Name: 通过两个互补细胞同步方案研究细胞周期调控的基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学习两种互补细胞同步方案，利用U2OS细胞精确分析细胞周期特异性基因表达模式，揭示癌症相关转录事件及化疗对基因表达的影响机制。

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我们感谢Zubiaga实验室和Altmeyer实验室成员提供的有益讨论和技术支持。本工作得到了西班牙教育部基金（SAF2015-67562-R，MINECO/FEDER，UE）、巴斯克政府（IT634-13 和 KK-2015/89）以及巴斯克大学 UPV/EHU（UFI11/20）的资助。

1. 细胞周期同步化、释放及细胞周期进程监测
<ol>
	<li>基于胸腺嘧啶和诺考达唑（Thy-Noc）的U2OS细胞有丝分裂同步化及释放
	<ol>
		<li>配制所需的细胞培养基。U2OS细胞常规培养于添加了10%（体积比）胎牛血清（FBS）的DMEM-谷氨酰胺培养基中（可选：1%青霉素/链霉素）。所有培养基的配制和操作均须在无菌条件下进行，并将添加了补加物的培养基（以下简称 &#34;完全培养基&#34;使用前将温度升至 37 °C。</li>
		<li>种子 2 × 106 每100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基接种U2OS细胞。为计算所需培养皿数量，需注意每个100 mm培养皿通常可提供足够的有丝分裂细胞，用于重铺约5个6孔板孔（0.2 - 0.25 x 10⁶细胞/孔）。6 细胞/孔）（参见 图1B每个选定时间点需要设置两个孔（一个用于RNA提取，一个用于细胞周期监测）。此外，每个时间点可额外收集第三个孔用于蛋白质分析。 
		&#8203;注意：在晚上（约19点）接种细胞，以便后续步骤可在接下来的工作日工作时间内进行。额外设置2个未同步生长的细胞孔，用于确定流式细胞术分析的补偿参数。</li>
		<li>让细胞贴壁，即将100 mm培养皿置于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 24 小时。</li>
		<li>对于胸腺嘧啶核苷阻断，通过将145.2 mg胸腺嘧啶核苷粉末溶解于3 mL H2O（或等量物质），并通过0.2 µm孔径滤器过滤溶液以灭菌。略微加热可能有助于胸腺嘧啶核苷溶解。向每个100 mm培养皿中加入100 μL新配制的200 mM储备液（终浓度为2 mM）。将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中用胸腺嘧啶核苷孵育20小时。2. 
		&#8203;注意：建议在晚上（约19点）处理细胞，以便有足够时间在次日依次进行胸苷释放和诺考达唑阻断。</li>
		<li>为解除胸腺嘧啶阻断，在次日下午（15:00）移除含胸腺嘧啶的生长培养基；用预热的1×PBS洗涤细胞两次，每100 mm培养皿中加入10 mL完全培养基。将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育5 h。2.</li>
		<li>为实现有丝分裂细胞阻滞，将诺考达唑加入至终浓度为 50 ng/mL（8 pm）。通过将诺考达唑粉末溶于 DMSO 中配制储备液（例如 5 mg/mL），并于 -20 °C 冻存。在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中，用诺考达唑处理细胞，孵育时间不超过 10 - 11 小时。2.</li>
		<li>早期M期（有丝分裂摇落法）解除诺考达唑阻滞，并在多个时间点收集样品（始于上午6-7点）。
		<ol>
			<li>通过轻轻摇晃每个培养皿并用含有诺考达唑的生长培养基轻柔吹打，使呈圆形（有丝分裂期）的细胞脱落。将每个100 mm培养皿中含脱落细胞的培养基收集至50 mL无菌离心管中，以300 × g离心5分钟（室温），然后加入1×洗涤液重悬细胞，重复洗涤两次&#160; PBS洗涤后离心。建议使用冷PBS或含诺考达唑的PBS，以避免有丝分裂滑脱（详见讨论部分）。</li>
			<li>将从每个100 mm培养皿收集的有丝分裂细胞用10 mL完全培养基重悬。为0 h时间点（约0.2–0.25 × 10⁶个细胞）保留2 mL用于RNA提取，另取2 mL用于FACS分析。6 每样本细胞数</li>
			<li>将剩余的有丝分裂细胞重新接种至6孔板中，用于后续时间点的实验（每孔2 mL，接种量为0.2–0.25 × 10⁶个细胞）。6 细胞/孔 
			注意：每个选定的时间点需要2个孔（1个用于RNA分析，1个用于FACS分析）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在选定的时间点收集样品。建议每1.5至3小时取样一次，以获得充分的细胞周期进程曲线。
		<ol>
			<li>RNA提取时，吸除培养基，用2 mL预热的1×PBS充分洗涤，然后加入1 mL适当的RNA提取试剂（例如 TRIzol）加入孔中（此最后一步需在化学安全柜中操作）。用移液器吹打混匀以脱离并裂解细胞，将细胞裂解液转移至1.5 mL微量离心管中，室温孵育5分钟，随后将离心管置于-80 °C保存，直至后续使用。</li>
			<li>进行FACS分析时，用2 mL预热的1×PBS充分洗涤，加入预热的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.3 mL/孔）以解离细胞，再加入1 mL完全培养基终止胰蛋白酶-EDTA反应，并将每份样品分别收集至15 mL离心管中。
			<ol>
				<li>离心细胞（300 × g，5 min，室温），保留细胞沉淀，弃去上清液。为固定细胞，将细胞沉淀用1 mL预冷的70%（v/v）乙醇（溶于1× PBS）轻轻涡旋重悬，冰上放置约15 min，随后置于4 °C保存，或进行后续FACS染色分析（见步骤1.4–1.5）。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于羟基脲的U2OS细胞在G1/S边界的同步化与释放
	<ol>
		<li>按照步骤1.1所述配制完全细胞培养基。</li>
		<li>接种 0.25 x 106 在6孔板中每孔接种U2OS细胞（每孔2 mL完全培养基）。为计算实验所需的孔数，需考虑每个选定的时间点需要2个孔（1个孔用于RNA提取，1个孔用于细胞周期监测），此外还需额外2个孔的非同步生长细胞，用于设定FACS分析的补偿参数。</li>
		<li>让细胞贴壁：将6孔板在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育过夜（O/N）2.</li>
		<li>次日早晨从各孔中移除完全培养基，每孔加入 2 mL 预热的无 FBS DMEM-谷氨酰胺培养基。将细胞在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中继续培养 24 小时。2. 
		&#8203;注意：除2个孔（用于设定流式细胞术参数）外，其余各孔均需进行此步骤。如果仅通过羟基脲（HU）孵育即可实现高效同步化，则可省略血清剥夺步骤。</li>
		<li>使用羟基脲（HU）诱导G1/S期细胞周期阻滞。
		<ol>
			<li>每次使用前配制新鲜的HU储存液（500 mM）。加入2 mL H2将O至76.06 mg的HU粉末溶解于溶剂中并充分混匀。使用孔径为0.2 µm的滤器过滤溶液以实现灭菌。取50 mL完全培养基与400 μL经滤膜除菌的HU储存液混合，得到终浓度为4 mM的HU培养基。</li>
			<li>除用于设定流式细胞术参数所需的2个孔外，移除其余各孔中的培养基，并更换为新配制的含4 mM HU的完全培养基（2 mL/孔）。</li>
