开图 4vii）。沿从内侧到外侧表面距离的三分之一处进行矢状切分，得到 内侧前额叶皮层 内侧为FCX，外侧为FCX其余部分。扣带皮层是小鼠的MPFC对应区域。 
	注意：该组织切片还将包含少量M2（次级运动皮层） 17 且不可避免。</li>
	<li>在前连合水平做冠状切口，使所得冠状切片的头端面上可见前连合前肢部分的横截面，而尾端面则显示出其横行部分。此为确认该解剖位置的标志 NAC18。该 VS 由……组成 NAC 和 OT. 
	注意：前连合中除横行部分外，还存在一前肢，称为前连合前部（pars anterior）。</li>
	<li>从侧脑室前角下方中线处开始，沿前连合横行部分进行水平方向的不完全横切，以分离上方的隔核以及 VS 腹侧。从外侧表面去除少量皮层组织 NAC 和 OT 将被移除。</li>
	<li>分离前部脑区 ST 通过弯头手术刀从外囊外侧切开，分离其上方的皮层组织，注意避免将纹状体组织混入皮层样本中。此时，分离 septal 细胞核 /SE 将在此切片中可见，并可轻松获取图 4viii). 
	注意：前部与后部界限的 PFM 由分别与前连合和乳头体对齐的假想冠状面界定。内侧边界由外囊定义18.</li>
	<li>在间脑剩余半切面的外侧表面，沿嗅沟向尾侧做部分水平切口，但仅延伸至与乳头体水平的假想冠状面。在乳头体平面，从外侧皮质表面向内侧延伸1 mm，做部分冠状切口。 HY在此处，沿屏状核平面做矢状切口将释放 PFM (图 4ix 和 图4x). 
	注意：在间脑剩余半切部分的内侧面上，将可见多个解剖结构，包括乳头体、后屈束和髓纹。可见一呈半圆形（背侧凹面）的结构，标志着两者之间的边界 丘脑 和 HY。该 HY 在正中矢状切面视图上，可通过视交叉的前腹侧、前连合的前背侧以及后方的乳头体和缰核髓纹进行清晰辨认。上述解剖标志在图谱中已有清晰展示。17 以及在白化小鼠前脑组织中的情况19.</li>
	<li>在乳头体后方做一个冠状部分切口，仅延伸至下丘脑沟的外侧。此时，沿下丘脑沟全长进行矢状旁切口，即可游离 HY .</li>
	<li>翻转侧脑室以显露额外的边缘系统内部连接及剩余的边缘系统结构。观察间脑剩余半切面的内侧面时，使用弯钳是最佳选择，因其可使技术人员在周围其他精细结构间进行操作，便于切断穹窿，同时将弯钳插入侧脑室并轻轻扩张，通过钝性分离打开脑室并旋转 HC 从垂直方向向水平面旋转90°。可能需要使用#11刀片切开脉络膜动脉/脉络丛，因其尖端有助于进行精确切割。</li>
	<li>旋转 CNG 90°（但与之前方向相反） HC）置于水平面。使用镊子轻轻旋转 HC 再向外侧旋转180°，从而使内表面朝外 ERC 可见且朝上。</li>
	<li>呈扇形放射的有髓神经纤维，起源于 ERC 将汇聚形成角束，包括穿通路径及其与 HC. 旋转丘脑并 MB 从背侧向腹侧完全翻转180°以暴露 AY.</li>
	<li>如有需要，可抬起视束以显露终纹的附着处，因其含有沿丘脑室面外侧缘走行的纤维束，通往 AY 并绘制出轮廓 AY 澄清。 
	注意： HC 穹窿和侧脑室将完全清晰可见，嵌于侧脑室内，可轻松取出。侧脑室内壁由软脑膜衬覆，并通过极为透明的软脑膜下区域显现出穿通束呈扇形的起始部 ERC 将可见20.</li>
	<li>内侧的外表面 ERC 将可见一层明显的大型锥体细胞。此外，高尔基染色纤维的密集汇聚将是内侧区的一个显著特征 ERC在该解剖步骤中，外翻侧脑室后，这些纤维将透过衬于脑室内部表面的软脑膜，在内侧表面清晰可见，形成一个非常显著的扇形结构。</li>
	<li>注意观察纤维在皮层下聚集，向下延伸并离开腹侧 ERC，向后延伸，然后垂直上行并穿行 HC。这种扇形结构在 内质网-线粒体接触位点 将用于界定解剖范围。按顺序识别并移除 AY, ERC, CNG 和 HC 结构 
	注意：定义一个良好的解剖标志对于 AY 解剖将是下一步的关键，以及终纹与后缘交界处的连接点 AY 将是一个很好的切入点。</li>
	<li>此时，剩余的结构包括 丘脑 和 MB通过观察位于其背侧表面、沿中线前后平面延伸的髓纹来确认丘脑的辨认。分离 丘脑 完全从 中脑 在丘脑后部与上丘之间进行冠状切口。 中国台湾 在此步骤中保存。</li>
	<li>此时应完整收集所有脑区组织，并立即（每获得一个样本后）将样品速冻保存，直至进一步处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

