Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Synthese von auf Monozyten abzielenden amphiphilen Peptidmizellen für die Atherosklerose-Bildgebung. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im kardiovaskulären Bereich zur diagnostischen Bildgebung von atherosklerotischen Plaques zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Einbau von amphiphilen Peptidmizellen mit MCP-1 eine größere Targeting-Spezifität und Differenzierung zwischen atherosklerotischen Läsionen im Früh- und Spätstadium ermöglicht.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Plaque in verschiedenen Stadien der Atherosklerose, da Patienten mit rupturanfälligen Plaques im Spätstadium eine höhere Anzahl von Monozyten enthalten. Obwohl diese Methode Aufschluss über Atherosklerose geben kann, kann sie auch auf andere Krankheiten wie Krebs angewendet werden. Jonathan Wang, ein Doktorand aus unserem Labor, wird das Verfahren mit mir demonstrieren.

Beginnen Sie mit dem Abwiegen von 0,25 Millimol fmach-L-Lysin-bach-wong-Harz in einem Reaktionsgefäß. Füllen Sie das Gefäß in einen chemischen Abzug und spülen Sie die Gefäßseiten mit fünf Millilitern Dimethylforamid aus. Laden Sie das Reaktionsgefäß und die vorverpackten Aminosäurefläschchen vom C-zu-N-Terminus auf einen automatisierten Tisch-Peptidsynthesizer, einschließlich eines leeren Fläschchens am Ende für das abschließende Entschützungssetp.

Nach der Synthese werden die Peptide und das Harz aus dem Reaktionsgefäß in ein Szintillationsfläschchen mit zwei bis drei Millilitern Methanol überführt, bis das gesamte Harz übertragen wurde. Wenn das Harz auf den Boden des Fläschchens gesunken ist, entfernen Sie das Supernan und lassen Sie das Harz an der Luft trocknen, gefolgt von einer Vakuumtrocknung für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur. Wenn das Fläschchen vollständig getrocknet ist, befestigen Sie die untere Hälfte eines Synthesegefäßes mit einer Klemme auf einem Armschüttler und geben Sie zwei Milliliter Spaltlösung in das Szintillationsfläschchen.

Übertragen Sie das gesamte Volumen des Peptidharzes in das Synthesegefäß und waschen Sie die Seiten des Gefäßes mit drei Millitern frischer Spaltlösung. Schütteln Sie dann das Gefäß mit Deckel vier Stunden lang mit 300 Schwingungen pro Minute. Am Ende der Schüttelinkubation wird die gespaltene Peptidlösung in ein ausgewogen gewogenes konisches 50-Milliliter-Röhrchen abgelassen und das Synthesegefäß mehrmals mit der restlichen Spaltlösung gespült.

Verdampfen Sie die gespaltene Peptidlösung mit Stickstoff, bis weniger als vier Milliliter Lösung im Zentrifugenröhrchen verbleiben, und fügen Sie der gespaltenen Peptidlösung 36 Milliliter eiskalten Ether hinzu. Wirbeln Sie die resultierende Lösung ein. Wenn die Suspension vollständig weiß oder gelb wird, pelletieren Sie die Peptide durch Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Peptid in 40 Millilitern eiskaltem Äther und Wirbel und beschallen Sie das Peptid erneut. Nach einer zweiten Zentrifugation und dem Dekantieren des Überstands wird das rohe Peptid-Amphiphil-Pellet mit Stickstoffgasspülung getrocknet. Wenn der Äther sichtbar verdampft ist, geben Sie 20 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in das Röhrchen, wirbeln Sie das Röhrchen und beschallen Sie es, bis das Peptid vollständig in Lösung aufgelöst ist.

Frieren Sie die Lösung ein und lassen Sie sie trocknen. Wiegen Sie dann das Röhrchen erneut und lösen Sie das Rohpeptid in fünf Milligramm pro Milliliter Wasser auf. Injizieren Sie anschließend das gesamte Volumen des rohen MCP-1-Peptids in ein Hochleistungs-Flüssigchromographie- oder HPLC-Instrument.

