Name: 三维细胞培养模式的测量肿瘤细胞浸润间质流体流动的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学习使用I型胶原蛋白和Matrigel凝胶结合Transwell小室，在三维细胞培养中施加间质液流并定量分析肿瘤细胞侵袭的方法。该技术无需专用泵设备，可快速测试多种实验条件，为研究肿瘤微环境中的流体动力学对癌症进展的影响提供了可重复的实验手段。

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1. 检测设置
<ol>
	<li>在冰上于 4 °C 条件下解冻少量 Matrigel（<500 μl，约需 2 小时）。</li>
	<li>配制凝胶溶液（参见下表中的示例体积）：10x PBS（终浓度为 1x，总体积中），1 N 氢氧化钠（添加量相当于胶原蛋白体积的 0.023 倍，或根据胶原蛋白生产商的建议适量添加），Matrigel 和 I 型胶原蛋白的终浓度分别为 1 mg/ml 和 1.3 mg/ml（可根据细胞类型和实验需求使用其他基质配方）。</li>
</ol>
凝胶配方示例
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>添加体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>10X</td>
			<td>1X</td>
			<td>0.090 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无菌水</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>0.346 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1N NaOH</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>0.008 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>9.90 mg/ml</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>0.101 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>大鼠尾部I型胶原蛋白</td>
			<td>3.66 mg/ml</td>
			<td>1.3 mg/ml</td>
			<td>0.355 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="3">
	<li>将凝胶组分在冰上按上述相同顺序混合，并将最终溶液在 4 °C 下孵育 1 小时。根据我们的经验，在接种细胞前进行 1 小时的孵育可使胶原蛋白凝胶更加均匀。务必始终将 Matrigel 和胶原蛋白置于冰上，并尽快操作，以防止提前凝胶化。</li>
	<li>使用灭菌镊子将直径为 12 mm、孔径为 8 μm 的细胞培养小室放入 12 孔板中。</li>
	<li>计数细胞，并将其重悬于无血清培养基中，浓度为 5 × 106 个细胞/ml（总体积应为凝胶溶液体积的 10%）。</li>
	<li>将 100 μl 细胞悬液加入 900 μl 凝胶溶液中（最终细胞浓度为 5 × 105 个细胞/ml），通过轻柔吹打充分混匀。</li>
	<li>将 150 μl 最终混合液加入每个小室中，转移至 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟，直至凝胶聚合。</li>
	<li>使用无血清培养基，</li>
</ol>
<ul>
	<li>对于静态条件，在凝胶上方加入 100 μl，在插入物下方加入 1200 μl。插入物内部和孔板外部的液面应大致相等，从而在凝胶两侧形成最小的压力差，且无间质流。</li>
	<li>对于流动条件，在插入物下方加入 100 μl，在凝胶上方加入 650 μl。注意避免插入物下方产生气泡，因为气泡会阻止细胞在这些位置通过膜迁移。这些液体体积产生的压力差约为 1.3 cm H2O（或 1 mm Hg）。</li>
</ul>
<ol start="9">
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
2. 细胞染色与计数
<ol>
	<li>在新的24孔板中每孔加入500 μl的1× PBS；用于洗涤插入式小室。</li>