哺乳动物的大脑是一个复杂的器官，由多种形态各异、功能独特、分子特征多样且执行专门而独立功能的多个脑区组成。本文所报告的脑组织解剖方法可根据实验室的具体需求实现多种目标。在我们的实验室中，我们评估了暴露于类似创伤后应激障碍（PTSD）应激的小鼠多个脑区中的转录水平16。我们希望进一步研究小鼠品系遗传背景24对多个脑区基因表达水平的影响。本实验方案包含多个关键步骤，为确保实验的可重复性，这些步骤均需仔细考虑。大脑各个局部区域在神经病理状态下发挥着不同的作用，但目前尚缺乏关于应研究的特定脑区的详尽知识。因此，生成与脑区相关的数据集至关重要。这样，数据不仅可以按脑区进行查询，还可以按数据类别（例如转录组、蛋白质、细胞（细胞构筑）或其他）进行检索，从而获得更精确的信息。此前已有研究显示，可在显微镜下对新鲜大鼠脑组织中的嗅球、前额皮层、纹状体和海马等组织进行解剖25。另一种方法是在脑组织冷冻状态下进行切片解剖14，随后提取RNA和蛋白质，但该方法仅适用于具有明...

大脑与脊髓和视网膜共同构成&#160;中枢神经系统，该系统通过遍布全身的特化、精确定位且相互作用的细胞类型来执行复杂行为1。大脑是一个复杂的器官，包含数十亿个相互连接的神经元和胶质细胞，具有精确的神经回路，执行多种功能。大脑呈两侧对称结构，具有两个不同的半球以及多样的细胞成分2。脊髓连接大脑与外界，受到骨骼、脑膜和脑脊液的保护，并负责向大脑传递和接收信息2,3,4。大脑表面即大脑皮层，表面凹凸不平，具有明显的褶皱结构，凸起部分称为脑回，凹陷部分称为脑沟，这些结构将大脑划分为不同的功能区域5。在脑体积较小的哺乳动物中，皮层表面较为光滑6,7。研究和表征人类大脑的结构对于理解不同脑区相关疾病及其功能回路至关重要。近年来，神经科学研究不断拓展，多种实验方法被用于研究大脑的结构与功能。分子生物学和系统生物学领域的进展开启了探索脑结构与分子功能之间复杂关系的新时代。此外，分子生物学、遗传学和表观遗传学的快速发展使我们能够深入理解系统功能背后的分子机制。这些分析可在更精细的局部层面进行，有助于精准定位研究方向，并推动更有效治疗策略的开发。
哺乳动物的大脑在结构上被明确划分为可清晰识别的独立区域；然而，这些独立结构的功能和分子复杂性尚未被充分理解。脑组织的多维和多层特性使得在功能层面研究这一结构变得困难。此外，同一脑区可执行多种功能，而不同脑区也可执行相同功能，这一事实进一步增加了理解大脑的复杂性8。因此，针对脑区结构与功能特征的研究方法必须采用精确的实验技术，以确保取样的一致性，从而将神经解剖学结构与功能相互关联。近年来，单细胞测序技术已被用于阐释大脑的复杂性9,10，例如人类大脑颞叶即由75种不同的细胞类型组成11。通过将这些数据与小鼠大脑对应区域进行比较，该研究不仅揭示了二者在结构和细胞类型上的相似性，也指出了其差异。因此，要解析这些复杂的机制，必须以高度精确的方式研究大脑的多个不同区域。人类与小鼠大脑之间在结构和功能上的保守性，使得小鼠可作为初步研究人类大脑功能及行为结果的替代模型。
随着系统生物学方法的进步，从啮齿类动物的特定脑区获取信息已成为神经科学研究中的关键步骤。尽管某些方案（如激光&#160;捕获&#160;显微切割12）成本较高，机械分离方案则经济实惠，且仅需使用常规实验工具即可完成13,14。我们已将多个脑区用于转录组分析15，并开发了一种快速、实用的实验操作流程，可在短时间内逐步分离小鼠目标脑区。分离后的组织样本可立即在低温条件下保存，以维持其核酸和蛋白质的完整性。我们的方法操作更迅速，效率更高，同时减少了组织降解的可能性，从而提高了利用脑组织开展高质量、可重复实验的成功率。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;脑组织取出&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deaver 剪刀</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6762</td><td>5.5&quot; 直尖/锐利</td></tr><tr><td>Deaver 剪刀</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6763</td><td>5.5&quot; 弯曲双刃/双刃</td></tr><tr><td>精细手术剪</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6703</td><td>4.75&quot; 弯曲双刃/双刃</td></tr><tr><td>精细手术剪</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6702</td><td>4.75&quot; 直尖/锐利</td></tr><tr><td>光控手术剪</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6753</td><td>5&quot; 弯曲的锐/锐</td></tr><tr><td>微型刮刀，两端为圆角和平头渐细设计</td><td></td><td></td><td>不锈钢镜面抛光</td></tr><tr><td>操作剪刀 6.5&quot;</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6846</td><td>弯曲双刃/双刃</td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-8160</td><td>4.5&amp;rdquo; 1×2 齿，2 mm 尖端宽度</td></tr><tr><td>刮刀（可选）</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-8321 多种款式可供选择</td><td>Lempert 咬骨钳 6.5&quot; 2X8毫米</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;垂体解剖&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-9843</td><td>#3号实心手术刀柄 4&quot;</td></tr><tr><td>和刀片</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-9801-11</td><td>无菌手术刀片：#11，100片/盒，40 mm</td></tr><tr><td>超细镊子 Inox</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-4955</td><td>尖端尺寸 0.025 X 0.005 mm</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;脑解剖&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>放大目镜</td><td>宾夕法尼亚工具公司</td><td>40-178-6</td><td>2.2倍外置与3.3倍内置透镜放大倍数，矩形放大镜</td></tr><tr><td>解剖冷板</td><td>Cellpath.com</td><td>JRI-0100-00A</td><td>冰山冷板 &amp;和；碱</td></tr><tr><td>格劳费镊子，全弧形超精细</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-5138</td><td>0.5 mm 尖端 4&amp;rdquo; （10 cm）长</td></tr><tr><td>手术用照明剪刀</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-6753</td><td>5&quot; 弯曲双刃/双刃</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-9843（上文重复）</td><td>#3 型实心手术刀柄 4&quot;</td></tr><tr><td>以及刀片（特别是 #11 型）</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-9801-11（上文已重复）</td><td>无菌手术刀片：#11，100片/盒，40毫米</td></tr><tr><td>刮刀</td><td>亚马逊</td><td>MS-SQRD9-4</td><td>双头刮刀，一端方形一端圆形</td></tr><tr><td>组织镊</td><td>Roboz 外科手术器械库</td><td>RS-8160（上文重复）</td><td>4.5&amp;rdquo; 1X2 齿</td></tr></tbody></table>

