时间推移显微镜早期胚胎发育线虫

本文介绍的线虫胚胎发育的早期事件的可视化技术

以下实验的总体目标是记录早期胚胎发生过程中的亚细胞事件 Insino Ratu 优雅。这是通过使用具有多种荧光标记蛋白的转基因菌株来实现的，这些蛋白允许 DNA 以及囊泡亚群的可视化。在早期胚胎中，通过将荧光染料（例如 Lyo 追踪剂或 MIT 追踪剂）显微注射到成虫的性腺中来标记特定的细胞器。接下来，从成虫中切下胚胎，并用共聚焦显微镜观察，以获得细胞器中标记蛋白质运动的延时记录。

最终，该方案揭示了溶酶体和 GFP 标记的囊泡在 CL 过敏原早期发育过程中的有趣运动。我叫 Connie Hedger，今天我将向您展示我们如何在我们的实验室（位于亨茨维尔的阿拉巴马大学的 Boyd 实验室）进行延时显微镜检查。在这个实验中，NGM 农用盘上的格子线虫，在实验前一天在 25 摄氏度的 OP 50 细菌草坪上，将至少 40 升四只幼虫采摘到坐板上，并在 25 摄氏度下孵育过夜。

这些蠕虫将是年轻的成年人。对于实验。将两滴 2%aros 的水中滴入两个盖玻片之间的玻璃盖玻片之间，然后施加压力将 agros 塑造成直径为 1.5 厘米的圆圈，从而制作注射垫。

取下顶盖玻片，将垫子放入 80 摄氏度的烤箱中 1 小时，使其脱水，或让它在工作台上放置过夜。在注射当天，准备稀释的 MIT 追踪剂或莱奥追踪剂染料溶液，并从 1.2 od 玻璃毛细管中拉出注射针。用稀释的染料溶液回填针头，并将它们存放在黑暗的加湿室中，将注射针安装到微型纵器上，并将针头连接到带有 1.2 毫米内径管的压力调节器。

现在将两滴重矿物油滴在注射垫上。将注射垫放在显微镜上，然后将注射针放入油中。施加注射压力并观察流体是否从针头中流出。

如果没有，您需要轻轻地将针头插入放置在注射垫上的一小块破盖玻璃中，轻轻地折断针头的末端。针头流动后，在观察胚胎前 1 小时进行 pro 注射。使用图片将年轻的成虫转移到注射垫上的油滴中。

平行排列 3 到 10 个蠕虫，间隔小于 1 个蠕虫长度。现在重要的是在蠕虫干燥之前快速注射蠕虫。将带有蠕虫的垫子移动到显微镜载物台上。

聚焦于远端性腺的中央部分。然后使用微型机械手将针尖移动到同一焦平面中。通过水平移动载物台来刺穿蠕虫。

当针尖在针尖内时，施加压力以用染料混合物填充性腺。性腺会随着注射量的增加而扩大。继续注射。

注射后，两者都会进入每个蠕虫的网臂。用 0.5 毫升的鸡蛋缓冲液覆盖蠕虫。使用拉动的牧场移液器，然后让蠕虫在室温下在无光加湿室中恢复一到两个小时。

首先准备一个新的 agros 垫，以便用过去的移液器观察注射的胚胎。将三滴熔融的 agros 放在干净的显微镜载玻片上，然后将该载玻片放在包裹在一层标签中的其他两张载玻片之间。Tape （胶带） 胶带控制焊盘的厚度。

接下来，将干净的显微镜载玻片向下压到 agros 滴剂上，使其放在载玻片上。在胚胎准备好安装之前，不要取下顶部载玻片。现在将 20 微升鸡蛋缓冲液滴到盖玻片的中心，并将注射的蠕虫转移到缓冲液中 在解剖显微镜下，在外阴附近切开蠕虫。

使用 26 号皮下注射针头，胚胎会从蠕虫中溢出。现在取下成像载玻片的顶部载玻片，将 aros 垫倒置到装有胚胎的盖玻片上。如果胚胎将在较长时间内成像，请用凡士林密封盖玻片的边缘以防止干燥。

现在，通过在 10 倍目标下定位胚胎来开始成像，以找到早期胚胎，寻找正在完成母体减数分裂过程中的胚胎。肌炎胚胎可以与后来的胚胎区分开来，因为它们没有经历缩短。减数分裂完成后，胚胎前端的细胞膜和蛋壳之间存在显着间隙。

一旦确定了适当分期的胚胎，就移动到更高放大倍率的镜头来记录胚胎发生。该胚胎表达 M cherry 组蛋白、两个 B 和 GFP 泛素标记蛋白。母系和父系 DNA 可通过 M cherry H two B 可见，因此显示了早期发育的阶段。

该胚胎注射了 OC Tracker blue 并表达 GFP 泛素。图像是使用 63 x 1.4 NA 镜头收集的，其中 4 88 和 5 55 激光器设置为最小功率和最大增益。通常，在发生光漂白之前，每 10 到 15 秒收集一次 Zacks，最多收集 60 个时间点。

对于此 TimeLapse 视频，Z 堆栈在执行延时拍摄时折叠为最大投影图像。显微镜胚胎应在完成肌病 2 后的几分钟内和 20 分钟内开始原核迁移。第一次胞质分裂应该开始。

如果您观察到胚胎发育停滞，请尝试降低激光强度或使用较厚的 augurous pad 垫。