	<li>移除流式小室上层残留的培养基并测定其体积。通过从最初加入的总体积650 μl中减去剩余体积，计算出总流出体积（用于后续流速计算，见下文）。使用棉签从插入式小室中去除凝胶，并擦拭膜的上表面以去除未侵袭的细胞。将插入式小室放入含有1× PBS的24孔板中，洗涤15秒。</li>
	<li>移除PBS，于每个插入式小室下方加入500 μl的4%多聚甲醛（PFA），室温孵育30分钟，以固定已迁移的细胞。</li>
	<li>移除PFA，用500 μl的1× PBS冲洗一次，以去除残留的固定剂。</li>
	<li>在插入式小室下方加入500 μl的0.5% Triton X-100溶液，室温孵育10分钟，以对细胞进行透膜处理。</li>
	<li>使用刀片将膜从插入式小室中切下，放入含有100 μl浓度为2 μg/ml DAPI的1× PBS溶液中，注意将膜的底面朝下放置（即已迁移细胞面朝下）。</li>
	<li>用铝箔纸包裹板子，置于摇床上，室温、150 rpm振荡染色30分钟。</li>
	<li>在摇床上用500 μl的1× PBS洗涤膜，每次10分钟，重复3次，以去除未结合的DAPI。</li>
	<li>将膜置于载玻片上，使已迁移的细胞面朝上，加入封片液并加盖盖玻片。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>在每张膜上随机选择5个位置，对DAPI染色的细胞核进行计数（避开边缘区域，使用10倍或20倍物镜）。</li>
	<li>计算平均细胞数，并使用以下公式计算侵袭率： 
	侵袭率 = 100% ×（平均细胞数 × 膜表面积）/（显微镜图像表面积 × 接种细胞数） 
	可将侵袭率相对于某一对照条件（通常为静态条件）进行归一化处理，以便在不同独立实验之间进行比较。</li>
	<li>计算平均流速：将流动条件下流出的总体积除以孵育时间（例如24小时）。</li>
	<li>计算平均流体速度：将平均流速除以凝胶/膜的横截面积（本例中为60 mm2）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
为了在间质流条件下测量肿瘤细胞的侵袭能力，我们使用 MDA-MB-435S 转移性黑色素瘤细胞进行了三维流动侵袭实验。已有研究表明，这些细胞可在间质液流的刺激下发生侵袭13-14。将细胞包埋于基质中，基质成分为 1.3 mg/ml 大鼠尾腱 I 型胶原蛋白和 1 mg/ml Matrigel 基底膜基质，最终细胞浓度为 5 × 105 个细胞/ml。比较了两种不同条件：（1）平均间质流速 = 0.1 μm s-1；（2）静态条件 = 无可测流速（图 1）。
24 小时后，穿过膜孔的细胞用 DAPI 染色以方便细胞计数。图 2 显示了穿膜细胞的代表性图像。在明场下，仅可见膜上的孔隙。通过荧光观察，使用 DAPI 染色的细胞核进行细胞计数，同时使用鬼笔环肽染色的 F-actin 结构来显示细胞体（可选）。采用假设方差相等的 Student t 检验，结果显示间质流使 MDA-MB-435S 细胞的侵袭能力相比静态条件显著增加了 2.3 倍（p = 0.003）（图 3）。该结果与先前研究报道的类似发现一致（但实验所用基质条件及相应流速不同），使用的是同一种细胞系13-14。
<img alt="静态平衡、肿瘤细胞迁移实验示意图，使用12孔板和8 μm插入式小室。" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 三维间质流体流动侵袭实验示意图。首先使用适当浓度和体积配制凝胶溶液。然后将细胞加入凝胶溶液中，并转移至细胞培养插入式小室。最后向每种条件下加入适当体积的培养基并进行孵育。间质流体流动由流体静压驱动。
<img alt="细胞成像；膜结构可视化，DAPI染色，鬼笔环肽结合；显微镜分析。" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 跨膜迁移的MDA-MB-435S细胞。在间质液流侵袭实验后，对已侵袭的细胞进行固定，并使用DAPI和Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽染色，以便于计数侵袭细胞；A）明场下膜的图像；B）DAPI染色的细胞核（蓝色）；C）Alexa Fluor 488-鬼笔环肽染色的F-actin（绿色）。比例尺为50 μm。
<img alt="静态和流动条件下归一化的侵袭能力柱状图；统计学显著性 p&lt;0.01。" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. MDA-MB-435S 细胞在流动条件下的侵袭能力增强。24 小时后，间质流动显著增强了细胞侵袭（p = 0.003）。结果以平均静态条件为基准进行归一化，数值代表 6 个细胞培养小室的均值 ± 标准误（SEM）。