小鼠脑组织功能区与解剖区域的显微解剖

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

大脑是哺乳动物神经系统的指挥中心，也是一个具有巨大结构复杂性的器官。大脑受到颅骨的保护，其表面覆盖着被称为大脑皮层的灰质层，分布于两侧半球。在这层结构下方，还存在许多其他特化的结构，对维持生命所必需的多种生理现象至关重要。获取特定大体脑区的样本需要迅速而精确的解剖步骤。&#160;需要明确的是，在显微层面，存在众多亚区，这些亚区很可能跨越了我们为本次解剖所人为划定的区域边界。
小鼠模型被常规用于研究人类大脑功能及疾病。基因表达模式的变化可能局限于特定脑区，这些脑区与特定表型相关，并因疾病状态而异。因此，结合大脑明确的结构组织来研究转录调控具有重要意义。要全面理解大脑，必须研究不同的脑区，明确它们之间的连接，并识别各脑区活动中的关键差异。对这些不同脑区进行更深入的理解，可能为神经科学领域的新疗法和改进疗法开辟道路。本文中，我们讨论了一种将小鼠大脑分离为十六个不同区域的逐步操作方法。在该操作中，我们聚焦于雄性C57Bl/6J小鼠（6-8周龄）的大脑取出，并利用神经解剖学标志物识别和取样多个离散的、功能相关且行为相关的&#160;脑区。本研究将为神经科学领域奠定坚实基础，推动更聚焦的研究策略，以深入理解大脑功能。

