Name: 基于插入渗透膜感染系统的实现研究分泌细菌病毒对哺乳动物宿主细胞的作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习使用渗透膜插入系统研究A群链球菌分泌的Streptolysin S毒素对人角质形成细胞的细胞毒性效应及宿主信号通路激活机制。该方法可应用于多种分泌型细菌蛋白与宿主细胞相互作用的研究。

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感谢我们李实验室的同事们，他们提供了宝贵的见解和专业知识，极大地支持了本项研究。本研究得到了美国国立卫生研究院授予的青年创新奖（NIH-1DP2OD008468-01）的支持，该奖项授予了 S.W. Lee。R.A. Flaherty 得到了罗伯特·C·博古斯拉斯基博士提供的阿尔伯特·马格努斯奖学金以及圣母大学埃克全球健康研究所教学助理职位的资助。

1. 细菌培养
<ol>
	<li>构建同基因型突变菌株，用于研究特定分泌因子21。 
	注意：本实验所用的GASM1T1 5448菌株包括 野生型 GAS、sagAΔcat 链球菌溶血素S缺陷型突变株（文中简称为ΔsagA），以及sagA回补菌株（文中简称为ΔsagA+sagA）21。</li>
	<li>制备目标细菌菌株的过夜液体培养物。&#160; 在感染人源细胞前，将GAS M1T1 5448菌株于&#160; -10 ml Todd-Hewitt肉汤中，37 °C培养16–20小时。</li>
	<li>将过夜培养的细菌培养物离心（2,400 rcf，10分钟），并重悬于新鲜细菌培养基中。 
	注意：通常将菌体重悬至与过夜培养相同的体积（5–10 ml），可获得理想的初始光密度。</li>
	<li>通过向重悬菌液中加入额外的细菌培养基进行稀释，使各待测菌株的起始浓度一致，直至所有菌株在600 nm处的光密度（OD600）相等（建议调整至OD600约为1.0，便于操作）。 
	注意：本研究中，使用处于稳定期的细菌培养物在标准化后立即用于感染宿主细胞。然而，由于某些细菌菌株退出稳定期的时间不同步，若目标菌株存在此类情况，则使用对数生长期的培养物起始感染可能更为合适。</li>
	<li>在进一步分析之前，进行菌落计数实验，以确定起始培养物中每毫升的菌落形成单位（CFU），从而计算感染复数（MOI），即每个宿主细胞对应的细菌数量。
	<ol>
		<li>将已调整至目标光密度的细菌培养物用磷酸盐缓冲液（PBS）或适当的细菌生长培养基（本研究中使用Todd-Hewitt肉汤）进行1 ml系列稀释。制备从10-1 到10-6 的稀释梯度，以确保至少有一组琼脂平板上的菌落数量可计（30–300个菌落）。所有稀释步骤均需设三个重复。</li>
		<li>取每种系列稀释液100 µl，接种至含有适合待分析细菌种类培养基的琼脂平板上。 
		注意：本研究中使用Todd-Hewitt琼脂平板。</li>
		<li>使用玻璃或塑料涂布棒将100 µl样品均匀涂布于琼脂平板表面，持续涂布直至液体完全被琼脂吸收。操作过程应在火焰旁无菌条件下进行。</li>
		<li>将琼脂平板置于37 °C培养过夜，或直至出现可计数的菌落。</li>
		<li>计数每个平板上生长的菌落数，并根据以下公式计算原始培养物中的CFU/ml：菌落数 × 稀释倍数的倒数 / 接种体积（毫升）。 
		例如：(200个菌落 × 1/10-5 稀释) / 0.1 ml = 2.0 × 108 CFU/ml</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 宿主细胞培养
<ol>
	<li>为所需的分析选择合适的宿主细胞系。 
	注意：本研究使用了 HaCaT 人表皮角质形成细胞29，该细胞系由 V. Nizet 惠赠。
	<ol>
		<li>将 HaCaT 细胞培养于含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中的 100 mm 培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 利用可渗透膜插入系统感染宿主细胞
<ol>
	<li>将细胞接种于合适的组织培养皿中，培养至细胞融合度达到90%。 
	注意：本研究中使用的 HaCaT 细胞通常在接种后 2–3 天内达到汇合。
	<ol>
		<li>用于裂解液收集（例如 信号分析和三磷酸腺苷（ATP）测定实验），将HaCaT细胞以约3 x 10⁵的接种密度接种于6孔板中5 细胞/孔</li>
		<li>在6孔板中的无菌玻璃盖玻片上接种细胞，用于免疫荧光成像实验，接种密度约为3 x 10⁵个细胞/孔5 细胞/孔</li>
		<li>对于溴化乙锭同型二聚体膜通透性及乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，将HaCaT细胞以约5 × 10⁵个/孔的接种密度接种于24孔板中4 细胞/孔</li>
	</ol>
	</li>
	<li>处理前立即用1×无菌PBS洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入新鲜培养基。针对此处描述的实验条件，6孔板每孔加入2 ml培养基，24孔板每孔加入0.5 ml培养基。若需进行药理学处理，应将药物与新鲜培养基混合后在此步骤中加入。 
	注意：某些检测可能需要使用替代培养基。例如，由于酚红和高浓度血清会干扰乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，因此本实验采用不含酚红的DMEM培养基，添加1%牛血清白蛋白（BSA，w/v）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。</li>
	<li>新鲜培养基添加后，将无菌的0.4 µm通透性膜插件小心放入每个孔中。此操作应在层流罩内进行，并使用无菌镊子将通透性膜插件转移至各孔。</li>
	<li>根据制造商说明书，向每个孔的上室加入新鲜细胞培养基。对于本实验所述条件，6孔板每孔加入1 ml培养基，24孔板每孔加入0.1 ml培养基。</li>
	<li>将适量的标准化细菌培养物（见第1部分）加入可渗透膜插件系统的上室中。未感染的对照组使用细菌培养基。本实验结果中，24孔板每孔加入25 µl标准化培养物，6孔板每孔加入100 µl标准化培养物。 
