Name: 改进方法对血脑屏障的人体细胞为主，接触模型的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T18:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解利用人星形胶质细胞与脑内皮细胞共培养构建血脑屏障体外模型的改进方法。该技术通过优化细胞接种方案，实现细胞牢固贴附与紧密连接，为研究血脑屏障通透性及药物递送提供可靠平台。

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本研究由澳大利亚国家健康与医学研究委员会授予 R.L.M. 的资助（资助号 # 606658）支持。

1. 细胞培养（在血脑屏障组装前3-7天）
1.1. 原代人脑微血管内皮细胞（BECs）
BEC细胞为商业获取。这些细胞通过中性蛋白酶消化正常人脑皮层组织获得，并以第3代冻存形式提供（&#60;12次群体倍增）。
<ol>
	<li>基质：按照生产商说明书，用&#34;Attachment Factor&#34;包被组织培养器皿。</li>
	<li>细胞培养：在含血清的完全培养基中维持脑微血管内皮细胞（BECs）。用于实验时，则在无血清完全培养基中培养BECs。将细胞置于37 °C、5% CO2、21% O2的湿润培养箱中培养。 
	注意：作为专用试剂的替代方案，可使用0.1%（w/v）明胶溶液作为包被试剂；同时可使用DMEM/F-12培养基，添加15 mM HEPES、10%（v/v）胎牛血清（FCS）、2 mM L-谷氨酰胺、50 µg/ml庆大霉素、20 µg/ml肝素和20 µg/ml内皮细胞生长补充物，用于BECs的维持培养。</li>
	<li>实验用细胞传代：根据下次使用时间（3–7天），将汇合的BECs按1:3至1:6的比例进行传代。每3天更换一次维持培养基。BECs使用代数不超过15代。</li>
</ol>
1.2. SVG 人胎儿星形胶质细胞系
SVG人胎儿星形胶质细胞22最初来源于经复制缺陷型猴病毒40（simian virus 40）转化的人胎儿脑组织原代培养细胞。
<ol>
	<li>维持培养：在最低必需培养基中培养 SVG 细胞，该培养基添加 Earle's 平衡盐溶液，并补充 20% (v/v) 胎牛血清（FCS）（与其亲代原代细胞维持所用血清浓度相同22）、2 mM L-谷氨酰胺、50 U/ml 青霉素和 50 µg/ml 链霉素。将细胞置于含 5% CO2、21% O2 的湿润培养箱中，于 37 °C 下培养。</li>
	<li>实验用细胞传代：根据下次使用时间（3–7 天）将汇合的 SVG 细胞按 1:5 至 1:10 的比例进行传代。由于培养基中血清含量较高，无需去除胰蛋白酶。每 3 天更换一次培养基。SVG 细胞可使用至第 20 代。</li>
</ol>
2. 人类细胞的组装与共培养 体外 血脑屏障模型（第0天）
评论人类 体外 根据已发表的方案制备接触型血脑屏障模型 13,23，加以修改。
2.1. 插入物的包被
<ol>
	<li>将组织培养小室（直径 6.5 mm，聚酯多孔膜，孔径 3 µm）放入提供的 24 孔板各孔中。对小室的管腔面进行包被<s> </s>在含大鼠 I 型胶原蛋白（20 µg/cm²）的湿润化 37 °C 培养箱中孵育过夜2；50 µl 含 132 µg/ml I 型胶原蛋白的溶液，溶于 0.02% 乙酸的 Milli-Q 水（MQH）中2O）用MQH从基底侧和管腔侧各清洗一次插入物。2O 以去除残留的酸。 
	注意： 脑毛细血管基底膜不含胶原蛋白I，主要由层粘连蛋白、IV型胶原蛋白亚型、nidogen和硫酸肝素蛋白聚糖组成9因此，一些研究人员使用胶原蛋白IV、纤连蛋白等包被试剂13，或 Matrigel（BD biosciences）16 以实现更真实的血脑屏障建模。</li>
