通过两个互补细胞同步方案研究细胞周期调控的基因表达
June 6th, 2017
我们报告两个细胞同步协议，提供一个上下文，用于研究与细胞周期的特定阶段相关的事件。我们表明，这种方法可用于分析未受扰动细胞周期中特定基因的调节，或暴露于影响细胞周期的试剂。
该协议的总体目标是为以细胞周期特异性方式分析基因表达提供上下文。这种方法可以帮助回答癌症领域中与细胞周期依赖性转录事件相关的关键问题，这些问题是恶性转化和抗癌治疗的基础。该方案的主要优点是它在第二种情况下和暴露于化疗后都能准确地建立细胞周期期特异性基因表达模式。
U2OS 细胞用于该实验，并应在晚上 7 点左右接种在 100 毫米的培养皿中，以便可以在工作时间进行后续步骤。将培养皿在 37 摄氏度、含 5% CO2 的潮湿气氛中孵育 24 小时，让细胞附着。
第二天检查细胞以确认它们处于 50% 汇合度。对于胸苷块，向每个 100 毫米培养皿中加入 100 微升新鲜制备的 200 毫摩尔胸苷原液。将细胞与胸苷在 37 摄氏度、含 5%CO2 的潮湿气氛中孵育 20 小时。
第二天，大约下午三点，通过去除含有胸苷的生长培养基，从胸苷块中释放细胞。用预热的 1X PBS 洗涤细胞两次。
然后向每个 100 毫米培养皿中加入 10 毫升完全培养基。将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 小时。对于有丝分裂细胞阻滞，添加诺考达唑至终浓度为 50 ng/mL。
将细胞与诺考达唑一起孵育不超过 10 至 11 小时。第二天早上，在早上 6 点到 7 点之间，在显微镜下检查细胞，确认它们确实被 G2-M 封闭，从它们圆形的外观可以看出。
通过摇动每个板，并从每个 100 毫米板中轻轻移液含有含有脱离细胞的诺考达唑的生长培养基来分离有丝分裂细胞。将所有培养皿中的有丝分裂细胞合并到 50 毫升无菌管中。在 4 摄氏度下离心 300 倍 g 5 分钟。
加入冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，然后离心。从第二次洗涤中去除 PBS 后，将有丝分裂细胞重悬于完全培养基中。节省 2 毫升用于 RNA 提取，节省 2 毫升用于零小时时间点的 FACS 分析。
在 6 个孔板中的后续时间点重新铺板剩余的有丝分裂细胞。要开始此过程，将 0.25 乘以 10 接种到六孔板中的第六个 U 2OS 细胞。在每个 6 孔板的盖子上写下每个孔的实验条件。
例如，未经治疗或用不同浓度的药物和时间点治疗。通过将 6 孔板孵育过夜，让细胞附着。第二天早上检查细胞以确认它们处于 50% 汇合度。
从孔中取出完全培养基，每孔加入 2 mL 预热的不含 FBS 的 DMEM-谷氨酰胺培养基。将细胞再孵育 24 小时。要用羟基脲停滞细胞，请从孔中取出培养基，并用新鲜制备的含有 4 微摩尔羟基脲的完全培养基替换。
将细胞在含羟基脲的培养基中孵育 24 小时。在从羟基脲介导的阻滞中释放细胞之前，请检查细胞以确认它们被阻滞。从孔中取出含羟基脲的培养基，并用预热的 1X PBS 冲洗孔两次。
从第二次洗涤中去除 PBS 后，每孔加入 2 mL 完全培养基。将板放在培养箱中，直到收集样品。以相同的方式收集来自两种同步方案的样品，用于 FACS 分析和 RNA 提取。
对于 FACS 分析，用 2 mL 预热的 1X PBS 冲洗每个孔，然后加入 0.3 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA 溶液以分离细胞。5 分钟后，加入 1 mL 完全培养基，灭活胰蛋白酶-EDTA。将每个样品收集在单独的 15 ml 试管中。
在室温下以 300 倍 G 离心细胞 5 分钟。弃去上清液，用 1X PBS 洗涤并再次离心。去除 PBS 并保存细胞沉淀。
为了固定细胞，通过轻轻涡旋将每个细胞沉淀重悬于一毫升冷冻的 70% 乙醇中。将细胞置于冰上约 15 分钟，然后进行碘化丙啶染色和 FACS 分析。对于 RNA 提取，去除培养基并用 2 mL 预热的 1X PBS 冲洗每个孔。
将板放入安全柜中，每孔加入 1 毫升合适的 RNA 分离试剂。上下吹打以移液和裂解细胞，然后将每个细胞裂解物转移到 1.5 mL 微量离心管中。在室温下孵育 5 分钟。
从冰箱中取出装有 RNA 分离试剂样品的微量离心管，并在化学品安全柜内在室温下解冻，以开始 RNA 提取程序。向每个样品中加入 400 微升氯仿，并剧烈摇晃而不涡旋，直至完全混合。将样品在室温下孵育 5 分钟。
在台式微量离心机中离心试管 15 分钟。将每个样品的水相转移到新的 1.5 mmer 微量离心管中。混合时，将一体积的 100% 乙醇缓慢、逐滴地加入到水相中。
请勿离心。在市售 RNA 小量制备试剂盒提供的 2 mL 收集管中，转移最多 700 μL 每个样品，包括可能已形成离心柱的任何沉淀物，然后盖上盖子。离心 15 秒。
丢弃流出物。如果每个样品的起始量超过 700 μL，请将剩余样品转移到离心柱中，然后再次离心。按照制造商的说明洗涤 RNA 后，将 30 至 40 μL 无核酸酶的水移液到离心柱中，并在室温下离心 1 分钟，以洗脱每个样品。
通过吸光度测量确定样品的 RNA 浓度和纯度。将 RNA 样品储存在零下 80 摄氏度，直到用于基因表达分析。胸苷-诺考达唑方案的处理将 U2OS 细胞停滞在 m 期进入，并提供同步通过 G1 进入 S 期的细胞群，如流式细胞术分析所示。
羟基脲方案的处理将细胞停在 G1/S 边界。释放后，细胞同步过渡到 S 期和 G2 期。胸苷-诺考达唑方案最适合分析在 G1 期具有峰值表达的基因的 mRNA 谱。
如 E2F1 表达式所示。相比之下，羟基脲方案更适合分析在 S 或 G2 中优先表达的基因，如 E2F7 表达所示。细胞周期通常受到抗肿瘤药物的干扰，显示丝裂霉素 C 在羟基脲同步细胞中永久停滞 G2 期。
细胞同步有助于区分对抗肿瘤药物有反应的基因与仅受药物施加的细胞周期扰动影响的基因，例如，丝裂霉素 C 处理后 E2F1 mRNA 水平的降低可能是药物对细胞周期动力学的间接影响。相比之下，丝裂霉素 C 处理后 p21-Cip1 mRNA 表达的峰值是该药物触发的转录程序的直接结果。按照此程序，可以进行全基因组转录组学和蛋白质组学分析，以揭示影响特定细胞周期阶段的整体基因表达变化。
要么在第二种情况下，要么在抗肿瘤治疗中。观看此视频后，您应该对在同步细胞培养物中进行基因表达分析所需的程序有很好的了解。不要忘记，使用碘化丙啶或 RNA 分离试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如手套和化学品安全柜。
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概览
本文介绍了两种细胞同步化协议，旨在分析细胞周期特定阶段的基因表达。这些协议对于研究癌症相关的转录事件和化疗的影响特别有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 癌症研究
- 基因表达
背景
- 理解细胞周期调控对癌症研究至关重要。
- 不同细胞周期阶段的基因表达模式可能有显著差异。
- 细胞同步化技术可以帮助分离这些阶段以便研究。
- U2OS细胞常用于此类实验。
研究目的
- 建立分析细胞周期特定基因表达的协议。
- 研究可能导致恶性转化的转录事件。
- 评估化疗对细胞周期基因表达的影响。
使用的方法
- 为U2OS细胞开发了细胞同步化协议。
- 细胞被接种在100毫米的培养皿中，并在特定条件下孵育。
- 在未干扰和处理条件下分析了基因表达。
- 实验设计为在标准工作时间内进行。
主要结果
- 这些协议成功地建立了细胞周期特定的基因表达模式。
- 结果表明化疗暴露后基因表达发生显著变化。
- 研究结果有助于理解癌症的分子机制。
- 这些方法可应用于进一步的癌症治疗研究。
结论
- 细胞同步化是癌症研究中研究基因表达的有价值工具。
- 建立的协议可以增强对细胞周期动力学的理解。