	注意：在这些研究中，将野生型或突变型GAS施加于宿主细胞 感染复数（MOI）为10。MOI根据最终的真核细胞数量计算得出（例如 2 x 106 细胞/孔），使得感染初期每宿主细胞所添加的细菌数量为原来的10倍（例如 2 x 107 每孔菌落形成单位（CFU）。合适的感染复数（MOI）因不同细菌种类及后续分析需求而异。 
	注意：除了使用细菌培养基作为未感染对照外，该技术某些应用的其他有用对照可能包括热灭活细菌或细菌培养上清液，用于比较。</li>
	<li>将感染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2.</li>
</ol>
4. 样本采集
<ol>
	<li>为收集细胞培养基、宿主细胞裂解物或带有完整细胞的玻璃盖玻片以用于后续分析，首先使用无菌镊子小心取出可渗透膜小室。</li>
	<li>用于分泌型宿主蛋白的评估：
	<ol>
		<li>将下室中的培养基收集到1.5 ml离心管中。收集过程中避免扰动单层细胞。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 14,000 rcf 离心 10 分钟，以去除细胞碎片。</li>
		<li>除去上清液，仅保留50 µl转移至新的1.5 ml离心管中，可立即使用或于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于宿主细胞裂解物的评估：
	<ol>
		<li>轻轻吸去覆盖在宿主细胞单层上的培养基，避免扰动细胞单层，以免造成样本损失。</li>
		<li>用1×PBS洗涤细胞一次。</li>
		<li>轻轻吸除 PBS。立即加入适量预冷的裂解缓冲液，以达到目标蛋白浓度，并将样品置于冰上孵育 15 分钟。每孔 6 孔板加入 200 µl 至 350 µl 裂解缓冲液，使蛋白浓度维持在 0.5 至 1.5 mg/ml 之间。 
		注意：本研究中使用的裂解缓冲液由去离子水、1%（v/v）Nonidet P40 Substitute、磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物组成。具体试剂详见“材料与设备”部分。</li>
		<li>使用细胞刮刀将细胞从每个孔的培养板表面刮下，并用移液器将每孔的全部内容物转移至1.5 ml离心管中。</li>
		<li>在 4 ˚C 条件下，以 14,000 rcf 离心 20 分钟。</li>
		<li>为评估可溶性裂解液组分，将上清液转移至新离心管中，于 -20 ˚C 保存或立即使用。</li>
		<li>如需检测核成分或其他不溶性裂解物组分，将沉淀部分保留并储存在 -20 ˚C，或立即使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于免疫荧光成像评估：
	<ol>
		<li>吸弃培养基，用1×冷PBS洗涤细胞。</li>
		<li>在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛（PFA，w/v）溶液，4℃ 过夜固定细胞。 
		注意：在这些实验中，每个6孔板的每孔加入1 ml PFA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 建议的应用
<ol>
	<li>宿主信号转导分析的SDS-PAGE与蛋白质印迹技术
	<ol>
		<li>按照第4.3节所述收集宿主细胞裂解液。</li>
		<li>采用双辛可宁酸（BCA）法或等效方法，结合蛋白标准品测定各样本裂解液的蛋白浓度30.</li>
		<li>在上样并使用4-15%聚丙烯酰胺凝胶或适当的替代凝胶进行电泳前，将各样本间的蛋白质浓度归一化31.
		<ol>
			<li>通过移液器从每个样本中取相同量的蛋白质来归一化样本浓度（例如 20 µg）加入新的 1.5 ml 离心管中，并向每管加入不同体积的裂解缓冲液（缓冲液体积 = 总体积 - 加入的样品体积），使总体积达到（例如 50 µl）且各样本间终末蛋白质浓度相当。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样品转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（或同等材质膜）。本实验所述结果采用以下转膜条件：先在25伏电压下转移2小时，随后将电压升至70伏，继续转移45分钟。转膜缓冲液配方为：200 mM Tris碱，1.5 M甘氨酸，20%甲醇（v/v），溶于去离子水中。</li>
		<li>用含5% BSA和0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBS）封闭膜。根据所用抗体的生产商建议进行适当调整。</li>
		<li>4 °C 条件下用一抗孵育膜过夜。使用浓度按制造商推荐稀释。</li>
		<li>用含0.1%吐温20的TBS缓冲液洗涤膜1.5小时，每10-15分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>室温下用1:5,000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1.5小时。</li>
		<li>用含0.1% Tween 20的TBS缓冲液洗涤膜1.5小时，每10至15分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用化学发光检测试剂孵育膜，然后在胶片上显影。也可根据需要选用其他检测方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>宿主细胞免疫荧光染色与成像
	<ol>
		<li>按照第4.4节所述方法固定载有宿主细胞的盖玻片。</li>
		<li>移除PFA溶液，用PBS洗涤载玻片上的处理细胞两次，每次洗涤之间用抽吸法去除液体。 
		注意：PFA 具有高毒性，必须妥善处理。</li>
		<li>在室温下用含1%（w/v）正常山羊血清、2%（v/v）Triton X-100和0.5%（v/v）Tween 20的PBS封闭盖玻片，持续2小时。</li>