</ol>
2.2. 在血管外膜（远腔面）膜表面接种 SVG
<ol>
	<li>将插入物倒置，并在多孔膜边缘轻轻套上一段短的弹性硅胶管&#34;外部管路&#34;；长约10 mm，内径8 mm，壁厚1.6 mm），在管腔外表面之上形成一个实质上的新孔腔（图2A).</li>
	<li>插入物的底部需要密封，以避免培养基泄漏。首先，准备一个塞子（图2A 和 2B）由硅胶管（称为 &#34;内部管路&#34;；长约 8 mm，内径 3.2 mm，壁厚 1.6 mm； 图 2B），一端密封 末端接一个塑料密封锥（长约3 mm；通过截取0.2 ml聚合酶链式反应（PCR）管底部制备）； 图2B). 该锥形结构不仅可封闭内部导管管腔，还可使其边缘扩大，以便更紧密地嵌入插入物中。接下来，使用无菌镊子将硅胶塞插入管腔内，并向前推进，直至其到达距膜约1-2 mm处。图2A).</li>
	<li>接下来，接种 4 x 104 将SVG细胞以200 µl SVG维持培养基（见上文第1.2.2节）直接接种至覆盖在血管外膜表面的硅胶小室中（图2A）。将SVGs放入培养箱中孵育至少4小时以使其贴壁。 
	注意： 为保持无菌，将组装好的插入物夹在两块6孔板之间转运（一块6孔板倒扣在另一块上）； 图2C) 以尽量减少操作过程中暴露于未过滤空气中的风险。硅胶管和硅胶塞用乙醇清洗后高压灭菌，以备后续使用。 
	注意： 仅对膜孔径大于1 µm的插入件使用插头（第2.2.2节）。孔径≤1 µm的膜极少发生泄漏，只需安装外部硅胶管（第2.2.1节）即可。此外，某些除I型胶原以外的包被试剂（参见第2.1节注释）甚至可防止通过3 µm孔径的泄漏。此情况需通过实验确定。</li>
	<li>为监测星形胶质细胞的贴壁状态，需将相同体积的星形胶质细胞悬液平行接种至标准96孔板中。该孔的表面积与6.5 mm插入式培养小室相同（0.33 cm²）。2）相比插入膜更便于通过相差显微镜观察细胞。当您在对照96孔板中观察到星形胶质细胞已充分贴壁时，表明星形胶质细胞在插入膜上也已充分贴附。</li>
	<li>当星形胶质细胞在对照96孔板中充分贴壁后，将插入式培养组件转移至组织培养超净台（见上述注释），轻柔移除外侧硅胶管和塞子。将插入式培养组件放回正常的（即 将细胞以直立方向接种至预置的孔中，每孔含800 µl BEC维持培养基（见上文第1.1.2节）。</li>
</ol>
2.3. 将脑微血管内皮细胞接种至星形胶质细胞上方的管腔室
在胶原蛋白包被的管腔表面接种 2×104 个 BEC，加入 200 μl 培养液，然后将插入板放回培养箱中。
2.4. 共培养
在实验前，将接种了SVG/BEC的插入式培养皿在BEC培养基中共同培养3天，期间不更换培养基。
3. 人血脑屏障模型的实验操作（第3天）
<ol>
	<li>为了刺激 体外 BBB 首次洗涤细胞时，分别用 600 µl 和 100 µl 无血清 BECs 培养基替换脉管外侧和管腔侧的培养基。</li>
	<li>再次吸出管腔内的培养基，并更换为含有刺激剂的100 µl无血清培养基。 
	注意： 如果需要刺激管腔外室（以激活） 体外 从星形胶质细胞区室中取出脑微血管内皮细胞培养板，吸除基底外侧培养基，并替换为600 μl含刺激因子的无血清培养基。</li>
	<li>每个实验组设三个复孔（因此，若进行管腔刺激，需要 3 × 100 µl，我们建议将试剂在无血清培养基中稀释至每组 350 µl 的终浓度，以尽量减少各孔之间的移液误差）。</li>