			<li>在含 HU 的培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润环境中培养细胞 24 小时2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>释放细胞脱离羟基脲诱导的阻滞。吸除含羟基脲的培养基，用预热的1×PBS缓冲液洗涤细胞两次（每次2 mL）。每孔加入2 mL完全培养基。收集0小时时间点的2个样本（1个用于RNA提取，1个用于流式细胞术验证细胞周期阻滞），另保留2个样本用于流式细胞术参数设置。将剩余孔板放入培养箱中继续培养。</li>
		<li>每1.5至3小时收集一次样品，以获得充分的细胞周期进程分布。在每个时间点，按照1.1.8.1–1.1.8.2节所述进行样品处理（用于RNA提取和FACS分析）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA损伤剂处理 
	注意：每当研究目的是阐明一种化合物的作用时（例如 为了研究基因毒性试剂（DNA损伤剂）对细胞周期事件的影响，可将前述任一种细胞同步化方法与基因毒性试剂处理相结合。在选择同步化方法时，需重点考虑希望分析的细胞周期时相。通常情况下，胸苷-诺考达唑（Thy-Noc）联合处理法适用于研究化合物对G1期或进入S期的影响，而羟基脲（HU）介导的同步化则更适用于研究S期向G2期过渡或进入有丝分裂阶段的相关影响。
	<ol>
		<li>G1期或S期进入过程中基因毒性试剂作用的分析
		<ol>
			<li>按照1.1.2至1.1.6所述方法同步细胞。</li>
			<li>释放细胞脱离诺考达唑，并按照1.1.7步骤所述重新接种细胞。在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育2 孵育3小时，使细胞贴壁，然后再加入试剂（所需孵育时间可能因细胞系而异）。</li>
			<li>按照1.1.8节所述方法添加试剂并采集样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>S-G2期或M期进入过程中基因毒性试剂作用的分析
		<ol>
			<li>按照1.2.2至1.2.5所述同步细胞</li>
			<li>按照1.2.6节所述方法从HU中释放细胞，并立即加入试剂。</li>
			<li>按照1.8节中所述方法采集样品。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析监测细胞周期同步化及进程 
	注意：所有时间点采集的样本以及用于确定FACS设置所需的样本，在固定后（如1.1.8.2所述）均可在4 °C保存。实验中所有样本应同时进行PI溶液染色，随后进行FACS分析。PI可插入双链DNA的大沟中，在535 nm激发光下产生强烈的荧光信号，发射光峰值约为600 nm。由于PI也可与双链RNA结合，因此为获得最佳DNA分辨率，必须用RNase处理细胞。
	<ol>
		<li>现配现用的PI染色液。可通过将PI粉末溶于PBS中制备PI储存液（例如 5 mg/mL）。将储备液置于 4 °C 避光保存。染色液由 PI（140 μM）、柠檬酸钠（38 mM）和 Triton X-100（0.01% v/v）组成。</li>
		<li>预热合适的表面（例如 37 °C</li>
		<li>离心固定后的细胞（450 × g，5 分钟，室温），弃上清液（乙醇），用 1× PBS 洗涤一次。</li>
		<li>再次离心细胞，弃去PBS，除用于FACS设置的一个样本外，其余每个样本加入300 μL PI染色液；该样本中加入PBS。</li>
		<li>将细胞转移至流式管（5 mL 圆底聚苯乙烯管）中。</li>
		<li>向每个样品中加入1 μL RNase A，混匀后于37 °C避光孵育30分钟。样品可在4 °C避光保存，最多保存2至3天。</li>
		<li>通过流式细胞术分析样品中的DNA含量。使用经碘化丙啶（PI）染色的非同步样品确定FACS分析的补偿设置。利用空白样品（未加PI染色液）检测自发荧光。基于PI染色的DNA含量流式细胞术分析基本原理此前已有描述9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过双磷酸化组蛋白H3（Ser10）/碘化丙啶染色法测定有丝分裂指数 
	注意：通过使用针对丝氨酸10位点磷酸化组蛋白H3（pH3）的特异性抗体，结合流式细胞术可轻松检测处于有丝分裂期的细胞。同时进行PI染色有助于确定细胞群体基于DNA含量的分布情况。为优化FACS仪器设置，需准备5个样本：空白对照、仅PI染色、仅pH3染色、仅二抗对照以及双染色样本。
	<ol>
		<li>离心固定细胞（450 × g，5 分钟，4 °C），弃上清液。以下步骤描述了在 15 mL 离心管中进行染色的操作。</li>
		<li>加入1 mL PBS-T（PBS + 0.05% Tween-20）重悬细胞沉淀，离心（450 × g，5 min，4 °C）。弃上清液。</li>
		<li>加入用 PBS-T + 3% BSA 稀释的抗 pH3 抗体（1:500），总体积为 100–200 µL，室温下振荡孵育 2 小时（或 4 °C 过夜）。</li>
		<li>加入2 mL PBS-T（PBS + 0.05% Tween-20），离心（450 × g，5分钟，4 °C）。弃去上清液。</li>
		<li>再次加入2 mL PBS-T重悬沉淀，离心后弃去上清液。</li>
		<li>加入用 PBS-T + 3% BSA 稀释的二抗（针对所选 pH3 抗体，使用抗兔 AlexaFluor 488，稀释比例为 1:500），每样本 100–200 µL，室温下摇床孵育 1 小时（或 4 °C 过夜）。避光操作。</li>
		<li>用 PBS-T（2 mL）按照步骤 1.5.4 中所述方法离心洗涤两次。</li>
		<li>按照所述步骤进行PI染色（步骤1.4.1至1.4.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基因表达分析的样品采集与处理
<ol>
	<li>从冷冻保存中取出含有RNA提取试剂的1.5 mL微量离心管样品，在化学安全柜中室温下解冻。</li>
	<li>向每个样品中加入 400 µL 氯仿，剧烈振荡（切勿涡旋）直至充分混匀。室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>在台式微量离心机中以 ≥8,000 x g 离心 15 分钟（4 °C）。</li>
	<li>将水相（上层）转移至新的1.5 mL微量离心管中，并记录转移的体积（为简化操作，建议在实验的所有样品中收集相等的体积）。</li>
	<li>向水相中边混合边缓慢加入等体积的100%乙醇（逐滴加入）。切勿离心。</li>
	<li>使用商业RNA小量提取试剂盒进行后续步骤。将每个样本最多700 µL（包括可能形成的任何沉淀）移入2 mL收集管中的离心柱内（试剂盒提供）。</li>
	<li>盖上管盖，离心（≥ 8,000 g，室温）15 秒。弃去穿流液。如有剩余样品，重复上一步骤。</li>
	<li>按照制造商说明进行RNA洗涤和洗脱（每个样本用30 - 40 µl无核酸酶的H₂O洗脱）2O，以获得适合下一步实验的RNA浓度）。</li>
	<li>通过吸光度测量确定样本的RNA浓度和纯度（a A260/280 2.0–2.1 的比值表明 RNA 样本纯度良好。将 RNA 样本储存于 -80 °C，直至用于 RT-qPCR 分析。</li>
	<li>对于RNA逆转录为cDNA及后续定量PCR，每个样本取1 µg RNA，并根据制造商说明书配制逆转录反应体系。所得cDNA样本可保存于4 °C（数天内）或-20 °C（较长时间）。 
	注意：实时PCR的样品制备、引物设计及其他相关事项已在文献中得到充分描述22,23.</li>
</ol>