		<li>用 PBS 清洗盖玻片 30 分钟，每 10 分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>将盖玻片与一抗按1:50比例（或按制造商建议）在封闭液中4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用 PBS 清洗盖玻片 1.5 小时，每 30 分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>将盖玻片在室温下用二抗（本研究使用山羊抗兔IgG AlexaFluor488）孵育2小时，抗体与封闭液的比例为1:200。</li>
		<li>盖玻片用缓冲液洗涤1小时，每20分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>应用所需的染色剂。 
		注意：这些研究在封闭液中使用了 DAPI（细胞核染色剂）和罗丹明-鬼笔环肽（肌动蛋白染色剂），稀释比例均为 1:1,000。</li>
		<li>将盖玻片在室温下与细胞核和肌动蛋白染料共同孵育30分钟。</li>
		<li>室温下用 PBS 清洗盖玻片 30 分钟，每 10 分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>使用封片剂将盖玻片封固在载玻片上。</li>
		<li>盖玻片置于载玻片上过夜，再进行封片和成像。本实验结果使用配备标准20倍物镜的荧光显微镜采集图像。采用ImageJ及显微镜成像软件对获取的图像进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>碘化丙啶同二聚体细胞死亡检测
	<ol>
		<li>吸出每孔中的培养基，并用无菌 PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>在 PBS 中加入 4 µM 碘化丙啶同型二聚体-1。</li>
		<li>在室温下避光孵育细胞 30 分钟。</li>
		<li>使用酶标仪测定荧光强度，设置激发波长为528 nm，发射波长为617 nm，截止值为590 nm。</li>
		<li>在首次读数后，向每孔中加入0.1%（w/v）皂苷，于室温下继续孵育20分钟（同时进行振荡），随后在相同设置下进行第二次读数。</li>
		<li>通过将每个孔的初始荧光读数（处理后）除以第二次荧光读数（皂苷处理后），单独计算各孔的细胞膜通透百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ATP 检测分析
	<ol>
		<li>按照上述第4.3节所述收集裂解液。</li>
		<li>通过BCA法或类似方法对裂解液中的蛋白质水平进行标准化30.</li>
		<li>使用基于化学发光的ATP检测试剂盒或同等产品，按照制造商说明书测定细胞内ATP水平。</li>
		<li>将处理组的数值归一化至相应的未感染对照样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乳酸脱氢酶释放实验
	<ol>
		<li>感染后，按照第4.3节所述收集上清液。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用LDH释放检测试剂盒评估LDH释放。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种基于可渗透膜插入式感染系统的方法，用于研究细菌毒素链球菌溶血素S对人上皮角质形成细胞的影响 体外 该系统可适用于其他分泌型细菌毒力因子的研究，以及不同类型的宿主细胞。这一新近开发的系统相较于使用纯化毒素或过滤细菌上清液的传统实验方法，具有多项优势。1-3,8,18-20基于可渗透膜插件的系统可在细菌毒素产生时持续将其递送至宿主细胞，从而维持毒素的最大活性，并提高实验间的重复性。此外，该系统通过在感染进展过程中允许分泌因子随时间积累，以及避免人为选择特定毒素浓度施加于宿主细胞，更接近生理条件。同时，该系统还可为研究人员提供一种手段，用于评估目标细菌因子是否以依赖接触的方式递送至宿主细胞。接触依赖性通常通过构建黏附缺陷的同基因细菌突变株或使用抑制黏附的试剂来检测。本文所述系统可作为传统方法的简单替代方案，用于补充或取代上述方法。
除了方案第5节中描述的已测试应用外，该感染系统还可轻松适用于其他应用，例如采集样品用于细胞因子阵列和ELISA检测。在这两种情况下，可采用与乳酸脱氢酶（LDH）释放检测相似的实验流程。尽管此处未展示，该系统已成功用于有效采集宿主细胞样品，以进行流式细胞术分析。在此应用中，感染期结束后移除可渗透膜插入物，洗涤细胞以去除细胞培养基，然后加入胰蛋白酶以收集细胞进行分析。细菌与宿主细胞的物理分离对此应用尤为有利，因为它有助于防止形成由黏附的细菌与宿主细胞聚集而成的大团块，从而避免干扰流式细胞仪对细胞数量的准确计数。
尽管在比较基于可渗透膜小室的感染研究与传统直接感染研究的结果时，观察到宿主反应具有高度一致性，但在这些宿主反应的动力学方面仍观察到一些显著差异21。例如，在基于可渗透膜小室的感染模型中，宿主信号通路的变化以及膜相关细胞毒性发生的时间比相应的直接感染模型延长了30%-50%。由于基于可渗透膜小室的系统需要向每个孔的上、下室均添加培养基，因此本文所述研究中所采用的系统相比此前使用的直接感染模型，每孔所需的总培养基体积增加了30%21。这种培养基总体积的差异，加上当细菌与宿主细胞无法直接接触时两者之间距离的增加，很可能延长了链球菌溶素S（SLS）在培养基中扩散至宿主细胞并引发相应效应所需的时间。此外，基于可渗透膜小室的系统排除了多种可能参与宿主细胞损伤的A族链球菌（GAS）毒力因子；该系统中这些额外因子的缺失也可能导致与直接感染相比，宿主细胞死亡及宿主信号事件的启动出现延迟21。在设计用于评估其他分泌型细菌组分的实验时，应考虑这些因素。