	<li>进行标记示踪剂的标准旁细胞和/或跨细胞通透性检测 16,24 （对于后者，我们使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的白蛋白）和/或跨上皮电阻（TEER）的测量 13,16,25 如先前所述。</li>
</ol>
为了校正不同实验间基础通透性的波动，需使用以下公式，将实验组的通透性变化相对于无细胞的包被插入物（作为空白对照，代表最大通透性）以及溶剂处理组进行分析：通透性（%最大值）=（实验组插入物的通透性值 - 溶剂处理组的平均通透性值）/（空白插入物的通透性值 - 溶剂处理组的平均通透性值）× 100。
4. 多孔膜上细胞的观察
注释：由于插入膜不透光，会干扰光线透过，因此通过相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜观察插入膜上的未染色细胞较为困难。为解决此问题，我们开发了多种针对插入膜上细胞的染色方法，可显著改善细胞在膜上的可视性。通常应在插入膜仍固定于插入装置并置于孔板中时进行染色。仅在染色步骤结束后，为封片需要时才将膜取出。
4.1. 苏木精染色
<ol>
	<li>用预冷的4%（w/v）多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS；130 mM NaCl，10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，pH 7.2）固定插件20分钟。用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将插件浸入0.1% Mayer's苏木精溶液中2分钟。</li>
	<li>用自来水轻轻洗涤插件（将插件浸入盛有自来水的烧杯中，并轻轻吸出多余水分）。将插件转移至Scott's自来水溶液（2 g/L NaHCO3，20 g/L MgSO4）中约20秒，直至出现理想的蓝色。再次用自来水洗涤插件（见第4.1.3节）。可选步骤：可在此处加入伊红染色，将插件浸入1%伊红溶液10秒，随后用自来水洗涤。</li>
	<li>将插件膜自然晾干。使用解剖刀（沿膜边缘切割）取下膜，并将其置于载玻片上用于明场成像 
	注意：若使用二正丁基邻苯二甲酸盐在二甲苯中的封片剂（DPX），则在取下和封片膜之前，需先用100%乙醇洗涤插件，再用二甲苯洗涤。</li>
</ol>
4.2. 扫描电子显微镜（SEM）
<ol>
	<li>用预冷的4% (w/v) PFA PBS溶液固定插入物20分钟，然后用PBS洗涤三次。</li>
	<li>用1%（w/v）四氧化锇的MQ水溶液对膜进行固定后处理，持续30分钟2O.</li>
	<li>用清水洗涤插入物（第4.1.3节），然后依次用递增浓度的乙醇梯度脱水（50%、70%、90%乙醇各5分钟，随后100%乙醇处理3次，每次10分钟）。</li>
	<li>用六甲基二硅氮烷（HMDS）与乙醇的混合液处理脱水的包埋块（1:2，然后2:1，各5分钟）。</li>
	<li>用100% HMDS处理插入片5分钟，空气干燥后置于干燥条件下保存。</li>
	<li>使用解剖刀将膜取出（沿膜边缘切割），并通过扫描电子显微镜观察膜结构。</li>
</ol>
4.3. 免疫荧光
<ol>
	<li>用预冷的4%（w/v）PBS多聚甲醛固定插入膜20分钟，然后在Tris缓冲盐水（TBS；50 mM Tris-HCl pH 7.6，154 mM NaCl，0.22 µm滤膜过滤）中洗涤一次。</li>
	<li>按照先前描述的方法26对插入膜上的细胞进行免疫染色。</li>
	<li>使用解剖刀切除膜（沿膜边缘切割），并将膜置于载玻片上，用荧光封片介质封片。通过荧光显微镜观察膜。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