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<li>Kubota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+prereplication+complex+is+blocked+by+mimosine+through+reactive+oxygen+species-activated+ataxia+telangiectasia+mutated+%28ATM%29+protein+without+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage.</a> J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).</li>
<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246 (4930), 629-634 (1989).</li>
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<li>Min, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD51C-deficient+cancer+cells+are+highly+sensitive+to+the+PARP+inhibitor+olaparib%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib.</a> Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分析在细胞周期中具有短暂且特定作用的精细调控基因，需要使用均一的细胞群体。许多研究人员通常使用长期建立的肿瘤细胞系来实现这一目的，并已开发出多种方法以获得同步（或部分同步）的细胞群体，旨在将尽可能多的细胞富集于特定的细胞周期阶段。此外，人们已投入大量努力以改进和优化这些成熟的同步化方法。然而，所有细胞同步化方案均存在局限性，这些局限性可能源于细胞培养物的异质性、同步化操作效率欠佳，或化学同步剂对细胞功能产生的继发性影响等。在应用细胞同步化方案时，必须充分考虑这些限制因素。研究人员需要为其特定的细胞类型或实验选择最合适的同步化方法。即使以完全相同的方式培养不同的细胞系，其最终的同步化效果也可能因多种原因而存在差异。一方面，细胞周期的长度可能因所选细胞系的不同而有所变化；另一方面，由于各细胞系自身的特性不同，同一种抑制剂可能在不同细胞系中产生截然不同的效应25。此外，所选用的抑制剂浓度和处理时间必须针对每种细胞系进行优化，以避免或最小化非预期的细胞毒性副作用26。即使在对上述所有因素进行优化之后，也无法实现100%的细胞在某一特定细胞周期阶段的富...