为确定分泌型细菌因子对宿主细胞作用的最具意义的实验条件，建议针对基于可渗透膜插件感染系统的每种应用测试多个时间点。需重点考虑目标特定毒力因子在何种条件下可实现最佳表达。 （例如 对数期，稳定期，响应特定环境信号 等等。以成功观察其效应。在专注于评估宿主信号蛋白变化的实验中，必须选择合适的时间点，以确保SLS有足够时间到达宿主细胞，并达到足以诱导信号变化的浓度。 21与此同时，必须在SLS诱导细胞膜通透性增加之前评估宿主信号通路的变化，因为这一效应会干扰用于分析的宿主细胞裂解液的收集。由SLS诱导的细胞死亡在报告的信号事件启动数小时后，可在直接感染模型和跨膜插入式感染模型中得到最佳观察。21此外，在选择感兴趣的时间点时，还需确保所研究的细菌在实验期间无法穿透多孔插入膜。某些细菌组分在较长时间内的产生可能会破坏膜的完整性，导致细菌进入下室。为确定在特定系统中是否存在这一潜在问题，可将待研究的细菌菌株施加于基于可穿透膜插入装置的上室，并在多个时间点进行检测。在每个时间点，小心取出插入膜，收集下室中的培养基，并用于标准菌落计数实验（见第1.5节）。若下室培养基中未形成任何菌落，则可认为在该时间点及所测试的细菌载量下，插入膜有效阻止了细菌的通过。
另一个可能需要优化以有效分析分泌性细菌因子的实验设计要素是感染复数（MOI）。MOI指每个宿主细胞所对应的细菌细胞数量之比，因此受感染时宿主细胞的融合度以及施加到细胞上的细菌菌落形成单位（CFU）数量的影响。在本研究中，角质形成细胞培养至90%融合度，以使其形成具有完整紧密连接的连续单层。在选择感染实验的合适融合度时，必须仔细考虑所研究宿主细胞的生理结构。一旦确定了每孔中适当的宿主细胞数量，即可根据期望的MOI计算出合适的细菌CFU。在本研究所描述的实验中，化脓性链球菌（GAS）以MOI为10的条件接种至宿主细胞。合适的MOI会因不同细菌种类及后续分析目标的不同而有所变化。通常，较低的起始MOI更具生理相关性，可使目标细菌因子缓慢积累，从而在宿主细胞活力发生显著变化之前捕捉到宿主细胞信号通路的细微改变。许多研究在评估细胞毒性时采用较高的MOI，但该效应也可通过起始使用较低MOI并延长感染时间来实现。必须为所有待测细菌菌株准确确定CFU与光密度之间的对应关系，因为同源突变株的生长速率可能与野生型细菌不同，因此为确保不同菌株间宿主反应的恰当比较，可能需要在每孔中添加更高或更低的CFU。当所研究的哺乳动物宿主细胞具有杀灭细菌或抑制其生长的能力，或怀疑不同细菌菌株之间存在非同步生长时，进行实验以评估感染结束时的最终细菌载量可能是有益的。这可通过收集可渗透插入物中的内容物，并执行类似于本方案第1.5节所述的菌落计数实验来实现。
选择合适尺寸的孔板以匹配所需的检测方法，对于获得最佳结果也至关重要。可透膜小室有多种规格可供选择，但本研究中显示最稳定结果的是设计用于24孔和6孔组织培养板的小室。这些规格的小室使用无菌镊子操作较为方便，而操作便捷性对于防止细菌从孔板上室意外转移到下室尤为关键。在涉及收集宿主细胞裂解液的实验中，6孔板每孔可提供适合大多数分析所需的细胞数量，并且孔径足够大，便于使用细胞刮刀进行样本收集。对于细胞毒性检测，当宿主细胞保持贴壁状态并用可被酶标仪检测的荧光或比色染料标记时例如 碘化丙啶同二聚体检测，台盼蓝排斥检测），建议使用24孔板及相应插件。对于需要收集和分析细胞培养基的实验（例如 LDH释放、细胞因子研究）可使用24孔板或6孔板，但通常较小的孔板即可为这些分析提供足够的样本量，同时减少所需试剂的消耗。总体而言，该方法具有高度的灵活性，可根据需要进行调整，以制备适用于多种后续应用的样品。

理解细菌毒力因子在宿主细胞感染过程中的功能是细菌致病机制研究的主要重点。许多细菌病原体主动分泌毒素及其他可溶性因子，以协助破坏宿主组织、启动宿主细胞内的信号转导改变，或在感染过程中调控免疫系统的应答1-10尽管已开发出多种方法，能够成功地纯化并制备许多这类重要的毒力因子用于研究，但某些细菌产物具有独特的结构或复杂的翻译后修饰，使其难以适用于常规纯化方法，因而无法通过分离手段进行独立研究 体外 系统。例如，A组 链球菌属 导致从咽炎到坏死性筋膜炎及中毒性休克综合征等多种感染的细菌病原体，可产生一种名为链球菌溶血素S（Streptolysin S, SLS）的分泌型细菌毒素11-17。这种核糖体生成的肽由链球菌溶血素S相关基因（Streptolysin S associated gene，矢状面）簇，其成熟产物的大小估计为2.7 kDa14-17. 由编码的原毒素， sagA, 经多种酶（SagB、SagC 和 SagD）进行翻译后修饰，生成成熟且具有功能的形式15-17这些翻译后修饰的复杂性，加上该毒素非同寻常的氨基酸序列，使得该毒素与迄今为止尝试过的所有纯化和结构解析方法都不相容。15,17这些挑战使得确定该毒素在宿主发病机制中的具体作用变得复杂。
在难以制备或无法制备纯化毒素或其他分泌因子的情况下，传统上通过制备过滤后的细菌上清液并将其施加于宿主细胞，以研究这些产物的功能18-20。该方法存在若干挑战。首先，许多此类分泌因子（包括SLS）在储存后再次施加于宿主细胞时，其活性无法维持在最佳或稳定水平。此外，当上清液仅在单一时间点收集后再施加于宿主细胞时，难以确定其生理相关性，也无法对自然感染过程中分泌因子在感染进程中逐渐积累至生理相关浓度的情况得出直接结论。这一问题不仅存在于细菌上清液的应用中，也适用于纯化毒素在宿主细胞研究中的使用1-3,8。为解决上述问题，已开发出一种基于可渗透膜插入装置的感染系统，可在维持毒素最佳活性的同时，避免细菌与宿主细胞直接接触，从而评估SLS对宿主细胞的影响。在该系统中，人上皮细胞在双室孔板的下室形成单层生长，细菌则被引入同一孔板的上室。上下室之间由多孔膜（孔径0.4 µm）隔开，允许分泌因子在两室之间交换，但阻止细菌通过。该系统可有效评估仅由持续存在的细菌分泌成分引发的宿主反应，同时排除A族Streptococcal感染期间因细菌与宿主细胞直接接触而可能产生的反应。尽管除SLS外的其他细菌分泌因子也可穿过该多孔膜，但通过使用包含野生型（WT）、SLS基因敲除株（ΔsagA）及sagA基因回补株（ΔsagA+sagA）的同基因突变株组合，可精确评估严格依赖SLS的宿主反应21。
尽管类似的可渗透膜小室系统已被用于研究病毒感染、癌症生物学和免疫细胞迁移中的分泌因子22-26，但采用该方法研究细菌与宿主细胞相互作用的研究仍较少6,27,28。即使使用此类系统探索细菌与宿主细胞相互作用的研究，也主要集中在炎性细胞或细菌穿过种植于可渗透膜小室上的单层上皮或内皮细胞的迁移过程。本文所述基于可渗透膜小室的感染系统是一种简单而有效的方法，通过多孔膜将细菌与宿主细胞分隔开来，用于评估分泌型毒素SLS对宿主细胞膜完整性、细胞活力、细胞信号转导以及宿主细胞分泌因子的影响。该技术可适用于研究其他分泌型毒力因子对多种哺乳动物宿主细胞类型的作用，以探究特定细菌因子在感染过程中所发挥的功能。

