多井板膜插入系统中3D 组织模型渗透扩散的测定与模拟方法
2018年2月23日
提出了一种用于多井板和在硅片中的膜插入系统中渗透率的测定方法, 并利用仿真对扩散系数进行了优化计算。
该协议的总体目标是确定小型膜插入系统中 3D 皮肤模型的渗透率和扩散系数。这些问题有助于回答有关制药和化妆品应用 3D 皮肤组织工程的关键问题，其中渗透率和扩散系数是必不可少的质量因素。该技术的主要优点是它允许在小型多孔插件内直接测量这些系数。
仿真中的小型膜插入系统可以进一步修改，以便在船舶设备上的器官和其他使用膜插入系统的应用程序中使用。要制备琼脂糖凝胶，首先将 28.6 微升新鲜制备的 80 摄氏度液体琼脂糖凝胶涂在 96 孔膜嵌入系统的每个膜上。10 分钟后，凝胶将凝固，可用于渗透性测定。
要制备胶原细胞模型，首先在冰上混合 125 微升 HBSS 和 1 毫升胶原蛋白 R 溶液，然后用氢氧化钠中和。接下来，向混合物中加入 125 微升悬浮在完全培养基中的原代成纤维细胞。并将 28.6 微升所得细胞溶液添加到新的 96 孔膜嵌入系统的每个孔中。
在细胞培养箱中放置 30 分钟后，向凝胶表面添加 75 μL 完全培养基，向每个孔底部添加 300 μL 完全培养基，在细胞培养箱中孵育过夜。第二天，将培养基替换为 75 μL 人成人低钙、高温角质形成细胞到每个胶原细胞模型中，并将板放回细胞培养箱中再放置三天。第四天，从细胞模型表面吸出培养基，并将板放回培养箱中再放置 7 天。
要进行通透性测定，将 75 μL 供体物质分配到感兴趣的小孔插入模型系统中，并将 300 μL 受体物质添加到每个孔的底部。将板放在摇床上，在 37 摄氏度、95% 湿度和大约 480 RPM 的转速下放置 5 小时，每小时将膜插入系统转移到空的 96 孔板中，并在读板器上测量实验板底部孔内的漫射荧光。在渗透率实验结束时，打开相应的建模软件并启动新模型。
选择 Model Wizard 和 3D model。添加 Transport of Dipureed Species，然后单击 study。然后选择 Time Dependent 并单击 done。
在 Global Definitions 下，右键单击以添加参数，然后在网格中输入几何和物理参数。从实验中设置膜插入系统的几何形状，然后右键单击 Definitions 添加两个结构域探针，选择一个探针作为受体结构域，另一个作为供体结构域。将两个域都设置为平均值，表达式为 C，单位为 mols/米立方。
并在传递属性 1 和稀物质传递下设置扩散系数。右键单击 transport of dipureed species（稀释物质的传递），添加第二个传递属性 2，并在域选择中选择第二个障碍。在稀释物质的传递下，对于初始值 1，将浓度定义为零。
右键单击 transport of dilued species 以添加第二个初始值 2，然后选择供体作为第三个结构域。将浓度设置为荧光供体物质的初始浓度。右键单击 transport of dipureed species 以添加对称性 1，然后选择反映整个几何的边界选择的所有表面。
右键单击网格以添加两个自由四面体，并将第二个障碍设置为域。右键单击自由四面体 1，将预定义网格的大小添加到超精细网格。在第二个自由四面体中，将受体和供体设置为域，并将预定义的网格设置为更细化。
然后在研究 1 下，单击 compute 开始模拟。要将扩散系数与扩散模拟生成的数据拟合，请打开 add psychic （添加心理） 菜单并选择 mathematics （数学）。找到 optimization 和 sensitivity。
选择 optimization 并单击 add to component。然后右键单击定义以添加变量并手动输入表 3 中的变量。接下来，在组件耦合菜单下，右键单击定义，添加 average 1，然后手动添加 acceptor 作为运算符名称，然后选择 domain 1。
将实验数据导出到新的文本文档中。使用分号将数据分隔为多列，使用换行符将数据分隔为多行。右键单击 optimization（优化）以添加全局最小二乘目标，并将文本文档附加到实验数据。
单击 global least squares objective 将第一列定义为时间列 1，将第二列定义为值列 1。在 expression of value 列中，输入变量 C.右键单击 optimization 以添加全局控制变量 1。并将 D 下划线搜索声明为初始值为 1、下限为零、上限为 1， 000 的变量。
右键单击研究 1 以添加优化。并选择 SNOPT 作为优化求解器方法。将最优性容差设置为 1 的负 8 次方。
然后将障碍上的扩散系数设置为 D，将研究下的仿真时间设置从 0 秒到 22， 000 秒，间隔为 100 秒，然后单击 compute 开始参数优化。胶原细胞模型的组织学分析显示中央基质内成纤维细胞有轻微染色。在胶原蛋白基质的顶部，可以观察到一层包含许多细胞核，可能由人类成人低钙、高温角质形成细胞组成。
使用荧光素钠盐和荧光素异乙氰酸酯葡聚糖验证扩散物质分子大小的影响，表明对于小分子尺寸，两种分子的模拟和实验数据都非常一致。然而，较大的分子大小在模拟中的曲线进程中产生更高的偏差，表明图形的开始延迟和后期过程的上升幅度更大。事实上，渗透系数随着分子大小的增加而降低，模拟系数的行为与实验渗透系数相似。
值得注意的是，与没有人类成人低钙、高温角质形成细胞的模型相比，大多数使用人类成人低钙、高温角质形成细胞的模型具有较低的渗透和扩散系数。胶原蛋白模拟模型可以在 11 到 12 天内建立，如果执行得当，渗透测量可以在 6 小时内完成。在执行该程序时，重要的是要保持边界条件（如温度、填充体积、应用物质的浓度、湿度和膜过程）恒定，以减少渗透系数的变化。
借助此模块仿真，可以减少实验工作量，并可以预测长期性能。它也可以适用于其他渗透装置或器官所有权系统。这项技术为制药和化妆品应用领域的研究人员以及组织工程中的相互作用开发铺平了道路，以探索人造组织中的扩散渗透过程。
概述
本协议描述了一种使用小型膜插入系统来确定3D皮肤模型的渗透性和扩散系数的方法。这种技术对于推进制药和化妆品应用中的3D皮肤组织工程至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 组织工程
背景
- 理解渗透性和扩散系数对于评估皮肤模型至关重要。
- 3D皮肤组织工程对于制药和化妆品应用至关重要。
- 小型膜插入系统允许直接测量这些系数。
- 这种方法可以适用于器官芯片设备。
研究目的
- 测量3D皮肤模型中的渗透性和扩散系数。
- 优化扩散模拟的参数。
- 提高皮肤组织工程应用的质量。
使用的方法
- 在96孔膜插入系统中准备琼脂糖凝胶和胶原蛋白细胞模型。
- 使用供体和受体物质进行渗透性测定。
- 使用建模软件进行模拟和参数优化。
- 进行组织学分析以评估细胞模型的完整性。
主要结果
- 成功测量了3D皮肤模型中的扩散系数。
- 验证了分子大小对渗透性的影响。
- 优化了准确扩散模拟的参数。
- 组织学分析显示了适当的细胞模型特征。
结论
- 膜插入系统对于渗透性测定是有效的。
- 这种方法可以适用于组织工程的各种应用。