脑部病理的医学研究面临诸多转化难题。例如，在急性缺血性卒中领域，许多在动物模型中显示巨大前景的药物在临床试验中均告失败38,39。这些令人失望的结果原因多样，包括临床前测试系统对人类卒中情况的模拟不充分，以及对动物实验结果的过度解读21。提高临床前研究结果向临床阶段转化预测价值的一种策略是进一步开发基于人源细胞的体外（in vitro）模型；这类模型可为筛选新药和新机制提供高效且经济的工具，并有助于更聚焦于具有临床相关性的研究方向21。在此背景下，本文详细描述了我们实验室建立一种人源接触性血脑屏障（BBB）模型的全过程，该模型采用新型组合方式，即利用永生化人源星形胶质细胞（SVGs）与人源原代脑微血管内皮细胞（BECs）共同构建，用于研究与卒中相关现象。
在静态条件（无流动）下，接触型血脑屏障（BBB）模型（图1）最接近in vivo的解剖结构，并且其屏障特性已被证明优于其他模型13,17,18</sup...

血脑屏障（BBB）是外周血液循环与中枢神经系统之间的一种特化界面，在维持脑内环境稳态中起着至关重要的作用。它主要由独特的大脑微血管内皮细胞（BECs）构成，这些细胞在多种细胞和非细胞成分（见下文）的功能性影响下，形成进入大脑的紧密而动态的门户。在生理条件下，血脑屏障可限制血液细胞、血浆成分以及可能具有神经毒性的有害物质进入脑组织。同时，血脑屏障在脑组织与血液循环之间选择性地交换关键离子和营养物质（如葡萄糖和氨基酸）以及代谢废物，从而精确维持脑内环境的稳定1,2。近年来，越来越多的研究表明，血脑屏障功能障碍出现在多种慢性脑部疾病中，例如神经退行性疾病或与炎症相关的疾病（如阿尔茨海默病和多发性硬化症）3，也见于缺血性脑卒中等急性病症4。
脑内皮细胞（BECs）独特的血脑屏障（BBB）特性主要由其脑内环境5诱导形成，尤其是星形胶质细胞的作用6,7。目前逐渐认识到，其他细胞类型，如周细胞8、神经元和小胶质细胞1,3，以及基底膜9，也支持BECs，并共同构成一个称为&#34;神经血管单元&#34;（NVU）的功能性结构，该结构可同时将神经元的代谢需求与其供血毛细血管相偶联10。
血脑屏障在病理情况中的作用机制促使了大量相关研究尝试 体外 用于协助血脑屏障相关研究的血脑屏障模型11,12这些模型旨在尽可能地模拟 体内 根据NVU原则的血脑屏障特征 体外 血脑屏障模型通常依赖于形成紧密连接的脑微血管内皮细胞单层（主要来源于牛）13，人类14，大鼠15，小鼠16，以及猪的17,18 起源），在多孔膜上与支持性星形胶质细胞共同培养（由Deli extensively reviewed） 等 200511).
星形胶质细胞可在非接触条件下培养于组织培养板孔的底部，与培养在膜上表面的脑微血管内皮细胞（BECs）通过培养基分隔，但可通过可溶性因子与BECs进行通讯16在更先进的、更接近血脑屏障解剖结构的模型中 体内，星形胶质细胞保持在接触条件下，并直接培养在膜的对侧，紧邻脑微血管内皮细胞（BECs）13,15,17 (图1）。这种结构允许BECs与星形胶质细胞之间发生物理接触，当星形胶质细胞的突起穿过孔径膜时即形成接触。重要的是，为实现真正的接触，膜孔直径应≥1µm，因为星形胶质细胞的终足无法通过更小的孔径。即 0.4 µm14,15值得注意的是，一些研究表明，接触式血脑屏障模型在跨内皮电阻（TEER）以及多种示踪剂的内皮通透性数值方面优于非接触式模型。13,17,18. 最近，许多系统中新增了一个培养基流动的维度 体外 用于对内皮施加剪切力以更接近模拟脑血管系统的血脑屏障模型12,19.
构建接触式血脑屏障（BBB）模型时需要克服的一个技术难题，是在多孔膜的血管外表面逆重力方向接种星形胶质细胞。以往的实验方案13,20中，仅将星形胶质细胞以少量培养基液滴的形式接种于倒置的插入式培养小室顶部，这种方法允许的接种时间较短（即 10分钟13或2小时20），而我们在实践中发现该时间不足以实现细胞的充分贴附。采用这种基本方法时，若要延长星形胶质细胞的贴附时间，就必须频繁打开培养箱以持续监测培养小室，从而导致温度、pH值和湿度的波动；此外，由于培养基会通过膜孔渗漏，尤其当使用孔径大于1 µm的膜时，容易造成细胞接种不均匀。
本文介绍了一种构建接触式血脑屏障（BBB）模型的通用方案。该实验流程包含一种在倒置的插入式培养小室上接种细胞的替代方法，可克服上述局限性。该方法允许星形胶质细胞在平衡的培养箱中长时间不受干扰地贴附于基底膜表面，从而实现星形胶质细胞的均匀接种，提高屏障质量，并最大限度减少不同插入小室之间的基础通透性差异。
由于人类细胞在与人类相关的研究中具有重要意义21，本文进一步展示了将原代人脑微血管内皮细胞（BECs）与永生化人星形胶质细胞相结合的新方法，用于构建具有高通量筛选能力的接触型人血脑屏障（BBB）模型。由于在多孔膜上观察细胞较为困难，本文还详细描述了染色技术，以辅助判断细胞在多孔膜上的汇合度及细胞形态。最后，本文举例说明了如何利用该人源性BBB模型研究组织型纤溶酶原激活物（t-PA）——即目前治疗急性缺血性脑卒中的唯一溶栓药物——对血脑屏障的影响。