- 未来的研究可以在这些发现基础上探索治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate cell-cycle phase-specific gene expression analysis is critical for de-risking target validation in oncology drug discovery. This dual-protocol approach enables discrimination between direct drug effects and cell-cycle-mediated artifacts, improving predictive confidence in mechanistic studies. It supports early discovery workflows by providing synchronized models for probing transcriptional responses to genotoxic agents.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by isolating gene expression changes specific to G1/S or G2/M phases.
- Operational Value: Reduces false positives in target validation by distinguishing drug-induced transcriptional responses from cell-cycle artifacts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target mechanisms by correlating expression profiles (e.g., E2F1, E2F7, p21-Cip1) with defined cell-cycle phases.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized cell populations suitable for consistent, reproducible transcriptional profiling across time points.
- Quantitative Output: Enables measurement of phase-specific gene expression changes via RNA extraction and downstream analysis.
- Scalability: Compatible with multi-well formats for dose-response or time-course studies in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to cancer models where cell-cycle dysregulation drives pathogenesis.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanistic insights with preclinical evaluation of genotoxic agents like mitomycin C.
- Risk Mitigation: Supports go/no-go decisions by clarifying whether observed gene expression changes are on-target or cell-cycle-mediated.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling phase-specific transcriptional analysis before lead optimization and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating cell-cycle-specific transcriptional events.
- Screening: Generates standardized, synchronized models for reliable compound-induced expression profiling.
- Analytics: Delivers quantitative, phase-resolved gene expression data essential for comparing treatment conditions.
- Translational Research: Connects early mechanistic findings to preclinical models by preserving cell-cycle context in drug response studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synchronization platform applicable across multiple targets, pathways, and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized cell populations for consistent transcriptional readouts.
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency by enabling clearer interpretation of drug effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by de-risking targets prone to cell-cycle confounding.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, synchronization techniques, and flow cytometry for cell-cycle validation.
- Dependent on access to flow cytometry and RNA isolation infrastructure for downstream analysis.
- Necessitates cross-team standardization of synchronization timing and sample collection protocols.
- Adaptation considerations include optimizing drug exposure windows relative to release from arrest.
- Practical limitations include potential stress responses from prolonged arrest, necessitating empirical optimization per cell line.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
11:07
Conclusion
9:02
Results: Thy-noc and HU Cell Synchronization Protocols Enable Analysis of Gene Expression During Specific Phases of the Cell Cycle
0:41
Thymidine- and Nocodazole-based (Thy-noc) Synchronization and Release
3:34
HU-based Synchronization and Release from G1/S Boundary
5:14
Collecting Samples for FACS Analysis and RNA Extraction
7:00
RNA Extraction for Gene Expression Analysis
