有丝分裂细胞同步与高分辨共聚焦显微镜联合应用研究细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

该程序的总体目标是使用双胸苷同步和高分辨率共聚焦显微镜来研究可能具有关键间期功能的多功能蛋白的有丝分裂作用。这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，即如何描述参与细胞周期和有丝分裂的蛋白质的正常功能。这种技术的主要优点是，细胞可以保持其正常的生理行为，并且这种方法也很容易执行。

演示此程序的是我实验室的博士后 Mohammed Amin 博士，他是使用此方法的专家。对于有丝分裂细胞进展的固定细胞成像，首先将大约 2 乘以 10 至第五个 HeLa 细胞接种到六孔板的每个孔中，该孔板含有 70% 乙醇和 UV 灭菌的盖玻片和 2 毫升 DMEM 培养基。在细胞培养箱中放置 24 小时后，每孔用 2 mL 新鲜稀释的胸苷和新鲜培养基封闭细胞，然后将板放回培养箱中再放置 18 小时。

第二天，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞两次，用新鲜的 37 摄氏度培养基洗涤一次。将细胞放回培养箱中 9 小时，以将细胞从模块中释放出来，然后每孔再添加 2 mL 添加胸苷的培养基。第二次封闭孵育后，用 2 mL PBS 洗涤细胞 2 次，用 2 mL 新鲜 37 °C 培养基洗涤 1 次，并将 100 纳摩尔新鲜制备的 siRNA 添加到适当的孔中。

9 到 10 小时后，吸出上清液，并在室温下用 4% 多聚甲醛将细胞固定在盖玻片上 20 分钟。用 PBS 洗涤后，在室温下用 0.5% 去污剂透化固定的细胞 10 分钟，然后在 PBS 中洗涤两次，每次 5 分钟。在室温下用 1% BSA 的 PBS 溶液封闭细胞 1 小时。

然后用 50 微升目标一抗在 37 摄氏度下标记细胞 1 小时。孵育结束时，在 PBS 中洗涤细胞 3 次，并用 50 μL 适当的目标二抗标记它们。在室温下 1 小时后，在 PBS 中洗涤细胞 2 次，每次洗涤 5 分钟，并在室温下用 DAPI 标记细胞 5 分钟。

在 PBS 中洗涤两次 5 分钟后进行 DAPI 染色，并使用适当的安装介质将盖玻片安装在单个透明显微镜载玻片上。然后，使用安装在配备适当相机的倒置高分辨率共聚焦显微镜上的 60 或 100 X 1.4 数值孔径平面复消色差 DIC 油浸物镜，获取 0.2 微米厚的 Z 堆栈中免疫染色蛋白质的图像。对于有丝分裂细胞进程的活细胞成像，将稳定表达 mCherry H2B 和 GFP α-微管蛋白的大约 0.5 至 1 倍 10 至第五个 HeLa 细胞接种到含有 1.5 毫升 DMEM 培养基的 35 毫升玻璃底培养皿中。

将细胞在细胞培养箱中培养 24 小时。然后，胸苷封闭细胞两次，如刚才所示，这次在每个胸苷块的末端用 2 毫升 PBS 洗涤细胞两次，用 1 毫升预热的 DMEM 培养基洗涤一次，并在第一次封闭后用 siRNA 处理细胞在第一次胸苷洗脱期间。在新鲜的预热 Leibovitz 培养基中培养细胞，补充有 10% FBS 和 20 毫摩尔 HEPES 8 小时，以将细胞从第二个块中释放出来。

然后将第一块板放入高分辨率共聚焦显微镜的温控室中，并使用 60 X 物镜和明场成像使细胞聚焦。当细胞可见时，手动将板位置调整到所选区域，并使用图像采集软件设置激光功率和曝光、图像采集参数和实验持续时间。选择合适的 GFP 和 mCherry 滤光片，每 10 分钟采集一次脉冲透射光和荧光图像，持续长达 16 小时，以获得有丝分裂过程的延时图像。

从双胸苷阻滞中释放 9 小时后，在 12 个相隔 1 微米的 z 平面上获取图像。然后通过跟踪单个有丝分裂细胞来分析图像，并使用适当的源软件组装相应的电影。尽管大多数对照细胞和 Cdt1 siRNA 细胞在从双胸苷阻滞释放后 9 小时处于中期，但 10 小时时的固定显示大多数 Cdt1 siRNA 处理的细胞仍然停滞在前中期晚期，而对照细胞进入后期并按预期分离其染色体。

从双胸苷阻滞中释放 9 小时后冷处理有助于保留稳定的着丝粒微管，与对照耗尽细胞中的细胞相比，这些微管在 Cdt1 耗尽的细胞中相对不那么坚固。在 G2-M 期，Cdt1 或对照耗尽细胞的 DNA 复制起点许可不会受到干扰，因为未发现这些细胞在随后的 G2 期诱导磷酸化 γ H2AX（DNA 损伤的标志物）的积累。然而，异步培养物的 Cdt1 siRNA 转染会诱导磷酸化 γ H2AX 阳性病灶的积累，这可能是由于 DNA 复制许可不当诱导的 DNA 损伤。

核膜破裂后，正常细胞进入有丝分裂，并在约 30 至 60 分钟内经历后期开始以退出有丝分裂。RNAi 介导的 Hec1 敲低是着丝粒微管附着形成所需的关键着丝粒蛋白，然而，即使在有丝分裂延迟数小时后，也会延迟正常的有丝分裂进展至后期开始或退出有丝分裂。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四天内完成。

在尝试该程序时，重要的是要记住在从冰箱中解冻后将胸苷完全溶解。在此程序之后，可以执行其他方法（如蛋白质印迹）来回答其他问题，例如，与间期相比，有丝分裂期间目标蛋白质的表达模式是什么？开发后，该技术为细胞生物学领域的研究人员在人类细胞培养模型中探索癌症生物发生铺平了道路，并使用高分辨率共聚焦显微镜来识别目标蛋白质的细胞周期相关功能。

不要忘记，使用多聚甲醛和 DAPI 等试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验服。