<table><tbody><tr><td>黏附因子</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-210</td><td></td></tr><tr><td>脑微血管内皮细胞（BECs），原代，人源</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>完全培养基</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>4Z0-500</td><td>添加 CSC JetFuel</td></tr><tr><td>完全无血清培养基</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>SF-4Z0-500</td><td>添加 CSC RocketFue</td></tr><tr><td>含 15 mM HEPES 的 DMEM/F-12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂（牛源）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>外层硅胶管</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A080.016</td><td>Pumpsil 品牌，内径 8 mm，壁厚 1.6 mm</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>14-501F</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Pfizer</td><td></td><td>1,000 U/ml</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷（HMDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4875</td><td></td></tr><tr><td>人脑微血管内皮细胞</td><td>Cell-Systems Corporation</td><td>ACBRI 376</td><td></td></tr><tr><td>内层硅胶管</td><td>Watson-Marlow</td><td>913.A032.016</td><td>Pumpsil 品牌，内径 3.2 mm，壁厚 1.6 mm</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s 苏木精溶液</td><td>Amber Scientific</td><td>MH</td><td></td></tr><tr><td>含 Earle&amp;rsquo;s 平衡盐溶液的最低必需培养基</td><td>HyClone Laboratories</td><td>SH30244.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>大鼠 I 型胶原</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Cultrex 品牌</td></tr><tr><td>组织培养小室</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3472</td><td>Transwell 品牌，直径 6.5 mm，聚酯多孔膜，孔径 3 &amp;micro;m</td></tr></tbody></table>

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

血脑屏障（BBB）由具有选择性通透性但可适应性调节的脑毛细血管组成，可严格调控脑内环境。BBB功能障碍已被认为与多种脑部疾病的发病机制相关，因此迫切需要开发人类 体外 用于辅助临床相关研究的血脑屏障模型。在目前已报道的多种血脑屏障模型中，一种静态（无流动）接触型血脑屏障模型脱颖而出，该模型将星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞（BECs）共培养于多孔膜的两侧，具有简化且真实模拟血脑屏障的特点，并具备高通量筛选能力。然而，此类模型的构建仍存在若干技术难点。本文中，我们描述了一种利用原代人脑微血管内皮细胞与永生化人星形胶质细胞新型组合构建接触型人血脑屏障模型的实验方案。具体而言，我们详细介绍了一种创新性的倒置小室细胞接种方法，并说明了小室染色技术，同时举例展示了本模型在血脑屏障相关研究中的应用。