我们对复杂大脑结构与功能的理解正在迅速发展和深化。大脑包含多个不同的区域，构建分子图谱有助于我们更好地理解大脑的工作机制。在本文中，我们介绍了将小鼠大脑解剖分离为多个不同区域的方法表1）。在本方案中，通过保留组织的坚固性并用生理盐水保持其湿润，以关键解剖标志为基础识别结构，从而实现即时解剖。该方法涵盖的区域较其他文献报道更为广泛21 并且与使用冷冻脑组织的解剖方法相辅相成22,23这些解剖获得的组织可根据研究需求进行保存并后续处理。本文所述方法为立即从颅骨中取出大脑，随后进行解剖，该方法可快速获取足量组织，适用于小鼠脑组织的下游检测。本团队已从多个解剖组织中提取RNA，并利用微阵列技术对脑组织（包括杏仁核、海马、内侧前额叶皮层、隔区、纹状体和腹侧纹状体）进行基因表达谱分析，相关结果已被发表。15. 这些收获的脑组织储存在 -80°C 在RNA提取前数月进行。该方法可与其他方法结合使用，以拓展脑...

本文介绍了一种快速、动手操作的逐步实验方案，用于小鼠脑组织的取出以及从新鲜脑组织中分离特定脑区。在许多神经科学研究实验室中，获取脑区用于分子分析已成为常规操作。这些脑区在分离后立即冷冻，以获得高质量的转录组数据，用于系统水平的分析。

大脑是哺乳动物神经系统的指挥中心，也是一个具有巨大结构复杂性的器官。它被颅骨保护着，大脑……

研究不同的脑区是理解大脑分子和结构复杂性的重要一步。本方案描述了一种系统性分离小鼠脑区的解剖方法。从脑解剖学的角度来看，这是一种自上而下的方法，易于重复操作。本方案的优势有两方面。首先，该方法为研究体积微小但功能关键的脑区的分子基础提供了机会。其次，整个解剖过程耗时足够短，可确保分子完整性的保留，这是进行后续分子检测的关键前提。该操作需要反复练习和精细操作。为保持结构标志的完整性，操作时机非常关键，通过适当的培训和练习可以掌握。本次小鼠脑组织取出操作将由本实验室的研究化学家兼生物信息学家 Seid Muhie 进行示范。接下来，由本实验室的神经科学家 James Meyerhoff 演示小鼠脑组织解剖的操作流程。首先，清理并去除皮肤以获得良好的操作抓握。用止血钳夹住断头后颅骨的上颌部位，并用纱布将头皮向前（吻侧）翻起。将精细的弯剪插入枕骨大孔，以分离附着的脑膜。然后将剪刀插入颅底脊髓穿过的开口处，刀刃垂直朝向，但与基底骨内表面平行并紧贴其内壁，先将刀刃向左侧旋转45度，再向右侧旋转45度。去除顶骨内的枕骨部分，以暴露小脑。沿中矢状缝将剪刀向前推进至前囟，通过向上抬起的方式剪断，以避免损伤大脑皮层。抬起顶骨时，辨认并切断残余的脑膜附着。在矢状面上做两个平行切口，移除额骨碎片，注意避免损伤脑表面。在切断脑膜附着物和颅神经时，将颅骨翻转，使重力有助于将脑组织移入预先装有生理盐水的小杯中。保持听泡完整，以便识别垂体解剖结构。在固定垂体位置的膜性小脑幕脊两侧各做一个极小的旁矢状切口，并用超细镊子轻轻提起垂体后叶。在垂体前叶外侧缘与邻近的三叉神经之间进行矢状切口，然后取出垂体前叶。将白光光源对准组织。将脑组织置于预先冷却的不锈钢块上，并通过在冰盐水中周围放置冰块以保持钢块低温。定期用冰冷的生理盐水湿润组织，以保存结构。将脑组织放置成大脑皮层朝上的位置。使用小型弯头镊子，去除小脑。采用背侧入路，将小型弯头镊子的闭合镊尖滑至胼胝体下方，轻轻撑开以双侧牵开新皮层，从而保护关键的中线解剖标志。最终将脑腹面朝上，可观察到视交叉、下丘脑、嗅球、延髓、垂体柄和脑桥等结构。尝试分离两侧半球。将脑腹面朝上放置，从大脑半球嗅球之间的背侧开始，沿正中矢状面进行切割。去除延髓，然后轻轻分离两个半球。接着，在脑桥的内侧边缘处做一冠状切面，以获取后脑，并在脑桥的后缘处分离延髓。翻转脑组织，小心分离两侧大脑半球。在此步骤中去除嗅球。在胼胝体膝部前方一毫米处进行冠状切面切割，去除副嗅球，随后分离内侧和外侧前额叶皮层。从侧脑室前角下方的中线处开始，水平或冠状切开前连合的横行部分，直至背侧松解隔核，腹侧松解腹侧纹状体。去除外侧表面少量皮层，以移除伏隔核和嗅结节。使用弯头手术刀在外部囊膜外侧稍远处做弧形切口，将尾状核的前部与覆盖其上的皮层分离。识别隔核或隔区，并从此切片中分离出来。在此步骤中，通过弯曲切口分离下丘脑，具体操作为：在乳头体后方进行部分冠状切口，切口仅延伸至下丘脑沟的外侧边界。然后沿下丘脑沟的全长做一旁矢状切口，游离下丘脑横断面。外翻侧脑室，以显露剩余边缘系统结构中的其他边缘内连接。在内侧皮质的内侧面，打开脑室后可观察到一种扇形结构。利用内嗅皮层中的扇形结构来界定解剖边界，随后识别并切除杏仁核、内嗅皮层、后扣带皮层和海马。通过观察位于丘脑背侧表面、沿中线向前延伸至额叶皮层平面的髓纹，确认丘脑的定位。通过冠状切面将丘脑与中脑完全分离。本方案可用于立即从颅骨中取出脑组织，随后进行解剖。根据研究需求，解剖所得的组织可保存并在后续进行处理。可对多个解剖组织提取的RNA进行基因表达分析。代表性结果来自采集后在零下80摄氏度保存数月的大脑组织，随后进行RNA提取。在PTSD的攻击者暴露社会应激模型研究中，收集了不同脑区及其重量数据。此处展示了RNA浓度及分光光度计读数。在执行本方案时，应始终将脑组织置于冰冻的钢块上，并定期用冰冻的生理盐水冲洗组织，以确保组织保持低温。一旦组织被采集并立即冷冻，即可用于后续的转录组学、代谢组学和蛋白质组学等检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