<table><tbody><tr><td>Todd-Hewitt 肉汤</td><td>Acumedia</td><td>7161A</td><td>使用适合目标细菌种类的肉汤。</td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>basic model</td><td>任何紫外-可见分光光度计均适用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>其他品牌亦适用。</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>A1296-1kg</td><td>其他品牌亦适用。</td></tr><tr><td>HaCaT 人表皮角质形成细胞</td><td></td><td></td><td>由 Victor Nizet 实验室惠赠。</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>使用适合目标细胞系的培养基。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest</td><td>S162H</td><td>使用适合目标细胞系的培养基添加剂。</td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>其他品牌亦适用。</td></tr><tr><td>6 孔组织培养皿</td><td>CytoOne</td><td>cc7682-7506</td><td>其他品牌亦适用，但需与 Corning 插件兼容。</td></tr><tr><td>24 孔组织培养皿</td><td>CytoOne</td><td>cc7682-7524</td><td>其他品牌亦适用，但需与 Corning 插件兼容。</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>用于细胞接种前必须进行高压灭菌。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>酚红-free DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053028</td><td>仅乳酸脱氢酶（LDH）释放实验需要酚红-free 培养基。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030149</td><td>仅用于补充 LDH 释放实验的细胞培养基。</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>BP356100</td><td>仅用于补充 LDH 释放实验的细胞培养基。</td></tr><tr><td>胶原包被 0.4 &amp;mu;m Transwell 插件（6 孔）</td><td>Corning</td><td>3540</td><td></td></tr><tr><td>胶原包被 0.4 &amp;mu;m Transwell 插件（24 孔）</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher</td><td>3120018</td><td>操作 Transwell 插件前必须用乙醇灭菌。</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Fisherbrand</td><td>08-100-241</td><td>仅用于收集细胞裂解物。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>04042-500</td><td>有毒。&amp;nbsp; 仅免疫荧光成像需要。</td></tr><tr><td>双辛可宁酸（BCA）检测试剂盒</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td>也可使用其他蛋白定量检测方法。</td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸 4 - 15% 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>BioRad</td><td>4561083</td><td>应根据目标蛋白选择缓冲体系和聚丙烯酰胺百分比。</td></tr><tr><td>电泳槽配件</td><td>BioRad</td><td>1658063</td><td>仅 Western 印迹实验需要。</td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>仅 Western 印迹实验需要。</td></tr><tr><td>Western 印迹转膜槽</td><td>BioRad</td><td></td><td>仅 Western 印迹实验需要。</td></tr><tr><td>聚偏二氟乙烯（PVDF）膜</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>仅 Western 印迹实验需要。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>兔 IgG-HRP 二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc2030</td><td>二抗应根据所选检测方法确定。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>小鼠 IgG-HRP 二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc2031</td><td>二抗应根据所选检测方法确定。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸化-p38（T180 + T182）MAPK 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4511</td><td>根据目标蛋白选择合适的初级抗体。