为了建立一种人类接触性血脑屏障模型，我们需要在多孔膜上共培养SVG细胞和BEC细胞 3 µm 孔径大小，已证实可允许星形胶质细胞终足通过并与内皮细胞接触14,15,27,28完整的接触模型示意图如图所示 图1 （左图示意图）。接触系统面临的主要技术难题在于需要在膜的非腔面（abluminal surface）上逆重力接种星形胶质细胞。我们通过在非腔面膜表面顶部构建一个可移除的硅胶小室，并将额外的硅胶塞插入腔内空间以防止培养基泄漏，成功解决了这一问题。图2）。该方法使SVG细胞获得了最佳且连续的接种时间（至少4小时），从而使其能够牢固地附着于多孔表面，同时细胞损失最小。事实上，接种后第3天，SVG细胞和BEC细胞均呈现融合状态，并均匀覆盖在膜表面，这一点通过苏木精染色的插入物图像判断（见第4.1节； 图3A，左侧面板）。此外，两种细胞类型在多孔膜上均维持了其细胞特异性标志物（SVG细胞中胶质纤维酸性蛋白呈弥散性染色模式）22 以及血管性血友病因子在 BECs 的 Weibel-Palade 小体...

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。

血脑屏障（BBB）由不透水但具有适应性的脑毛细血管组成，可严格调控脑内环境。BBB功能障碍会导致……

本实验旨在通过在多孔膜的两侧分别共培养星形胶质细胞和内皮细胞，以体外模拟血脑屏障。首先，用细胞外基质（如胶原蛋白）包被多孔膜的管腔面。将带有外部硅胶管和内部硅胶塞的倒置插件固定于膜的非管腔面上，形成一个位于膜非管腔面之上的可拆卸小室。现在将星形胶质细胞接种到倒置的插入式培养小室上，使其贴附于基底外侧表面。然后移除导管，将插入式培养小室恢复正常方向，放入含有培养基的孔板中。接着将内皮细胞接种到插入式培养小室的管腔侧隔室中，并与相对的星形胶质细胞进行共培养。最终，通过荧光示踪剂的通透性检测或跨内皮细胞电阻的记录，可用来测量体外血脑屏障在不同刺激因子作用下的通透性变化。本次实验操作将由我实验室的博士后 Barry Nigo 先生进行演示，他在攻读博士学位期间开发了这一改良的接种方案，并已用于模拟血脑屏障。在尝试了更为粗糙的接种方法后，我们最初萌生了改进该实验流程的想法，因为此前实验中常遇到培养基从插件间隙泄漏以及培养基体积过小等问题，令人十分困扰。这导致星形胶质细胞贴壁时间过短且不充分，我们正试图在实验步骤中解决这一问题。将组织培养小室放入24孔板的孔中。然后在每个小室内加入50 µL浓度为132 µg/mL的大鼠胶原蛋白，用于包被小室的腔面，于37 °C湿化培养箱中孵育过夜，以去除任何残留的酸，再用双蒸水清洗小室的基底膜面和腔面。然后将插入物倒置，并在多孔膜边缘轻轻套上一段短的弹性硅胶管，基本上在基底外侧表面形成一个新的小室，以密封底部。制备一个由硅胶管制成的塞子，其一端用0.2毫升PCR管的截断管尖密封。现在使用无菌镊子将硅胶塞插入管腔内，并推进至距离膜约一到两毫米处。接下来，在硅胶小室的基底膜表面上方，直接加入含有40,000个星形胶质细胞的200微升维持培养基。为了监测星形胶质细胞的贴壁状态，使用标准的96孔板，因其具有与6.5毫米插入膜相同的表面积，并便于通过相差显微镜观察细胞。将相同体积的星形胶质细胞悬液接种到96孔板中，共八个孔。通过随时间观察，以确定星形胶质细胞在96孔板中以及相应插入膜上是否已充分贴壁，从而维持无菌状态。将组装好的插入物置于两个六孔板之间进行转运，以尽量减少暴露于未过滤空气中。将细胞放入培养箱中，使星形胶质细胞贴壁。同时将对照 96 孔板也放入培养箱中。约四小时后，检查对照 96 孔板，观察星形胶质细胞是否已贴壁。若已贴壁，则将插入式组件转回组织培养操作台。轻柔地移除外置硅胶管和塞子。然后将插入物转回正常直立方向，放入含有内皮细胞维持培养基的孔中，每孔800微升。在BEC培养基中，于胶原蛋白包被的管腔表面共培养体系上，每200微升接种20,000个脑微血管内皮细胞，共培养三天，期间不更换培养基。实验前完成上述操作。将硅胶管和塞子用乙醇清洗后，进行高压灭菌以备后续使用。为刺激体外血脑屏障，首先将基底外侧和管腔侧培养基分别更换为 600 µL 和 100 µL 无血清 BECS 培养基。吸除管腔侧洗涤液，并加入含刺激因子的 100 µL 无血清培养基。若从星形胶质细胞区室诱导体外血脑屏障，则吸除基底外侧培养基，并替换为600微升无血清培养基。继续加入含刺激因子的培养基，随后进行标准的细胞旁路或跨细胞通透性检测，使用标记示踪剂以建立人源接触型血脑屏障模型。人永生化星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞被共同培养在孔径为3微米的多孔膜上，该膜允许星形胶质细胞及其足突穿过并与内皮细胞直接接触。该方法为星形胶质细胞和BECs提供了最佳的连续接种期，使其能够牢固地附着在多孔表面，细胞损失极小，并在三天内生长至汇合。接种后，两种细胞类型均在多孔膜上维持其细胞特异性标志物，这通过SVG细胞中胶质纤维酸性蛋白GFAP和NEC细胞中von Willebrand因子VWF的表达模式得以证实。与接触性血脑屏障模型最基本的特征一致，星形胶质细胞的终足能够穿过三微米的孔隙进入管腔室。因此，直径为该尺寸的孔隙上可能存在囊泡状结构（SVGs）与基底外侧表面（BES）之间的接触。此外，扫描电镜成像表明，囊泡状结构（SVGs）和脑微血管内皮细胞（BBCs）能够在膜孔上方直接生长，这一现象人为地增强了体外血脑屏障接触模型的物理屏障功能。本研究采用人接触性血脑屏障（BBB）模型，探讨TPA溶栓剂对血脑屏障的影响。这些体外研究表明，TPA确实以浓度和时间依赖性的方式增加了完整血脑屏障的通透性，且浓度和时间均处于药理学相关范围内。暴露于TPA后，SVG星形胶质细胞在多孔膜上表现出显著的形态学改变，提示星形胶质细胞对TPA的反应是TPA诱导血脑屏障开放的基础。该方法在我们的研究中发挥了关键作用，旨在探究血脑屏障对用于中风患者溶解血栓的TPAA溶栓药物的反应。这是文献中首次展示该方法，我们希望其他研究人员能够将其应用于各自的研究目的。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