细胞周期各阶段的转换与严格调控的基因表达程序相偶联。这种协调 &#34;开和关&#34; 细胞周期中基因转录的调控被认为由复杂的转录调控系统控制，这些系统不仅调节基因表达的时机，还调控其表达水平。关键细胞周期组分的失调已被证实与多种疾病的发生相关，并且是肿瘤发生的一个明确标志。1,2基因组范围的转录组分析在酵母和哺乳动物细胞中均已表明，大量基因在细胞周期中表现出周期性的基因表达模式，提示细胞周期中的转录波动反映了特定基因产物在精确时相中的时间需求3,4,5.
研究细胞周期调控基因表达的一个主要任务是将细胞同步至特定的细胞周期时相。细胞同步有助于解析基因表达模式与特定细胞周期时相转换之间的关联，从而加深对众多基因调控机制与功能的理解。细胞同步对于研究抗癌药物作用机制也具有重要意义，因为已知化疗药物既会影响基因表达，也会影响细胞周期动力学6,7。然而，通常难以确定经这些药物处理后所导致的基因表达差异是药物处理的直接反应，还是仅仅源于细胞周期分布变化的间接结果。为了区分这两种可能性，应在添加化疗药物之前，先对细胞进行同步化处理，再分析其基因表达情况。
除某些原代细胞（如新分离的淋巴细胞，这类细胞为处于G0期的同质性细胞群体）外8-, 体外 已建立的细胞系在培养中呈异步生长。在常规培养条件下，这些异步增殖的细胞存在于细胞周期的各个时相，但主要集中在G1期。9因此，该背景条件无法为特定细胞周期阶段的功能或基因表达分析提供最佳实验环境。例如 G1、S 等）非转化的永生化细胞系（例如 成纤维细胞）可以通过所谓的生理学方法进行同步化10这些方法基于非转化细胞保留的原始细胞特性，例如细胞接触抑制和生长因子依赖性，以维持持续的细胞周期循环。去除血清并结合接触抑制可使非转化细胞停滞于G0/G1期。然而，细胞周期的同步化进入与进程通常需要进行传代培养，该过程还涉及人为的细胞脱离与重新接种。10最重要的是，该方法不适用于已转化细胞系的同步化，而目前广泛使用的绝大多数细胞系均属于此类，其特征是缺乏细胞接触介导的生长抑制或对生长因子撤除的响应。因此，显然需要采用其他方法来实现细胞周期特定阶段的高效同步化。总体而言，最常用的同步化方法基于使用化学或药物试剂对细胞周期中某一特定节点进行短暂抑制，通常为DNA合成或有丝分裂纺锤体的形成。通过抑制DNA合成可使细胞停滞于G1晚期或S期早期，从而实现细胞同步化。该目的可通过添加如皂苷（mimosine）等核苷酸生物合成抑制剂来实现。11,12，阿糖胞苷（aphidicolin），一种DNA聚合酶抑制剂13,14，羟基脲，一种核糖核苷酸还原酶抑制剂15,16 或过量的胸腺嘧啶核苷17,18另一方面，微管聚合抑制剂（如秋水仙碱或诺考达唑）能够阻断有丝分裂纺锤体的形成，导致细胞在早期M期同步化。19,20,21.
在本研究中，我们描述了一种基于瞬时化学抑制的双互补同步化方案，用于在 mRNA 水平上研究细胞周期调控基因的表达。该方法对于明确细胞周期相关基因在特定细胞周期过程中的作用至关重要。此外，该方案为研究抗癌治疗的影响提供了一个通用框架，可准确检测药物响应基因，并最大限度地减少因药物引起的细胞周期进程扰动而产生的误判。