</td></tr><tr><td>总 p38 MAPK 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>8690</td><td>根据目标蛋白选择合适的初级抗体。</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>免疫荧光成像检测可使用其他二抗。</td></tr><tr><td>LumiGLO 检测试剂</td><td>KPL</td><td>54-61-00</td><td>仅用于胶片检测的 Western 印迹实验。</td></tr><tr><td>检测胶片</td><td>Biodot</td><td>BDB57</td><td>仅用于胶片检测的 Western 印迹实验。</td></tr><tr><td>DeltaVision Nikon 90i 荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>其他荧光显微镜也适用于此类分析。</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500mL</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 核染色剂</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td>根据特定免疫荧光应用选择染色剂。</td></tr><tr><td>罗丹明-鬼笔环肽肌动蛋白染色剂</td><td>Molecular Probes</td><td>R415</td><td>根据特定免疫荧光应用选择染色剂。</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>仅免疫荧光成像需要。</td></tr><tr><td>溴化乙锭同二聚体 1</td><td>Molecular Probes</td><td>E1169</td><td>仅膜通透性细胞毒性实验需要。</td></tr><tr><td>Spectramax M5 微孔板读数仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>其他具备紫外-可见光、荧光和发光检测能力的微孔板读数仪也可能适用。</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>47036-50G-F</td><td>仅膜通透性细胞毒性实验需要。</td></tr><tr><td>Molecular Probes ATP 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>A22066</td><td>其他试剂盒也可能适用。</td></tr><tr><td>LDH 释放细胞毒性检测试剂盒</td><td>Roche</td><td>11644793001</td><td>其他试剂盒也可能适用。</td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代品</td><td>Sigma</td><td>74385-1L</td><td>其他供应商产品亦适用。</td></tr><tr><td>HALT 磷酸酶抑制剂混合液</td><td>Thermo Scientific</td><td>78420B</td><td>其他混合液也可能适用。</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 蛋白酶抑制剂混合片剂（无 EDTA）</td><td>Sigma</td><td>S8830-2TAB</td><td>其他混合液也可能适用。</td></tr></tbody></table>

利用可渗透膜插件感染系统研究分泌型细菌毒素对哺乳动物宿主细胞影响的方法实现

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

许多细菌病原体会分泌强效毒素，以协助破坏宿主组织、启动宿主细胞内的信号转导改变，或在感染过程中调控免疫系统反应。尽管已有方法能够成功纯化并制备多种重要的毒力因子，但仍有许多细菌毒素由于其独特的结构或复杂的翻译后修饰，难以被纯化和深入研究。 体外 系统。此外，即使能够获得纯化的毒素，在相关生理条件下研究毒素特定效应仍面临诸多挑战。大多数 体外 旨在评估分泌型细菌毒素对宿主细胞作用的细胞培养模型，通常采用将宿主细胞与单次剂量的毒素共孵育的方法。此类方法难以真实模拟感染过程中宿主细胞的实际暴露情况，因为在自然感染中，细菌会持续产生毒素，并使其在感染过程中逐渐积累。本实验方案描述了一种基于可渗透膜插入装置的细菌感染系统的设计，用于研究由A群链球菌（Group A Streptococcus）产生的强效毒素——链球菌溶血素S（Streptolysin S）的作用。 链球菌，作用于人上皮角质形成细胞。与直接将纯化毒素或细菌上清液施加于宿主细胞的方法相比，该系统更接近感染过程中的自然生理环境。重要的是，该方法还可消除因细菌与宿主细胞直接接触所导致的宿主反应偏倚。该系统已被成功用于有效评估链球菌溶素S（Streptolysin S, SLS）对宿主细胞膜完整性、细胞活力以及细胞信号通路反应的影响。该技术可便捷地应用于研究其他分泌型毒力因子对多种哺乳动物宿主细胞的作用，以探究细菌分泌因子在感染过程中所发挥的特定作用。