改进方法对血脑屏障的人体细胞为主，接触模型的制备

本视频展示了人脑周细胞、星形胶质细胞和内皮细胞的共培养。每种细胞层分别形成后共同培养，构建出模拟血脑屏障细胞排列的三层结构体系...

建立人源血脑屏障的三重细胞共培养模型

脉络丛（CP）的上皮细胞构成了血液-脑脊液屏障（BCSFB）。 体外...

一种基于脉络丛上皮细胞的人源血液-脑脊液屏障模型，用于从基底侧研究细菌感染

一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

来自人脑组织的分离脑毛细血管可作为临床前模型，用于研究生理和病理生理条件下血脑屏障的功能。本文中，我们介绍了一种从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管的优化方案。...

从新鲜人脑组织中分离脑毛细血管

本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。...

一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。...

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

本方案描述了一种建立人血脑屏障（BBB）的方法 体外...

一种模拟人类血脑屏障的三重共培养细胞系统

此处，我们描述一种基于原代人脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的三细胞共培养血脑屏障模型的建立方法。该多细胞模型适用于研究缺血性脑卒中期间神经血管单元的功能障碍 体外...

用于研究缺血性中风的人源三重原代细胞共培养血脑屏障模型 体外

使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

了解利用人星形胶质细胞与脑内皮细胞共培养构建血脑屏障体外模型的改进方法。该技术通过优化细胞接种方案，实现细胞牢固贴附与紧密连接，为研究血脑屏障通透性及药物递送提供可靠平台。

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

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