结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

本实验的总体目标是利用双胸苷同步法和高分辨率共聚焦显微镜，研究具有重要间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。该方法有助于解答细胞生物学领域中的关键问题，即如何明确参与细胞周期和有丝分裂的蛋白质的正常功能。该技术的主要优势在于，细胞能够保持其正常的生理行为，且该方法操作简便。

本次实验操作由我实验室的博士后 Mohammed Amin 博士进行演示，他在此方法的应用方面具有丰富经验。进行有丝分裂细胞进程的固定细胞成像时，首先将约 2 × 10⁵ 个 HeLa 细胞接种至六孔板的每个孔中，每孔含有经 70% 乙醇和紫外光灭菌的盖玻片以及 2 毫升 DMEM 培养基。在细胞培养箱中培养 24 小时后，每孔加入 2 毫升新稀释的胸腺嘧啶和新鲜培养基对细胞进行阻断处理，然后将培养板放回培养箱继续孵育 18 小时。

第二天，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞两次，再用 2 毫升新鲜的 37 摄氏度培养基洗涤一次。将细胞放回培养箱中孵育 9 小时，以解除阻断，随后每孔加入 2 毫升含胸苷的培养基。第二次阻断孵育后，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞两次，再用 2 毫升新鲜的 37 摄氏度培养基洗涤一次，并向相应的孔中加入 100 纳摩尔新配制的 siRNA。

孵育9至10小时后，吸去上清液，并在室温下用4%多聚甲醛将细胞固定在盖玻片上，持续20分钟。用PBS洗涤后，在室温下用0.5%去垢剂对固定后的细胞透化处理10分钟，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟。在室温下用含1% BSA的PBS溶液封闭细胞，持续1小时。

然后在37摄氏度下，用50微升目标一抗孵育细胞1小时。孵育结束后，用PBS洗涤细胞3次，再加入50微升相应的目标二抗进行标记。室温孵育1小时后，用PBS洗涤细胞2次，每次5分钟，最后在室温下用DAPI染色5分钟。

DAPI染色后，用PBS洗涤两次，每次五分钟，然后使用适当的封片剂将盖玻片封于独立的透明显微镜载玻片上。接着，使用倒置高分辨率共聚焦显微镜，配备合适的相机以及60或100倍、数值孔径1.4的平场复消色差DIC油浸物镜，以0.2微米厚度的Z轴层扫描方式采集免疫荧光标记蛋白的图像。对于有丝分裂细胞进程的活细胞成像，将约0.5×10⁵至1×10⁵个稳定表达mCherry H2B和GFP alpha-tubulin的HeLa细胞接种于含1.5毫升DMEM培养基的35毫米玻璃底培养皿中。

将细胞置于细胞培养箱中培养24小时。随后，按照上述方法对细胞进行两次胸腺嘧啶核苷阻断，每次阻断结束时，用2毫升PBS洗涤细胞两次，再用1毫升预温的DMEM培养基洗涤一次，并在第一次阻断后的首次胸腺嘧啶核苷洗脱期间对细胞进行siRNA处理。将细胞转入新鲜的预温Leibovitz's培养基中培养8小时，该培养基需添加10% FBS和20毫摩尔HEPES，以解除第二次阻断。

然后将第一块培养板放入高分辨率共聚焦显微镜的温控腔室中，使用60倍物镜和明场成像使细胞聚焦。当细胞可见时，手动调整培养板位置至目标区域，并使用图像采集软件设置激光功率和曝光时间、图像采集参数以及实验持续时间。选择合适的GFP和mCherry滤光片，每10分钟采集一次透射光脉冲图像和荧光图像，持续最长16小时，以获得有丝分裂过程的延时图像。

从双胸苷阻断释放后9小时，在12个相隔一微米的z平面采集图像。然后通过追踪单个有丝分裂细胞来分析图像，并使用相应的源软件生成对应的动态影像。尽管在从双胸苷阻断释放后9小时，大多数对照组和Cdt1 siRNA处理的细胞均处于中期阶段，但在10小时进行固定时发现，大多数Cdt1 siRNA处理的细胞仍停滞在晚前期，而对照组细胞则如期进入后期并分离其染色体。

双胸苷酸阻断释放后9小时进行冷处理，有助于保留稳定的动粒微管，而在Cdt1耗竭细胞中这些微管的稳定性相对低于对照耗竭细胞。在G2-M期，Cdt1耗竭或对照耗竭细胞中的DNA复制起始许可未受干扰，因为在随后的G2期中未发现这些细胞诱导磷酸化γ-H2AX（DNA损伤标志物）的累积。然而，对非同步培养物转染Cdt1 siRNA会诱导磷酸化γ-H2AX阳性焦点的累积，这可能是由于DNA复制许可异常引起的DNA损伤所致。

核膜破裂后，正常细胞进入有丝分裂，并在大约30至60分钟内启动后期，从而退出有丝分裂。然而，通过RNAi介导敲低Hec1（一种形成稳定动粒微管连接所必需的关键动粒蛋白）会导致细胞在进入后期或退出有丝分裂的过程中出现延迟，即使有丝分裂延迟数小时仍无法恢复正常进程。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三到四天内完成。

在进行该操作步骤时，需注意在将胸苷从冷冻状态解冻后，必须将其完全溶解。完成该步骤后，还可采用其他方法（如蛋白质印迹）来回答更多问题，例如：目标蛋白在有丝分裂期与间期的表达模式有何差异？该技术建立后，为细胞生物学领域的研究人员探索人类细胞培养模型中的癌症发生机制，以及利用高分辨率共聚焦显微镜鉴定目标蛋白在细胞周期中的相关功能，奠定了重要基础。

请注意，使用多聚甲醛和DAPI等试剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，务必采取佩戴手套和实验服等防护措施。