将小鼠大脑显微切割成功能和解剖学上不同的区域

对小鼠脑部特定区域进行RNA表达谱分析，需要精确且可重复的组织采集策略。本文描述了一种结合冠状面脑切片与组织打孔器辅助显微解剖的技术方案。从所获样本中提取的总RNA产量与质量验证了该方法的实用性。...

一种无需激光捕获显微切割的小鼠脑区精细分离方法，用于总RNA提取及后续的高通量测序与基因表达谱分析

本视频演示了使用双琥珀酰亚胺基辛二酸酯（Bis-sulfosuccinimidyl...

利用化学交联实验在小鼠脑组织中交联神经元表面蛋白

本视频演示了制备小鼠冷冻脑组织切片以用于下游分析的详细逐步操作流程。...

小鼠脑组织的下游分析处理

本文中，我们详细描述了以高分辨率重建荧光标记小鼠大脑精细脑解剖结构的完整实验流程。所述方案包括样本制备与透明化处理、成像用样本的装载、数据后处理以及多尺度可视化。...

利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

通过采用多个角度切割小鼠仔鼠脑组织，我们改进了先前描述的一种急性脑切片方法，该方法能够捕获大多数主要听觉中脑与前脑结构之间的连接。...

小鼠上丘-丘脑-皮层脑片的改良制备，结合 chamber 部件的 3D 打印与多尺度光学成像

本实验方案描述了利用廉价且常见的工具采集离散的冷冻脑区，以获得高质量蛋白质和RNA的方法。...

用于后续分析的冷冻啮齿类动物脑区采集

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

不同的小脑区域被认为在特定行为输出中发挥重要作用，但其潜在的分子机制仍不清楚。本研究描述了一种可重复且快速分离小脑半球皮层、蚓部前部和后部区域以及小脑深部核团的方法，以便通过分离RNA并检测基因表达差异，探究这些区域间的分子差异。...

小脑区域解剖用于分子分析

冷冻切片显微切割技术可对小鼠大脑中最大的神经发生微环境进行新鲜冷冻制备，用于深度定量蛋白质组学分析。该方法精确、高效，且对组织扰动极小，因此非常适用于研究该微环境以及其他器官、区域和物种的分子微环境。...

成年小鼠室管膜下区冷冻切片显微解剖用于精确深度定量蛋白质组分析

脉络丛（CP）是神经科学中一个研究尚不充分的组织，在中枢神经系统的健康与疾病中发挥着关键作用。本方案描述了一种用于分离脉络丛的显微解剖技术，并介绍了利用扫描电子显微镜获取其细胞结构整体图像的方法。...

小鼠脉络丛的显微解剖与整体封片扫描电镜可视化

学习小鼠大脑显微切割技术，通过系统性解剖分离特定脑区，保持组织分子完整性以进行转录组分析。该方法为神经科学研究提供可重复的标准化流程。

小鼠脑组织功能区与解剖区域的显微解剖

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