- 进一步的优化可以提高扩散系数计算的准确性。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables direct measurement of permeability and diffusion coefficients in 3D skin models using a small membrane insert system, addressing a key bottleneck in early-stage substance screening. By providing quantitative, reproducible data in a multi-well format, it supports target validation and assay development for topical and systemic drug candidates. The integrated simulation capability reduces experimental burden while enhancing predictive confidence in permeation behavior across molecular sizes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying substance permeation through skin-equivalent models.
- Operational Value: Provides functional validation of barrier properties in 3D tissue models without requiring large-scale Franz diffusion cells.
- Predictive Value: Supports lead identification by ranking compounds based on permeability coefficients derived from empirical data.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized, quantitative permeability outputs suitable for high-throughput screening in 96-well formats.
- Reproducibility: Ensures consistent diffusion measurements through controlled boundary conditions and normalized acceptor/donor domain probing.
- Scalability: Adaptable to different insert diameters (4.26 mm and 12.2 mm) and extensible to organ-on-a-chip configurations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses collagen-cell models with fibroblasts and keratinocytes to mimic human skin architecture for mechanistic de-risking.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by simulating long-term permeation profiles from short-term assays.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables permeability-based go/no-go criteria prior to in vivo testing, reducing late-stage attrition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early biological screening to lead optimization, particularly for dermal and transdermal drug delivery programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on barrier function and molecular transport in engineered tissues.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible fluorescence-based quantification in acceptor chambers.
- Analytics: Generates time-resolved concentration data for diffusion coefficient optimization via global least squares fitting.
- Translational Research: Connects short-term permeability measurements to predictive modeling of long-term substance retention.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable simulation-experimental workflow applicable across multiple permeation devices and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in permeation pathways by correlating molecular size with diffusion behavior.
- Operational Value: Standardizes permeability testing across laboratories via defined gel preparation, incubation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent use and instrument time through simulation-guided experimentation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization of topical formulations based on validated permeability thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, fluorescence-based assays, and computational modeling (e.g., COMSOL).
- Depends on plate readers, shakers with precise RPM control, and membrane insert systems compatible with 96-well formats.
- Necessitates cross-team standardization of substance concentration, temperature, humidity, and incubation timing.
- Involves adaptation considerations when extending to complex models such as organ-on-a-chip or multi-layered tissues.
- Limited by simulation accuracy for substances exceeding 14 x 10^-10 m Stokes radius, as noted in divergence between model and experimental data.