<ol><li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland.+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li>
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<li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li>
<li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li>
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<li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li>
<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在此，我们描述了一种利用嵌于细胞培养插件中三维基质内的细胞，来定量分析间质流对肿瘤细胞侵袭作用的方法。此类方法及类似技术已被用于研究间质流对多种细胞类型的影响。 13-15, 17我们的方法通过使用含有上皮组织基底膜及周围间质中所含蛋白质的 I 型胶原和 Matrigel，部分模拟了肿瘤的基质微环境。 21-22该系统相对易于搭建，操作简便，且比大多数用于研究间质液流动的微流控装置更具成本效益。 体外 23-24无需泵或专用设备，且可同时检测多种条件。此外，其测量结果与常用的Boyden小室实验（常用于检测癌细胞侵袭和迁移）的结果具有可比性。
通过改变细胞类型和基质的组成，可以模拟不同的生物系统，例如乳腺癌13、血管15以及树突状细胞迁移17。改变基质的性质和组成并调节压力差，还可调控间质液流速度，从而根据所研究的生物系统灵活调整实验参数。该系统也可用于共培养实验14, 17。
<p class="jov...

<table><tbody><tr><td>胶原蛋白（大鼠尾）</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养小室</td><td>EMD Millipore</td><td>PI8P01250</td><td>8 &amp;mu;m 孔径，聚碳酸酯膜</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100M-8202</td><td>配制凝胶溶液时用 10×，洗涤步骤用 1×</td></tr><tr><td>氢氧化钠，1.0N 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>511150</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Cellgro</td><td>30002CI</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ml</td><td>PBS 中配制成 0.5%</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td>PBS 中配制成 4%</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>MP Biomedicals</td><td>0215757401</td><td>1 mg/ml 储存液</td></tr><tr><td>封片液</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-052-CI</td><td>保持无菌</td></tr></tbody></table>

用于测量间质流体流动对肿瘤细胞侵袭影响的三维细胞培养模型

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

大多数实体瘤的生长和进展依赖于癌细胞的初始转化及其对肿瘤微环境中基质相关信号的响应1。以往关于肿瘤微环境的研究主要集中在肿瘤细胞与基质之间的相互作用1-2。然而，肿瘤微环境还包括多种生物物理力，其影响目前仍知之甚少。这些力是肿瘤生长产生的生物力学结果，可导致基因表达、细胞分裂、分化和侵袭行为的改变3。在癌症进展过程中，基质密度4、刚度5-6和结构6-7、间质液压力8以及间质液流动8均会发生改变。
特别是与正常组织相比，肿瘤中的组织液流动更为显著8-10。据估计，组织液流动速度的测量值在 0.1–3 μm s-1 范围内，具体数值取决于肿瘤的大小和分化程度9, 11。这主要是由于肿瘤诱导的血管生成和血管通透性增加，导致组织液压力升高所致12。已有研究表明，组织液流动可促进癌细胞的侵袭13-14，以及成纤维细胞和血管平滑肌细胞的侵袭15。这种侵袭行为可能源于细胞在三维环境中周围形成的自分泌趋化梯度16，或基质金属蛋白酶（MMP）表达上调15、趋化因子分泌增加以及细胞黏附分子表达增强17。然而，细胞感知流体流动的机制目前尚不明确。除了改变肿瘤细胞的行为外，组织液流动还调节肿瘤微环境中其他细胞的活性，包括：（a）促进成纤维细胞向促进肿瘤发展的肌成纤维细胞分化18；（b）将抗原及其他可溶性因子运输至淋巴结19；（c）调节淋巴管内皮细胞的形态发生过程20。
此处介绍的技术对细胞施加间质液流动 体外 并量化其对侵袭的影响（图1该方法已在多项研究中发表，用于测量流体流动对基质细胞和癌细胞侵袭的影响 13-15, 17通过改变基质成分、细胞类型和细胞浓度，该方法可应用于其他疾病和生理系统，以研究间质流对细胞侵袭、分化、增殖和基因表达等细胞过程的影响。

实体瘤中的间质液流动增强，可调节肿瘤细胞的侵袭。本文介绍一种将间质液流动施加于嵌入基质中的细胞，进而测量其对细胞侵袭影响的技术。该技术可轻松适用于其他系统的相关研究。

