基于插入渗透膜感染系统的实现研究分泌细菌病毒对哺乳动物宿主细胞的作用
August 19th, 2016
这里，说明使用可透膜基于插入物感染系统研究链球菌溶血素S，由A群链球菌产生的分泌毒素的效果的方法中，在角质形成细胞。这个系统可以很容易地应用到各种宿主细胞类型的其他分泌的细菌蛋白的感染过程中的研究。
这种基于渗透性膜插入物的感染系统的总体目标是研究感染过程中分泌的细菌毒素对宿主细胞的影响。这种方法可以帮助回答宿主-病原体相互作用领域的关键问题，例如特定分泌的细菌成分如何促进细菌感染期间的宿主细胞反应。该技术的主要优点是它允许研究分泌的细菌成分，并在人类感染的背景下更紧密地模拟生理相关的宿主病原体环境。
演示该程序的是我实验室的高年级研究生 Rebecca Flaherty。为了制备同基因野生型 A 组链球菌 （GAS） 和 GAS M1T1 5448 突变菌株，通过接种 5 至 10 毫升 Todd Hewitt 肉汤并在 37 摄氏度下孵育 16 小时来开始过夜液体培养。离心过夜的细菌培养物，并使用原始体积的新鲜细菌培养基重悬沉淀。
然后，通过在额外的培养基中稀释重悬的培养物以达到相同的 OD 600，将细菌培养物标准化至相等的起始浓度。为了收集裂解物以进行信号分析和 ATP 测定测定，将 HaCaT 细胞以大约三倍的 10 倍的座密度接种在六孔培养皿中，并培养至 90% 汇合。为了进行乙锭同型二聚体膜透化和乳酸脱氢酶释放测定，将 HaCaT 细胞以大约 5 倍的 10 倍的座密度接种在 24 孔培养皿中，并生长至 90% 汇合。
在处理之前，立即使用 1x PBS 洗涤细胞。然后将 2 毫升新鲜生长培养基（含或不含药物治疗）涂注于 6 孔板中，或将 0.5 毫升培养基涂注于 24 孔板的孔中。接下来，在层流罩下，使用无菌镊子小心地将无菌 0.4 微米可渗透膜插入物放入每个孔中。
在感染准备过程中，对可渗透性插入物进行温和无菌的处理对于防止膜在此过程中受损或污染至关重要。根据制造商的说明，将新鲜的细胞培养培养基添加到每个孔的上腔室中。然后，将适当体积的标准化细菌培养物应用于可渗透膜插入系统的上腔室，并将细菌培养基应用于对照孔中。
小心地将细菌添加到上腔室中，以及将受感染的细胞轻柔地运输到培养箱中，这一点至关重要，因为在实验设置过程中，细菌不会污染下腔室。为了评估分泌的宿主蛋白，使用无菌镊子小心地取出可渗透的膜插入物。然后，在不干扰单层细胞的情况下，将培养基从下腔收集到 1.5 毫升试管中。
将样品在 14， 000 RCF 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。然后，除去除 50 微升外的所有上清液，转移到新鲜的 1.5 毫升试管中，并在零下 20 摄氏度下储存，或立即使用。为了评估宿主细胞裂解物，轻轻吸出单层上方的培养基，而不会干扰宿主细胞。
然后，使用 PBS 冲洗细胞一次。轻轻吸出 PBS，并立即加入一体积的冰冷裂解缓冲液，以达到 0.5 至 1.5 毫克/毫升的蛋白质浓度。然后，将样品在冰上孵育 15 分钟。
接下来，使用细胞刮刀将细胞从每个孔的板表面分离，并将每个孔的全部内容物转移到 1.5 毫升的试管中。然后，将样品在 14， 000 RCF 和 4 摄氏度下离心 20 分钟。为了评估可溶性裂解酸盐成分，将上清液转移到新试管中，并在零下 20 摄氏度下储存，或立即使用。
要评估细胞核或其他不溶性裂解物成分，请保留沉淀并储存在零下 20 摄氏度，或立即使用。为了通过免疫荧光成像进行评估，吸出培养基并使用 1x 冷 PBS 洗涤细胞。然后，用 4% PFA 和 PBS 将细胞固定过夜。
根据文本协议进行进一步分析。此处显示的蛋白质印迹数据表明，在链球菌溶血素 S 或 SLS 产生气体菌株存在的情况下，p38 MAP 激酶激活和角质形成细胞显著增强，表明该系统可用于评估接触非依赖性宿主信号转导蛋白激活的变化。在该图中，显示了关键炎症介质核因子 κ B 的 SLS 依赖性激活，该因子在激活后从细胞质转移到细胞核，表明该系统可用于使用免疫荧光显微镜方法可视化分泌的细菌因子对宿主蛋白反应的影响。
在这里，与未感染的细胞或暴露于 SLS 缺陷菌株的细胞相比，暴露于产生 SLS 的气体菌株后，膜通透性和宿主细胞释放 LDH 的显著增加。这些结果表明，该系统可以评估宿主细胞毒性的毒素依赖性变化。在本实验中，测定了角质形成细胞中 ATP 的水平和对气体感染的反应。
感染后 16 小时，观察到 ATP 显着降低，并且在 SLS 存在下 ATP 的丢失更为明显，与宿主应激反应信号和毒性的毒素依赖性增加一致。一旦建立，该技术可用于研究任何分泌的微生物因子对各种宿主细胞类型的特异性反应。在执行此程序时，重要的是在整个实验设置步骤中采用无菌技术，并在初始设置和样品采集期间保持对可渗透膜插入物的小心处理。
按照此程序，可以进行蛋白质印迹、免疫荧光成像和膜透化测定等方法，以确定感兴趣的细菌因子如何促进信号级联反应的变化并影响感染期间的整体细胞毒性。观看本视频后，您应该对如何制备宿主细胞样品有很好的了解，以便在暴露于特定的分泌性目标细菌因子后评估各种宿主细胞反应。不要忘记，处理细菌病原体等生物危害性材料需要考虑一定的安全因素。
正确使用安全眼镜、手套和实验室外套，以及正确使用生物安全罩，对于安全进行这些实验是必要的。
概述
本文描述了一种基于可渗透膜插入的感染系统，用于研究链球菌溶血素S（一种由A组链球菌产生的毒素）对角质细胞的影响。该方法模拟了宿主-病原体相互作用，可应用于各种分泌的细菌蛋白。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 宿主-病原体相互作用
背景
- 链球菌溶血素S是A组链球菌分泌的毒素。
- 了解细菌毒素可以揭示宿主细胞反应的洞见。
- 该方法允许在更生理相关的环境中研究感染。
- 它可以适应各种细菌蛋白和宿主细胞类型。
研究目的
- 研究分泌的细菌毒素对宿主细胞的影响。
- 在受控环境中模拟宿主-病原体相互作用。
- 评估感染过程中宿主信号通路的激活。
使用的方法
- 细菌培养的制备和浓度的标准化。
- 使用可渗透膜插入进行细菌和宿主细胞的共培养。
- 细胞活力、信号分析和ATP测定的分析。
- 免疫荧光显微镜以可视化宿主蛋白反应。
主要结果
- 暴露于链球菌溶血素S的角质细胞中p38 MAP激酶的激活增加。
- 宿主细胞的显著膜通透性和LDH释放。
- SLS产生菌株感染后角质细胞中ATP水平的降低。
- 展示了研究各种分泌的微生物因子的潜力。
结论
- 可渗透膜插入系统有效地模拟了细菌感染。
- 它提供了关于细菌毒素细胞毒性效应的洞见。
- 这种技术可用于更广泛的研究宿主对微生物因子的反应。
常见问题
Executive Industry Relevance