用于研究分泌型细菌因子的基于可渗透膜小室的感染系统方案详见图1。该系统通过多孔膜将细菌与宿主细胞分隔开来，以评估分泌型细菌因子（在此为链球菌溶素S（SLS））对宿主反应的影响，包括宿主细胞膜完整性、细胞活力、细胞信号转导以及宿主细胞分泌因子的变化。图2展示了代表性Western印迹数据，表明该系统可用于评估非接触依赖性宿主信号通路蛋白的活化变化。具体而言，代表性数据表明，在产SLS的GAS菌株存在下，p38 MAPK的活化显著增强。该系统还可用于通过免疫荧光显微镜观察分泌型细菌因子对宿主蛋白定位的影响（图3）。数据显示，关键炎症介质核因子κB（NFκB）的活化依赖于SLS，NFκB在活化后从细胞质转位至细胞核21。图2和图3的结果表明，SLS依赖性的炎症信号反应均不需要细菌与宿主细胞之间的直接接触。由于先前的实验已在直接感染模型中证实了SLS依赖性的p38和NFκB活化21，若在基于可渗透膜小室的系统中三种GAS菌株引起的p38或NFκB活化水平相似，则提示该反应需要细菌与宿主细胞的直接接触。图4表明，该感染系统可通过乙啶同源二聚体染色和乳酸脱氢酶（LDH）释放实验来评估毒素依赖性的宿主细胞毒性变化。这体现在暴露于含SLS的GAS菌株的宿主细胞中，细胞膜通透性和LDH释放均较未感染细胞或暴露于SLS缺陷型菌株的细胞显著增加。这些细胞毒性变化并非即时发生，膜通透性的显著变化在感染后12小时才开始显现，而LDH释放的显著变化则需至感染后16小时。代表性数据说明了为评估这些宿主反应而选择合适时间点和感染条件的重要性。除了可用于评估宿主信号转导变化和细胞毒性外，基于可渗透膜小室的感染系统还适用于代谢变化的研究，例如通过防止细菌污染宿主细胞裂解液来准确测定宿主细胞ATP水平（图5）。这些数据显示，在GAS感染后16小时，角质形成细胞的ATP水平显著下降，且在SLS存在下ATP的损耗进一步加剧。这些结果与观察到的毒素依赖性宿主应激反应信号增强和细胞毒性增加一致。
<img alt="Transwell 实验示意图；细菌-宿主细胞共培养、菌落形成单位测定、孵育、分析。" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：基于可渗透膜插件感染系统方案的示意图，用于评估分泌性细菌因子对宿主细胞的影响。将人角质形成细胞接种于底部室中，并培养至90%汇合度。一层带有0.4 µm孔径的胶原包被膜将上室与下室分隔开，将细菌加入可渗透膜插件系统的上室中，进行所需时间的感染。感染期结束后，可收集细胞培养上清液和宿主细胞，并用于多种分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同遗传条件下p38磷酸化的Western blot和柱状图分析。" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：基于可渗透膜插件的感染系统可用于通过SDS-PAGE和Western印迹分析宿主细胞裂解物。代表性数据表明，SLS可增强感染角质形成细胞中p38 MAPK通路的活化。（A）通过可渗透膜插件感染系统（MOI = 10）用GAS感染HaCaT细胞7小时，并检测裂解物中p38的活化情况。（B）对三次独立的Western印迹进行密度测定，以量化GAS感染后p38相对活化水平。结果显示三个生物学重复的平均值，误差线表示标准差。p38的相对活化水平以磷酸化蛋白/总蛋白水平表示。与未感染细胞相比确定统计学显著性。总体p值通过ANOVA分析确定（p = 0.0063）。事后采用Dunnett检验将各实验组与相应的未感染对照组均值进行比较。*，p = 0.01–0.05；**，p = 0.001–0.01；***，p = 0.0001–0.001；****，p &lt; 0.0001。本图经Flaherty et al. 201521修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="NFκB定位研究；柱状图，荧光显微镜，蛋白表达分析，ΔsagA效应。" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 基于可渗透膜插件的感染系统可通过免疫荧光显微镜可视化宿主信号通路的变化。 代表性数据表明，链球菌溶素S通过激活NFκB增强促炎信号通路。使用基于可渗透膜插件的感染系统，以感染复数（MOI）为10的条件感染HaCaT人角质形成细胞，持续8小时。（A 和 B）通过免疫荧光成像评估NFκB的核定位。通过统计特定视野中NFκB从细胞质转移至细胞核的细胞数量，并将其除以同一视野中的总细胞数，计算出核定位细胞的百分比。比例尺表示100 µm。（A）每种条件下的三个生物学重复实验的平均值以误差棒表示标准差。总体p值通过单因素方差分析（ANOVA）确定；p &lt;0.0001。采用Dunnett检验将各实验组与相应的未感染对照组进行比较。*，p = 0.01–0.05；**，p = 0.001–0.01；***，p = 0.0001–0.001；****，p &lt;0.0001。本图经Flaherty et al. 201521 修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="膜通透性图表；柱状图；细菌菌株中膜完整性和乳酸脱氢酶释放分析" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4： 基于可渗透膜插件的感染系统可在细菌与宿主细胞无直接接触的条件下，用于检测细菌介导的膜通透性及细胞毒性。 代表性数据表明，在存在活性SLS毒素的情况下，角质形成细胞的存活率下降。GAS-在存在野生型、SLS缺陷型或 sagA 补充分组链球菌（GAS）. 角质形成细胞使用基于可渗透膜插件的感染系统，在感染复数（MOI）为10的条件下暴露于GAS 8–16小时。（A）细胞活力通过溴化乙锭同源二聚体（ethidium homodimer）检测法评估，或BLDH释放实验。两个图中数据均为3个重复样本的平均值，误差线代表标准差。各时间点的显著性通过ANOVA确定。A) 8 小时，p = 0.0241；12 小时，p &lt;0.0001 (B) 8 小时，p = 0.0287；12 小时，p = 0.1977；16 小时，p = 0.0031。采用 Dunnett 检验将各条件下的均值与相应时间点的野生型感染进行比较。*，p = 0.01–0.05；**，p = 0.001–0.01；***，p = 0.0001–0.001；****，p &lt;0.0001。此图经 Flaherty 修改 等 201521. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="标准化ATP水平；柱状图；实验；对照、野生型、sagA变异体的比较。" src="/files/ftp_upload/54406/54406fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5： 基于可渗透膜插件的感染系统可通过防止细菌污染宿主细胞裂解物，准确测定宿主ATP水平。 代表性数据展示了A族链球菌（Streptococcal）感染过程中依赖SLS的ATP水平下降。使用基于可渗透膜插件的感染系统对HaCaT细胞进行GAS感染，持续8–16小时。每个实验条件下取一次代表性生物学重复中的技术重复（n = 3，每样本2 × 106个细胞）的平均值，误差线表示标准差。总体p值通过单因素方差分析（ANOVA）确定（12小时，p &lt;0.0001；16小时，p &lt;0.0001）。采用Dunnett检验将各条件与相应时间点的野生型感染进行比较。*，p = 0.01–0.05；**，p = 0.001–0.01；***，p = 0.0001–0.001；****，p &lt;0.0001。本图经Flaherty et al. 201521修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54406/54406fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