Analysieren Sie jede Fraktion mit Hilfe der matrixgestützten Laserdesorptionsionisations-Massenspektroskopie auf die erwartete Produktmassenladung bei 2.890. Kombinieren Sie dann die Produktfraktionen. Blasen Sie das Acetonitril ab und frieren Sie die gereinigten Peptide ein und lifelisieren Sie sie, bis sie trocken sind.

Um die MCP-1-Peptidamphiphile oder PAs herzustellen, lösen Sie zunächst das lifelisierte Peptid in 15 Milligramm pro Milliliter Wasser auf und kombinieren Sie die Peptidlösung mit 15 Milligramm pro Milliliter DSPE PEG 2000 Millimidlösung. Fügen Sie tropfenweise ein Mol Natriumhydroxid hinzu, bis der pH-Wert der Lösung sieben beträgt. Dann wird der Stickstoff fünf Minuten lang gespült, gefolgt von einem Rühren über Nacht.

Am nächsten Morgen frieren Sie die Lösung ein und leben sie. Wenn das Rohprodukt trocken ist, lösen Sie den Feststoff in fünf Milligramm pro Milliliter Wasser auf und reinigen Sie das Peptid durch HPLC, wie gerade gezeigt. Um die PA-Membranen zusammenzusetzen, lösen Sie 1,75 Milligramm der MCP-1 PA in drei Millilitern Methanol in einem Ein-Dram-Fläschchen und beschallen Sie, bis das MCP-1 PA vollständig aufgelöst ist.

Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff, während Sie das Fläschchen in kreisenden Bewegungen bewegen und das restliche Methanol von den Seiten des Fläschchens abspülen, bis sich am Boden ein gleichmäßiger Film bildet. Trocknen Sie die Folie über Nacht. Am nächsten Morgen hydratisieren Sie den Film mit drei Millilitern Wasser, um eine 100 Mikromolare MCP-1 PAM-Lösung herzustellen, und wirbeln und beschallen Sie die Lösung vorsichtig, bis sie klar ist.

Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius und kühlen Sie dann die resultierende Dispersion ab. Im folgenden repräsentativen Experiment wurden MCP-1 und das Rührpeptid durch Umkehrphasen-HPLC auf einer CA-Säule bei 50 Grad Celsius unter Verwendung von 0,1%Trifluoressigsäure in Acetonitril-Wassergemischen aufgereinigt. Und charakterisiert durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometrie, wie gerade gezeigt.

Die verzichtenden Peptide wurden auf DSPE PEG 2000 Milliamid konjugiert, um DSPE PEG 2000 Peptidkonjugate über eine Thioetherbindung zu erhalten, und durch HPLC unter Verwendung einer C4-Säule aufgereinigt. Die dynamische Lichtstreuungsanalyse und die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung der Monozyten-Targeting-PAMs zeigten gut dispergierte sphärische Nanopartikel mit leicht positiven Zetapotentialen. Die spektroskopieische Analyse der Zirkulardikroismen bestätigte, dass der Einbau des MCP-1-Peptids in die Mizelle die Sekundärstruktur verbesserte.

Die Inkubations-Amalse-Monozyten mit bis zu 100 mikromolaren Konzentrationen von MCP-1-Peptid, MCP-1-PAM, Scramble-Peptid und Scramble-PAM für 72 Stunden zeigten die Lebensfähigkeit und Biokompatibilität der Peptide. Die spezifische Bindung der Monozyten an MCP-1 PAMs im Vergleich zu Crambled PAMs wird dann durch konfokale Mikroskopie festgestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man durch die Synthese und Reinigung des MCP-1-Peptids und die Herstellung der MCP-1-Peptid-Amphiphil- und Mizellenassemblierung Monozyten-Targeting-Peptid-Amphiphil-Mizellen vorbereitet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chemischen Reagenzien extrem gefährlich sein kann und dass bei der Arbeit mit diesen Materialien immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Lesen des Sicherheitsdatenblatts und das Arbeiten in einem chemischen Abzug.