Modeling the effects of secreted bacterial toxins on mammalian host cells is critical for de-risking early anti-infective discovery and understanding host-pathogen interactions. The permeable membrane insert-based infection system enables physiologically relevant interrogation of toxin-mediated cellular responses, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This approach informs portfolio decisions by clarifying the functional impact of secreted virulence factors under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of secreted bacterial toxin effects on host cell signaling and viability.
- Supports mechanistic de-risking by isolating contact-independent host responses.
- Facilitates functional target validation for virulence factors with complex post-translational modifications.
- Improves predictive confidence by modeling continuous toxin exposure as in natural infection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated host-pathogen co-culture systems for downstream cytotoxicity and signaling assays.
- Standardizes quantitative readouts such as membrane permeabilization, LDH release, and ATP depletion.
- Enables reproducible assessment of toxin-dependent cellular phenotypes across experimental runs.
- Supports scalable adaptation to diverse host cell types and secreted factors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant host responses observed during infection.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model development for anti-virulence strategies.
- Enables risk-adjusted advancement of candidates targeting secreted bacterial factors.
Pipeline & Workflow Integration
This system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of secreted toxin effects in a controlled, physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing for toxin-mediated host cell responses and pathway activation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for cytotoxicity and signaling assays.
- Analytics: Provides statistical comparison of wild-type versus mutant bacterial strains and pharmacological interventions.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with in vivo infection models when supported by downstream studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable platform for evaluating diverse secreted microbial factors across multiple host cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity for secreted virulence factors.
- Operational Value: Standardizes infection modeling and enables reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying toxin-specific cellular effects under physiologically relevant conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective and host-directed therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique and host-pathogen co-culture systems.
- Needs access to permeable membrane inserts, cell culture infrastructure, and analytical assays (e.g., western blot, immunofluorescence, cytotoxicity).
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various host cell types and secreted factors with protocol optimization.
- Biohazard safety protocols are essential for handling pathogenic bacteria and infectious materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Bacterial Culture
1:48
Host Cell Infection with Permeable Membrane Insert System
3:52
Sample Collection
6:13
Results: Effect of Secreted Group A Streptococcus Toxins on Host Cells Using a Permeable Membrane Insert-based Infection System
7:56
Conclusion