此处采用基于可渗透膜小室的感染系统，研究由A群链球菌分泌的毒素链球菌溶血素S对 链球菌，关于角质形成细胞的描述。该系统可轻松应用于感染过程中其他分泌型细菌蛋白对多种宿主细胞类型作用的研究。

许多细菌病原体分泌强效毒素，以协助破坏宿主组织、启动宿主细胞内的信号变化或操控……

基于可渗透膜小室的感染系统总体目标是研究细菌分泌的毒素在感染过程中对宿主细胞的影响。该方法有助于解答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如特定分泌的细菌组分如何在细菌感染期间影响宿主细胞的反应。该技术的主要优势在于能够研究细菌分泌的组分，并且更接近模拟人类感染背景下具有生理相关性的宿主-病原体环境。进行该实验操作的是我实验室的高级研究生 Rebecca Flaherty。为制备同基因型的 A 群链球菌（group A streptococcus，GAS）野生型及 GAS M1T1 5448 突变株，首先接种 5 至 10 毫升 Todd Hewitt 肉汤，37 摄氏度培养 16 小时，启动过夜液体培养。离心过夜培养的细菌，用与原始体积相等的新鲜细菌培养基重悬菌体沉淀。然后，通过将重悬的菌液用额外的培养基稀释，调整至相同的OD600值，使细菌培养物的起始浓度一致。为了获取用于信号通路分析和ATP测定实验的裂解液，将HaCaT细胞以每孔约3 × 10⁵个细胞的接种密度接种于6孔板中，培养至90%融合度。为了进行碘化丙啶同源二聚体膜通透性检测和乳酸脱氢酶释放检测，将HaCaT细胞以每孔约5 × 10⁴个细胞的接种密度接种于24孔板中，培养至90%融合度。处理前立即用1× PBS洗涤细胞。然后向六孔板中加入2毫升新鲜培养基（含或不含药物处理），或向24孔板的每个孔中加入0.5毫升培养基。接下来，在超净工作台内，使用无菌镊子将无菌的0.4微米通透性膜插入物小心地放入每个孔中。在感染准备过程中，对可渗透插入物进行轻柔且无菌的操作至关重要，以防止膜在此过程中受损或受到污染。根据制造商的说明，向每个孔的上室加入新鲜的细胞培养基。然后，将适当体积的标准化细菌培养物加入可渗透膜插入系统的上室中，并向对照孔中加入细菌培养基。将细菌小心地加入上室，并轻柔地将感染的细胞转移至培养箱，这一步骤至关重要，因为必须确保在实验设置过程中细菌不会污染下室。为检测分泌的宿主蛋白，使用无菌镊子小心取出可渗透膜小室。然后，在不扰动细胞单层的前提下，将下室中的培养基收集至1.5毫升离心管中。将样品在14,000 RCF、4摄氏度条件下离心10分钟，以沉淀细胞碎片。然后，除去上清液，仅保留50微升，转移至新的1.5毫升离心管中，并于-20摄氏度保存，或立即使用。对于宿主细胞裂解物的检测，轻轻吸去单层细胞上方的培养基，注意不要扰动宿主细胞。然后，用 PBS 轻轻冲洗细胞一次。吸除 PBS，立即加入适量的预冷裂解缓冲液，使蛋白浓度达到例如 0.5 至 1.5 毫克/毫升。随后将样品置于冰上孵育 15 分钟。接下来，使用细胞刮刀将细胞从每个孔的培养板表面刮下，并将每孔的全部内容物转移至一个1.5毫升离心管中。然后，在14,000 RCF、4°C条件下离心20分钟。为检测可溶性裂解液组分，将上清液转移至新的离心管中，可于-20°C保存，或立即使用。为评估细胞核或其他不溶性裂解物组分，将沉淀物保留并储存在-20 °C，或立即使用。若需通过免疫荧光成像进行检测，吸除培养基后，使用1×冷PBS洗涤细胞，随后用含4% PFA的PBS固定细胞过夜。根据文本方案进行进一步分析。此处展示的蛋白质印迹结果表明，在链球菌溶血素S（streptolysin S）或产SLS的化脓性链球菌菌株存在时，p38 MAP激酶的激活以及角质形成细胞的反应显著增强，提示该系统可用于评估接触非依赖性宿主信号蛋白激活状态的变化。在本图中，显示了SLS依赖性的关键炎症介质核因子-κB（nuclear factor-kappa B）的激活，该因子在激活后从细胞质转位至细胞核，表明该系统可用于通过免疫荧光显微技术观察分泌型细菌因子对宿主蛋白反应的影响。在此，与未感染细胞或暴露于缺乏SLS的菌株的细胞相比，暴露于产生SLS的化脓性链球菌菌株后，宿主细胞的膜通透性及乳酸脱氢酶（LDH）释放均显著增加。这些结果表明，该系统可用于评估毒素依赖性的宿主细胞毒性变化。在本实验中，测定了角质形成细胞中的ATP水平及其对化脓性链球菌感染的反应。感染后16小时，观察到ATP显著减少，且在SLS存在下ATP的损失更为明显，这与毒素依赖性的宿主应激反应信号增强及毒性效应一致。该技术建立后，可用于研究任何分泌性微生物因子对多种宿主细胞类型的特异性反应。在执行该实验过程中，须在整个实验设置步骤中严格遵守无菌操作，并在初始设置及样品采集过程中谨慎操作可渗透膜小室。通过该实验流程，可进一步开展蛋白质印迹（western blotting）、免疫荧光成像以及细胞膜通透性检测等方法，以确定目标细菌因子在感染过程中如何影响信号转导级联反应，并调控整体细胞毒性。观看本视频后，您应能够充分掌握在暴露于特定分泌型细菌因子后，如何制备宿主细胞样本以评估多种宿主细胞反应。请务必注意，操作细菌病原体等生物危害性材料时，需遵循相应的安全防护措施。安全进行这些实验需要正确使用护目镜、手套和实验服，并恰当地使用生物安全柜。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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