通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

本实验方案的总体目标是提供一种能够以细胞周期特异性方式分析基因表达的实验框架。该方法有助于解答癌症研究领域中的关键问题，涉及驱动恶性转化及抗癌治疗过程中与细胞周期相关的转录事件。本方案的主要优势在于，它能够精确建立在两种不同条件下以及化疗药物处理后，各细胞周期时相特异性的基因表达模式。

本实验使用U2OS细胞，应在晚上七点左右将细胞接种于100毫米培养皿中，以便后续步骤可在工作时间内进行。将培养皿置于37摄氏度、含5%CO2的湿润环境中孵育24小时，使细胞贴壁。

次日观察细胞，确认其融合度达到50%。进行胸腺嘧啶阻断时，向每个100毫米培养皿中加入100微升 freshly prepared 的200毫摩尔胸腺嘧啶储备液。将细胞置于37摄氏度、含5% CO2的湿润环境中孵育20小时。

次日约下午3点，通过移除含有胸腺嘧啶的生长培养基，解除胸腺嘧啶阻断。用预热的1×PBS洗涤细胞两次。

然后向每个100毫米培养皿中加入10毫升完全培养基。将细胞在37摄氏度条件下孵育5小时。为进行有丝分裂细胞阻滞，加入诺考达唑至终浓度为50纳克/毫升。

用诺考达唑处理细胞，孵育时间不超过10至11小时。次日早晨六点至七点之间，在显微镜下观察细胞，确认其确实阻滞在G2-M期，表现为细胞呈圆形。

通过轻轻摇晃每块培养板使有丝分裂细胞脱落，并用含有脱落细胞的含诺考达唑生长培养基轻柔吹打每块100毫米培养板，收集细胞。将所有培养皿中的有丝分裂细胞合并至一个50毫升无菌离心管中。在4摄氏度下，以300 × g离心5分钟。

用预冷的1× PBS洗涤细胞两次，每次均需离心。第二次洗涤后去除PBS，将有丝分裂期细胞重悬于完全培养基中。分别保留2毫升用于RNA提取，2毫升用于零小时时间点的FACS分析。

将剩余的有丝分裂细胞重新接种至六孔板中，用于后续时间点的实验。开始此操作时，每孔接种 0.25 × 10⁶ 个 U2OS 细胞至六孔板中。在每个六孔板的盖子上标注每孔的实验条件。

例如，用不同浓度的药物处理并设置不同的时间点。将六孔板在培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁。次日早晨观察细胞，确认其融合度达到50%。

吸去孔中的完全培养基，每孔加入2毫升预热的不含FBS的DMEM-谷氨酰胺培养基。将细胞继续培养24小时。为使用羟基脲阻断细胞周期，吸去孔中的培养基，并更换为新鲜配制的含4 µM羟基脲的完全培养基。

将细胞在含有羟基脲的培养基中孵育24小时。在解除羟基脲介导的细胞周期阻滞前，检查细胞以确认其处于阻滞状态。移除含有羟基脲的培养基，用预热的1× PBS洗涤细胞孔两次。

第二次洗涤去除 PBS 后，每孔加入 2 毫升完全培养基。将培养板置于培养箱中，直至收集样品。两种同步化方案的样品均以相同方式收集，用于 FACS 分析和 RNA 提取。

进行FACS分析时，每孔加入两毫升预热的1×PBS洗涤一次，随后加入0.3毫升预热的胰蛋白酶-EDTA溶液以消化细胞。孵育五分钟之后，加入一毫升完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。将每个样本收集至独立的15毫升离心管中。

在室温下以300 × g离心细胞5分钟。弃去上清液，用1× PBS洗涤并再次离心。移除PBS，保留细胞沉淀。

为了固定细胞，将每个细胞沉淀用1毫升预冷的70%乙醇轻轻涡旋重悬。在进行碘化丙啶染色和流式细胞术分析前，将细胞置于冰上约15分钟。进行RNA提取时，移除培养基，并用2毫升预热的1× PBS冲洗每孔。

将培养板转移至生物安全柜中，每孔加入1毫升适当的RNA提取试剂。用移液器反复吹打以裂解细胞，随后将每孔的细胞裂解液转移至1.5毫升微量离心管中。室温孵育5分钟。

从冷冻柜中取出含有RNA分离试剂的微量离心管样本，在化学安全柜内于室温下解冻。向每个样本中加入400 µL氯仿，剧烈振荡（不使用涡旋振荡器）直至充分混匀。将样本在室温下孵育5分钟。

将离心管在台式微量离心机中离心15分钟。将每个样品的水相转移至新的1.5 mL微量离心管中。向水相中缓慢逐滴加入等体积的100%乙醇，同时混合。

不要离心。将每个样品最多700微升（包括可能形成的任何沉淀物）转移至商品化RNA小量提取试剂盒提供的2毫升收集管中的离心柱内，并盖上盖子。离心15秒。

弃去流穿液。若每份样品起始体积超过 700 微升，请将剩余样品转移至离心柱中，再次离心。按照制造商说明书洗涤 RNA 后，通过移液将 30 至 40 微升无核酸酶水加入离心柱中洗脱每份样品，并在室温下离心一分钟。

通过吸光度测量确定样品的RNA浓度和纯度。将RNA样品于-80摄氏度保存，直至用于基因表达分析。胸苷-诺考达唑（Thymidine-Nocodazole）处理方案可使U2OS细胞停滞在M期入口，并提供一个细胞群体，该群体在流式细胞术分析中显示可同步通过G1期进入S期。

采用羟基脲方案处理可使细胞停滞在G1/S期边界。释放后，细胞同步进入S期和G2期。胸腺嘧啶-诺考达唑方案最适合分析在G1期表达达到高峰的基因的mRNA表达谱。

如E2F1表达所示。相比之下，羟基脲法更适用于分析在S期或G2期优先表达的基因，如E2F7表达所示。细胞周期通常受到抗肿瘤药物的干扰，图中显示在经羟基脲同步化的细胞中，丝裂霉素C诱导了永久性的G2期阻滞。

细胞同步化有助于区分那些对肿瘤抑制剂有响应的基因与那些仅受该抑制剂引起的细胞周期扰动影响的基因。例如，丝裂霉素C处理后E2F1 mRNA水平的下降，很可能是药物对细胞周期动态产生的间接效应；相比之下，丝裂霉素C处理后p21-Cip1 mRNA表达的峰值则是由该药物触发的转录程序直接导致的结果。通过此方法，可进行全基因组范围的转录组学以及蛋白质组学分析，以揭示影响特定细胞周期时相的全局性基因表达变化。

无论是在第二种条件下，还是在抗肿瘤治疗过程中。观看本视频后，您应能够充分理解在同步化细胞培养中进行基因表达分析所需的操作步骤。请注意，使用碘化丙啶或RNA提取试剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取适当防护措施，例如佩戴手套并在生物安全柜中操作化学品。