<table><tbody><tr><td>DMEM，高糖，含GutaMAX补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965-059</td><td></td></tr><tr><td>FBS，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>胸苷</td><td>SIGMA</td><td>T1895-5G</td><td>现配现用。轻微加热有助于溶解胸苷。</td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>SIGMA</td><td>M-1404</td><td>以DMSO配制储存液，分装成小份，-20 &amp;ordm;C保存</td></tr><tr><td>羟基脲</td><td>SIGMA</td><td>H8627</td><td>现配现用</td></tr><tr><td>来自头状链霉菌（Streptomyces caespitosus）的丝裂霉素C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>以无菌H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O配制1.5 mM储存液，避光，4 &amp;ordm;C保存</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>SIGMA</td><td>P4170</td><td>以无菌PBS配制5 mg/mL储存液，4 &amp;ordm;C避光保存</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.6</td><td></td><td></td><td>实验室自配</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>PANREAC</td><td>A3678,2500</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>SIGMA</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>PANREAC</td><td>131655</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>LifeTechnologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>抗Cyclin E1抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4129</td><td>以5%脱脂牛奶稀释1:1000，4 &amp;ordm;C过夜孵育</td></tr><tr><td>抗Cyclin B1抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4135</td><td>以5%脱脂牛奶稀释1:1000，4 &amp;ordm;C过夜孵育</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-肌动蛋白抗体</td><td>SIGMA</td><td>A-5441</td><td>以5%脱脂牛奶稀释1:3000，室温孵育1小时</td></tr><tr><td>抗pH3（Ser 10）抗体</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>按实验方案说明使用</td></tr><tr><td>二抗：抗兔IgG-AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>R37116</td><td>按实验方案说明使用</td></tr><tr><td>二抗：抗鼠IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3697</td><td>以5%脱脂牛奶稀释1:3000，室温孵育1小时</td></tr><tr><td>人E2F1引物（正向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TGACATCACCAACGTCCTTGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人E2F1引物（反向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CTGTGCGAGGTCCTGGGTC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人E2F7引物（正向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; GGAAAGGCAACAGCAAACTCT</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人E2F7引物（反向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人p21&lt;sup&gt;Cip1 &lt;/sup&gt;引物（正向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人p21&lt;sup&gt;Cip1 &lt;/sup&gt;引物（反向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人TBP引物（正向），内参基因&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人TBP引物（反向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人Oxa1L引物（正向），内参基因&amp;nbsp;&amp;nbsp; CACTTGCCAGAGATCCAGAAG&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>人Oxa1L引物（反向）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>使用PrimerQuest工具设计（https://eu.idtdna.com/site）</td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR主混合液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368702</td><td></td></tr><tr><td>FACS管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>551578</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp光学96孔反应板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC处理培养皿</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 6孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>台式制冷微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>台式制冷离心机Jouan CR3.12</td><td>Jouan</td><td>743205604</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur流式细胞仪</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A28567</td><td></td></tr></tbody></table>