大多数实体瘤的生长与进展依赖于癌细胞的初始转化及其对基质相关信号通路的响应……

本实验的目的是使三维培养的细胞暴露于间质液流中，并量化流体介导效应对细胞侵袭的影响。首先制备含有Ⅰ型胶原蛋白和基质胶（matrigel）的凝胶溶液，第二步是向凝胶溶液中加入特定浓度的细胞。接下来，将细胞悬液加入直径为12毫米、孔径为8微米的Transwell小室中，并在37摄氏度下孵育，直至基质凝胶。实验设置的最后一步是向Transwell小室中加入特定体积的培养基，以建立静态和流动条件。24小时后，对Transwell膜进行固定、染色，并观察以定量分析侵袭细胞的数量。与现有方法（如微流控、间质流体腔室）相比，该技术的主要优势在于无需使用泵或专用设备，且研究人员可方便、快速地测试多种条件或处理方式。尽管该方法可用于研究细胞迁移和侵袭行为，但也可用于或适用于探究间质液流对其他重要细胞行为的影响，例如蛋白质表达、细胞增殖以及细胞信号通路的改变。演示本实验操作的将是一位 LIMA two chaa。我实验室中的一名研究生开始该实验时，先将少量基质胶置于4°C的冰上。接着，使用PBS、无菌水、氢氧化钠、基质胶和大鼠尾部I型胶原蛋白配制凝胶溶液。然后在冰上按相同顺序混合凝胶各组分，并将最终溶液在4°C孵育一小时。现在使用一对灭菌镊子将一个直径为12毫米、孔径为8微米的细胞培养小室插入12孔板中。然后计数细胞，并将其重悬于无血清培养基中，浓度为每毫升5×10⁶个细胞，将100微升细胞悬液加入900微升凝胶溶液中。随后，通过轻轻吹打混匀。随后，将150 µL终末混合液加入每个插入物中。然后将插入物转移至37 °C、5% CO₂培养箱中孵育30分钟，直至凝胶聚合。对于静态条件，在凝胶上方加入100 µL无血清培养基，插入物下方加入1,200 µL。小室中插入物内部和外部的液面应大致相等，以使凝胶两侧的压力差最小化，并避免间质流动。对于流动条件，需在插入物下方加入 100 µL 无血清培养基，上方凝胶处加入 650 µL。同时，应尽量避免在插入物下方产生气泡，因为气泡会阻碍细胞在这些区域通过膜迁移。然后将培养板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育24小时。在此步骤中，向一个新的24孔板中每孔加入500 µL的1× PBS，用于洗涤小室插件。随后移除流式趋化小室上层残留的培养基。接下来，使用棉签从插入物中去除凝胶。擦拭膜表面的上层以去除非血管生成细胞。然后将插入物放入含有1倍PBS的24孔板中，孵育15秒以清洗插入物。随后，吸除 PBS，并在每个插入膜下方加入 500 µL 的 4% 多聚甲醛。于室温孵育 30 分钟，以固定迁移后的细胞。然后吸除多聚甲醛，用 500 µL PBS 洗涤一次，以去除残留的固定剂。接下来，在插入物下方加入 500 微升 0.5% Triton X-100 溶液，并在室温下孵育 10 分钟。为了通透细胞，使用刀片将膜从插入物上切割下来。然后将其放入含有 100 微升、每毫升含 2 微克 DPI 的 1× PBS 溶液中。注意将膜的底面朝下放置。DPI 溶液须在使用前几分钟配制，并避光保存。现在用铝箔纸将板包裹起来。将样品置于摇床中，150 RPM 室温振荡 30 分钟。随后用 500 微升 PBS 洗涤膜一次，并将膜重新放回摇床中振荡 10 分钟。为去除游离的 jy，再重复洗涤两次。下一步是将膜置于载玻片上，确保发生迁移的细胞面朝上。向膜上加入封片液，然后盖上盖玻片。随后，对染色的细胞核进行计数，并根据随附的文稿计算侵袭细胞的数量。该图显示了穿过膜的MDA-MB-435 s细胞。在间质液流侵袭实验后，将已侵袭的细胞固定，并使用DPI以及与Alexa Fluor 488偶联的鬼笔环肽（foidin）进行染色，以便于对侵袭细胞进行计数。这是明场下的膜，以及染色后呈斑点状的细胞核。此处显示的是用鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白，其荧光染料为 Alexa Fluor 488。该图表表明，间质流显著增强了 MDA-MB-435 s 转移性黑色素瘤细胞的侵袭能力。24小时后，结果将标准化为静态侵袭条件的平均值，并展示六个细胞培养小室的平均值。不同条件之间的差异具有统计学显著性，P值为0.003。一旦掌握，间质液流检测可在2小时内完成设置，随后进行24小时的孵育，再用2小时对转移膜进行固定和染色。通过该实验步骤，可轻松提取细胞、蛋白质或核酸，以回答更多问题，例如基因和蛋白质表达如何响应组织间液流动而发生变化。自建立以来，该方法已成为研究组织间液流动对癌细胞影响的科研人员所必需的一项关键检测手段。

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