利用可渗透膜插件感染系统研究分泌型细菌毒素对哺乳动物宿主细胞影响的方法实现

这种基于可渗透膜插入物的感染系统的主要目标是研究感染过程中分泌的细菌毒素对宿主细胞的影响。该方法有助于回答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如特定分泌的细菌组分如何在细菌感染期间影响宿主细胞的反应。该技术的主要优势在于能够研究细菌分泌的组分，并且更接近模拟人类感染背景下具有生理相关性的宿主-病原体环境。

本实验操作将由我实验室的高级研究生 Rebecca Flaherty 演示。为制备同基因型的 A 族链球菌（group A streptococcus，简称 GAS）野生型及 GAS M1T1 5448 突变株，首先接种 5 至 10 毫升 Todd Hewitt 肉汤，于 37°C 培养 16 小时，启动过夜液体培养。离心过夜培养的细菌，然后用等同于原始体积的新鲜细菌培养基重悬菌体沉淀。

然后，通过将重悬的菌液用额外的培养基稀释，调整至相同的OD600值，使细菌培养物的起始浓度一致。为了获取用于信号通路分析和ATP测定实验的裂解液，将HaCaT细胞以每孔约3 × 10⁵个细胞的接种密度接种于6孔板中，培养至90%融合度。为了进行碘化丙啶同源二聚体膜通透性检测和乳酸脱氢酶释放检测，将HaCaT细胞以每孔约5 × 10⁴个细胞的接种密度接种于24孔板中，培养至90%融合度。

处理前立即用1× PBS洗涤细胞。然后向六孔板中加入2毫升新鲜培养基（含或不含药物处理），或向24孔板的每孔中加入0.5毫升培养基。接下来，在超净工作台内，使用无菌镊子将无菌的0.4微米通透性膜插入件小心放入每个孔中。

在感染准备过程中，对可渗透插入物进行轻柔且无菌的操作至关重要，以防止膜在此过程中受损或受到污染。根据制造商的说明，向每个孔的上室加入新鲜的细胞培养基。然后，向可渗透膜插入系统的上室加入适量的标准化细菌培养物，并向对照孔加入细菌培养基。

将细菌小心地加入上室，并轻柔地将感染的细胞转移至培养箱，这一步骤至关重要，因为必须确保在实验设置过程中细菌不会污染下室。为检测分泌的宿主蛋白，使用无菌镊子小心取出可渗透膜小室。然后，在不扰动细胞单层的前提下，将下室中的培养基收集至1.5毫升离心管中。

将样品在14,000 RCF、4°C条件下离心10分钟，以沉淀细胞碎片。然后除去上清液，仅保留50微升，转移至新的1.5毫升离心管中，于-20°C保存或立即使用。在评估宿主细胞裂解物时，轻轻吸去单层细胞上方的培养基，注意不要扰动宿主细胞。

然后，用 PBS 轻柔洗涤细胞一次。吸除 PBS，立即加入预冷的裂解缓冲液，使蛋白浓度达到例如 0.5 至 1.5 毫克/毫升。随后将样品置于冰上孵育 15 分钟。

接下来，使用细胞刮刀将细胞从每个孔的培养板表面刮下，并将每孔的全部内容物转移至一个 1.5 毫升离心管中。然后，在 4°C 条件下以 14,000 RCF 离心 20 分钟。为检测可溶性裂解液组分，将上清液转移至新的离心管中，并于 -20°C 保存，或立即使用。

为评估细胞核或其他不溶性裂解物组分，将沉淀物保留并储存在-20°C，或立即使用。若需通过免疫荧光成像进行检测，吸除培养基后，使用1×冷PBS洗涤细胞，随后用含4% PFA的PBS固定细胞，过夜。

根据文本方案进行进一步分析。此处展示的蛋白质印迹数据表明，在链球菌溶血素S或产SLS的化脓性链球菌菌株存在时，p38 MAP激酶的活化以及角质形成细胞的反应显著增强，提示该系统可用于评估非接触依赖性宿主信号蛋白活化状态的变化。在本图中，显示了SLS依赖性的关键炎症介质核因子-κB的活化情况，该因子在活化后从细胞质转位至细胞核，表明该系统可用于通过免疫荧光显微技术观察分泌型细菌因子对宿主蛋白反应的影响。

与未感染的细胞或暴露于缺乏SLS的菌株的细胞相比，本实验结果显示，暴露于产生SLS的化脓性链球菌（gas）菌株后，宿主细胞的膜通透性显著增加，同时乳酸脱氢酶（LDH）的释放量也显著上升。这些结果表明，该系统可用于评估毒素依赖性的宿主细胞毒性变化。在本实验中，测定了角质形成细胞中的ATP水平及其对化脓性链球菌感染的反应。

感染后16小时，观察到ATP显著减少，且在SLS存在下ATP的损失更为明显，这与毒素依赖性的宿主应激反应信号增强及毒性作用一致。该技术一旦建立，可用于研究任何分泌型微生物因子对多种宿主细胞类型的特异性反应。在执行该实验过程中，务必在整个实验设置步骤中保持无菌操作，并在初始设置以及样品采集过程中谨慎操作可渗透膜小室。

通过该实验流程，可进一步开展蛋白质印迹（western blotting）、免疫荧光成像以及细胞膜通透性检测等方法，以确定目标细菌因子在感染过程中如何影响信号转导级联反应，并调控整体细胞毒性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备宿主细胞样本，以评估宿主细胞在暴露于特定分泌型细菌因子后所产生的一系列细胞反应。请务必注意，操作细菌病原体等生物危害性材料时，必须遵循相应的安全防护措施。

安全进行这些实验需要正确使用护目镜、手套和实验服，并恰当地使用生物安全柜。