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

细胞周期的基因表达程序是理解细胞周期依赖性过程及其在癌症等疾病中作用的关键步骤。细胞周期调控的基因表达分析依赖于将细胞同步至特定阶段。本文描述了一种常用的方法，该方法结合了两种互补的同步化方案，用于研究细胞周期中基因表达的周期性变化。这两种方案均基于暂时性地将细胞周期阻滞在某一特定节点。通过羟基脲（hydroxyurea, HU）处理的同步化方案可使细胞停滞在G1晚期/S期早期，解除HU诱导的阻滞后，细胞群体能够均一地进入并行进于S期和G2/M期。通过胸苷和诺考达唑（thymidine and nocodazole, Thy-Noc）处理的同步化方案则将细胞阻滞在有丝分裂早期，解除Thy-Noc诱导的阻滞后，可获得适合用于G1期及S期进入研究的同步化细胞群体。这两种方案的应用均需监测细胞周期分布情况，通常在使用碘化丙啶（propidium iodide, PI）对细胞染色后，通过流式细胞术分析DNA含量来实现。我们表明，联合使用这两种同步化方案是一种可靠的方法，可清晰确定在细胞周期中差异调控的基因（即 E2F1 和 E2F7）的转录谱，从而更深入理解这些基因在细胞周期过程中的作用。此外，我们还表明，该方法适用于基于药物治疗机制的研究（即 丝裂霉素C，一种抗癌剂），因为它能够区分对基因毒性药物有响应的基因与仅受药物所引起的细胞周期扰动影响的基因。

细胞同步化中Thy-Noc和基于HU的方案的示意图。
图1总结了为实现U2OS细胞同步化并随后进行样品收集所需的步骤，以验证细胞周期的进程并开展基因表达分析。
磷酸化H3和PI染色是选择同步化方法的良好评估参数。
由于培养细胞本身具有异质性，每种细胞系都必须评估并优化其细胞同步化方案。有丝分裂的同步化通常采用胸苷-诺考达唑（Thy-Noc）法实现，而经诺考达唑处理后有丝分裂细胞的富集效果可通过特异性识别磷酸化组蛋白H3（pH3）的抗体进行评估，pH3是一种典型的有丝分裂标志物。通过鉴定pH3阳性细胞，可区分处于有丝分裂期的细胞与具有4C DNA含量但未进入有丝分裂的细胞（后者在碘化丙啶（PI...

