改进方法对血脑屏障的人体细胞为主，接触模型的制备

该程序旨在通过在多孔膜的相对两侧共培养星形胶质细胞和内皮细胞来体外模拟血脑屏障。首先用细胞外基质涂覆多孔膜的管腔表面。像胶原蛋白这样的蛋白质用外部硅胶管和内部硅胶塞适合倒置的插入物，以在膜的腔表面上方形成一个可拆卸的孔。

现在将星形胶质细胞接种在倒置的插入物上，使它们粘附在腔表面。然后取出管子，将插入物按正常方向放入填充培养基的孔中。接下来，将内皮细胞接种到插入片段的管腔隔室中，并与相对的星形胶质细胞共培养。

最终，荧光示踪剂的通过或跨内皮电阻的记录用于测量体外 BBB 响应各种刺激剂的通透性变化。演示此程序的是我实验室的博士后 Barry Nigo 先生，他在攻读博士学位期间开发了这种改进的播种方案，我们已将其用于模拟血脑屏障。在测试了更粗略的坐姿方法并且对通过暂停泄漏的介质以及小的中等体积感到非常沮丧之后，我们首先想到了这个程序。

这导致了星形胶质细胞的坐姿时间短且不足，我们正在尝试在我们的手术中解决这个问题。将组织培养小室放入 24 孔板的孔中。然后加入 50 微升每毫升 132 微克大鼠胶原蛋白，其中一粒涂在插入物的管腔表面，在加湿的 37 摄氏度培养箱中孵育过夜以去除任何残留酸，用双蒸水清洗插入物的腔腔和腔侧。

然后倒置插件，轻轻地将一小段弹性硅胶管套在多孔膜的边缘周围。本质上是在 Abluminal 表面上方创建一个新井。密封底面。

准备一个由硅胶管制成的塞子，一端用 0.2 毫升 PCR 管的切割尖端密封。现在使用无菌镊子将硅胶塞插入管腔并推进它，直到它到达距离膜大约 1 到 2 毫米的距离。接下来，将 40， 000 个星形胶质细胞在 200 微升的维持培养基中直接植入腔膜表面上方的硅胶中。

为了监测星形胶质细胞的粘附状态，请使用标准的 96 孔板，因为它具有与 6.5 毫米插入物相同的表面积并允许。通过相差显微镜种子更容易观察细胞，将相同体积的星形胶质细胞悬浮液放入 96 孔板 8 中。这将随着时间的推移进行监测，以确定 96 孔中的星形胶质细胞以及插入膜中的星形胶质细胞何时充分粘附以维持无菌。

将组装好的插件在两个 6 孔板之间运输，以尽量减少暴露于未过滤的空气中。将细胞放入培养箱中，让星形胶质细胞粘附。此时将对照 96 孔板放入培养箱中。

大约四个小时后，检查对照 96 孔，看看星形胶质细胞是否粘附。如果是这样，则将插入组件转移回组织培养通风橱。轻轻取下外部硅胶管和塞子。

然后将插入片段放回正常的直立方向，放入每孔含有 800 μL 内皮细胞维持培养基的孔中。在 BEC 培养基中，将 20， 000 个 200 微升的脑内皮细胞共培养到胶原包被的管腔表面共培养三天，无需任何培养基变化。实验前。

高压灭菌前，用乙醇清洗硅胶管和塞子以备后用。为了刺激体外血脑屏障，首先，分别用 600 微升和 100 微升的无血清 becs 培养基替换腔和腔内培养基。吸出管腔洗涤液，并用 100 微升含有刺激剂的无血清培养基代替。

如果从星形胶质细胞隔室诱导体外 BBB，则吸出腔内培养基并替换为 600 微升无血清。含有刺激剂的培养基继续对标记示踪剂进行标准的细胞旁或跨细胞通透性测定，以建立人类接触血脑屏障模型。人类永生化的星形胶质细胞和脑内皮细胞在三个微米多孔膜上培养，允许星形胶质细胞和足部通过与内皮细胞接触。

该方法允许星形胶质细胞和 becs 的最佳不间断接种期，它们反过来以最小的细胞损失牢固地附着在多孔表面上，并在三天内生长到共流畅。播种后。两种细胞类型在多孔膜上都保持其细胞特异性标志物，如 SVG 中神经胶质纤维酸性蛋白 GFAP 和 von Vand 因子 VWF NEC 的表达模式所示。

与接触式 BBB 模型的最基本特征一致，星形胶质细胞 NFE 可以通过三个微米孔进入管腔隔室。因此，位于该尺寸孔上的 SVG 和 BES 之间可能存在接触。此外，SEM 成像表明 SVG 和 BBC 能够直接在膜孔上生长，这种现象人为地促进了体外 BBB 接触模型的物理屏障功能。

在本研究中，采用人体接触 BBB 模型探讨 TPAA 纤溶剂对 BBB 的影响。这些体外研究证实，TPA 确实以浓度和时间依赖性方式增加了完整 BBB 的通透性，这两者都在药理学相关范围内。暴露于 TPA 后，SVG 星形胶质细胞在多孔膜上的显着形态变化很明显，这表明星形胶质细胞对 TPA 的反应是 TPA 诱导的 BBB 开放的基础。

这种方法在我们的研究中发挥了关键作用，该研究旨在研究血脑屏障如何响应中风患者用于溶解血栓的 TPAA 溶栓药物。这是这种方法在文献中的首次演示，我们希望其他研究人员可以将其用于自己的目的。