三维细胞培养模式的测量肿瘤细胞浸润间质流体流动的影响

该程序的目的是将 3D 培养的细胞暴露于间质液流中，并量化流介导的对细胞侵袭的影响。这是通过首先制备由 1 型胶原蛋白和基质胶组成的凝胶溶液来实现的。第二步是将指定浓度的细胞添加到凝胶溶液中。

接下来，将细胞悬液加入直径为 12 毫米、孔径为 8 微米的 transwell 中，并在 37 摄氏度下孵育直至基质凝胶化。检测设置的最后一步是向 transwell 中添加特定量的培养基，以创建静态和流动条件。24 小时后，固定、染色和观察 transwell 膜，以定量侵袭细胞的数量。

与现有方法（例如微流体、间质流室）相比，该技术的主要优点是它不需要泵或专用设备，并且它允许研究人员轻松快速地测试多种条件或治疗方法。虽然这种方法可以提供对细胞迁移和侵袭的见解，但它也可以用于或应用于研究间质液流动对其他相关细胞行为的影响，例如蛋白质表达、细胞增殖和细胞信号传导的改变。演示此程序将是 LIMA 两 chaa。

我实验室的研究生 通过将一小份 matri 凝胶扔在 4 摄氏度的冰上来开始这个程序。接下来，用 PBS 无菌水、氢氧化钠、基质胶和大鼠尾 1 型胶原蛋白制备凝胶配方。然后以相同的顺序在冰上混合凝胶的成分，并在 4 摄氏度下孵育最终溶液 1 小时。

现在使用一对消毒的镊子将直径为 12 毫米的 8 个 micro po 细胞培养插入物放入 12 孔板中。然后计数细胞，以 5 乘以 10 至 6 个细胞/毫升的 5 倍重悬于无血清培养基中，将 100 微升细胞悬液添加到 900 微升凝胶溶液中。之后，通过轻轻上下吹打将它们彻底混合。

随后，向每个插入物中加入 150 微升最终混合物。然后将插入物转移到 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中 30 分钟，直到凝胶聚合。对于静态条件，在凝胶顶部添加 100 μL 无血清培养基，在插入物下添加 1， 200 μL 无血清培养基。

孔中插件内部和外部的液位应大致相等，从而使凝胶上的压差最小，并且没有间质流。对于流式条件，在插入物下添加 100 μL 无血清培养基，在凝胶上方添加 650 μL 无血清培养基。同时，尽量避免在插入室下方产生任何气泡，因为它们会阻止细胞在这些位置通过膜迁移。

然后将板放入 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中 24 小时。在此步骤中，将 500 微升每孔的 PBS 倍添加到新的 24 孔板中以清洗插入物。然后去除残留在 Flow Trends 井上部的培养基。

接下来，使用棉签从插入物上去除凝胶。擦拭膜表面的顶部以去除非 VA 细胞。然后将插入片段放入含有 1 倍 PBS 的 24 孔板中洗涤 15 秒。

之后，去除 PBS 并在每个插入物下方添加 500 微升 4% 对甲醛。在室温下孵育 30 分钟以固定反式迁移的细胞。然后去除 PFA 并用 500 微升一次 PBS 冲洗一次，以去除残留的固定剂。

接下来，在插入物下方加入 500 μL 0.5% Triton X 100 溶液，并在室温下孵育 10 分钟。为了渗透细胞，使用剃须刀片将膜从插入物上切下。然后将它们放入 100 微升 2 微克/毫升 DPI 的一次性 PBS 溶液中。

小心地将膜的底面朝下放置。DPI 溶液必须在使用前几分钟准备好并避光保存。现在用铝箔包裹板。

将其以 150 RPM 的转速放在摇床上室温下 30 分钟。然后在 500 μL PBS 中洗涤膜 1 次，并将其放回摇床上 10 分钟。要去除游离的 jy，请再重复洗涤两次。

下一步是将膜放在载玻片上，反式迁移的细胞朝上。将封固剂添加到膜中。然后用盖玻片盖住它们。

然后，将 dappy 染色数到细胞核并根据随附的手稿计算侵袭细胞的数量。该图显示了膜上反式迁移的 MDA MB 4 35 s 细胞。在间质液流侵袭试验后固定侵袭细胞，并用 DPI 和 Alexa Fluor 4 88 偶联的 foid in 染色，以促进侵袭细胞的计数。

这是明场下的膜，这是 dappy 染色核。此处显示了 F 肌动蛋白染色的 Alexa Fluor 4 88 foid。该图显示间质血流显着增强了 MDA MB 4 35 s 转移性黑色素瘤细胞的侵袭。

24 小时后，将结果归一化为静态侵袭条件的平均值，并显示 6 个细胞培养插入片段的平均值。条件之间的差异在统计意义上显著，P 值为 0.003。掌握后，可以在 2 小时内设置间质液流检测，然后孵育 24 小时，然后 2 小时固定和染色转化膜。

按照此程序，可以轻松提取细胞、蛋白质或核酸，以回答其他问题，例如基因和蛋白质表达如何响应间质液流动而变化。自开发以来，这已成为研究人员研究间质血流对癌细胞影响的重要检测方法。