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。

细胞周期的基因表达程序是理解细胞周期依赖性过程及其在疾病中作用的关键步骤，此类疾病包括……

本实验方案的总体目标是提供一种能够以细胞周期特异性方式分析基因表达的实验框架。该方法有助于解答癌症研究领域中的关键问题，涉及驱动恶性转化及抗癌治疗过程中与细胞周期相关的转录事件。本方案的主要优势在于，它能够精确建立在两种不同条件下以及化疗药物处理后，各细胞周期时相特异性的基因表达模式。本实验使用U2OS细胞，应在晚上七点左右将细胞接种于100毫米培养皿中，以便后续步骤可在工作时间内进行。将培养皿置于37摄氏度、含5%CO2的湿润环境中孵育24小时，使细胞贴壁。次日检查细胞，确认其汇合度达到 50%。进行胸苷阻断时，向每个 100 毫米培养皿中加入 100 微升新鲜配制的 200 毫摩尔胸苷储备液。将细胞与胸苷在 37°C、5% CO2 的湿润气氛中孵育 20 小时。次日约下午3点，通过移除含有胸腺嘧啶的生长培养基，解除胸腺嘧啶阻断。用预热的1×PBS洗涤细胞两次。然后向每个100毫米培养皿中加入10毫升完全培养基。将细胞在37摄氏度条件下孵育5小时。为进行有丝分裂细胞阻滞，加入诺考达唑至终浓度为50纳克/毫升。用诺考达唑处理细胞，孵育时间不超过10至11小时。次日早晨六点至七点之间，在显微镜下观察细胞，确认其确实阻滞在G2-M期，表现为细胞呈圆形。通过轻轻摇晃每块培养板使有丝分裂细胞脱落，并用含有脱落细胞的含诺考达唑生长培养基轻柔吹打每块100毫米培养板，收集细胞。将所有培养皿中的有丝分裂细胞合并至一个50毫升无菌离心管中。在4摄氏度下，以300 × g离心5分钟。用预冷的1× PBS洗涤细胞两次，每次均需离心。第二次洗涤后去除PBS，将有丝分裂期细胞重悬于完全培养基中。分别保留2毫升用于RNA提取，2毫升用于零小时时间点的FACS分析。将剩余的有丝分裂细胞重新接种至六孔板中，用于后续时间点的实验。开始此操作时，每孔接种 0.25 × 10⁶ 个 U2OS 细胞至六孔板中。在每个六孔板的盖子上标注每孔的实验条件。例如，用不同浓度的药物处理并设置不同的时间点。将六孔板在培养箱中孵育过夜，使细胞贴壁。次日早晨观察细胞，确认其融合度达到50%。吸去孔中的完全培养基，每孔加入2毫升预热的不含FBS的DMEM-谷氨酰胺培养基。将细胞继续培养24小时。为使用羟基脲阻断细胞周期，吸去孔中的培养基，并更换为新鲜配制的含4 µM羟基脲的完全培养基。将细胞在含有羟基脲的培养基中孵育24小时。在解除羟基脲介导的细胞周期阻滞前，检查细胞以确认其处于阻滞状态。移除含有羟基脲的培养基，用预热的1× PBS洗涤细胞孔两次。第二次洗涤去除 PBS 后，每孔加入 2 毫升完全培养基。将培养板置于培养箱中，直至收集样品。两种同步化方案的样品均以相同方式收集，用于 FACS 分析和 RNA 提取。进行FACS分析时，每孔加入两毫升预热的1×PBS洗涤一次，随后加入0.3毫升预热的胰蛋白酶-EDTA溶液以消化细胞。孵育五分钟之后，加入一毫升完全培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。将每个样本收集至独立的15毫升离心管中。在室温下以300 × g离心细胞5分钟。弃去上清液，用1× PBS洗涤并再次离心。移除PBS，保留细胞沉淀。为了固定细胞，将每个细胞沉淀用1毫升预冷的70%乙醇轻轻涡旋重悬。在进行碘化丙啶染色和流式细胞术分析前，将细胞置于冰上约15分钟。进行RNA提取时，移除培养基，并用2毫升预热的1× PBS冲洗每孔。将培养板转移至生物安全柜中，每孔加入1毫升适当的RNA提取试剂。用移液器反复吹打以裂解细胞，随后将每孔的细胞裂解液转移至1.5毫升微量离心管中。室温孵育5分钟。从冷冻柜中取出含有RNA分离试剂的微量离心管样本，在化学安全柜内于室温下解冻。向每个样本中加入400 µL氯仿，剧烈振荡（不使用涡旋振荡器）直至充分混匀。将样本在室温下孵育5分钟。将离心管在台式微量离心机中离心15分钟。将每个样品的水相转移至新的1.5 mL微量离心管中。向水相中缓慢逐滴加入等体积的100%乙醇，同时混合。不要离心。将每个样品最多700微升（包括可能形成的任何沉淀物）转移至商品化RNA小量提取试剂盒提供的2毫升收集管中的离心柱内，并盖上盖子。离心15秒。弃去流穿液。若每份样品起始体积超过 700 微升，请将剩余样品转移至离心柱中，再次离心。按照制造商说明书洗涤 RNA 后，通过移液将 30 至 40 微升无核酸酶水加入离心柱中洗脱每份样品，并在室温下离心一分钟。通过吸光度测量确定样品的RNA浓度和纯度。将RNA样品于-80摄氏度保存，直至用于基因表达分析。胸苷-诺考达唑（Thymidine-Nocodazole）处理方案可使U2OS细胞停滞在M期入口，并提供一个细胞群体，该群体在流式细胞术分析中显示可同步通过G1期进入S期。采用羟基脲方案处理可使细胞停滞在G1/S期边界。释放后，细胞同步进入S期和G2期。胸腺嘧啶-诺考达唑方案最适合分析在G1期表达达到高峰的基因的mRNA表达谱。如E2F1表达所示。相比之下，羟基脲法更适用于分析在S期或G2期优先表达的基因，如E2F7表达所示。细胞周期通常受到抗肿瘤药物的干扰，图中显示在经羟基脲同步化的细胞中，丝裂霉素C诱导了永久性的G2期阻滞。细胞同步化有助于区分那些对肿瘤抑制剂有响应的基因与那些仅受该抑制剂引起的细胞周期扰动影响的基因。例如，丝裂霉素C处理后E2F1 mRNA水平的下降，很可能是药物对细胞周期动态产生的间接效应；相比之下，丝裂霉素C处理后p21-Cip1 mRNA表达的峰值则是由该药物触发的转录程序直接导致的结果。通过此方法，可进行全基因组范围的转录组学以及蛋白质组学分析，以揭示影响特定细胞周期时相的全局性基因表达变化。无论是在第二种条件下，还是在抗肿瘤治疗过程中。观看本视频后，您应能够充分理解在同步化细胞培养中进行基因表达分析所需的操作步骤。请注意，使用碘化丙啶或RNA提取试剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取适当防护措施，例如佩戴手套并在生物安全柜中操作化学品。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过两个互补细胞同步方案研究细胞周期调控的基因表达

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。...

哺乳动物细胞周期位置分析

通过联合使用BrdU对核酸进行代谢标记以及碘化丙啶对总基因组DNA染色，可实现对细胞周期各阶段进展及动力学的细微变化进行追踪。该方法无需对增殖细胞进行化学同步化处理，从而避免了非特异性DNA损伤的引入，进而防止对细胞周期进程造成影响。...

利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

细菌细胞的同步化对于细菌细胞周期与发育研究至关重要。Caulobacter crescentus...

Caulobacter crescentus 的同步化以研究细菌细胞周期

本方案描述了利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入来追踪在特定时间点处于S期的细胞的时序动态。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。...

利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。...

结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

本方案描述了一种非侵入性方法，可高效地鉴定处于S期的细胞，用于后续显微镜研究，例如通过激光微辐照检测DNA修复蛋白的招募情况。...

利用激光显微照射研究S期DNA的招募过程

分析同步时间序列实验的一个挑战在于，不同实验在同步恢复时长和细胞周期周期上往往存在差异。因此，来自不同实验的测量数据无法进行整体分析或直接比较。本文中，我们描述了一种用于对齐实验的方法，以实现特定相位的比较。...

利用细胞周期同步性丧失特征模型对同步化时间序列数据进行对齐以实现跨实验比较

以下实验方案介绍了通过细胞周期同步化后进行RPA2免疫荧光染色，以检测细胞周期G1期中单链DNA焦点的方法。...

可视化细胞周期G1期中的单链DNA焦点

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

在此，我们描述了用于并行监测人胰岛细胞和原代肌管细胞昼夜节律性生物发光及分泌活性的实验设置。为此，我们采用慢病毒载体递送荧光素酶核心钟基因报告系统，随后 体外...

平行测量人原代细胞培养物中的昼夜节律钟基因表达与激素分泌

学习两种互补细胞同步方案，利用U2OS细胞精确分析细胞周期特异性基因表达模式，揭示癌症相关转录事件及化疗对基因表达的影响机制。

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

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