Erstbewertung der Antikörper-Konjugate mit Viral-abgeleitete Peptide zur Erhöhung der zellulären Akkumulation und Verbesserung der Tumor gezielt modifiziert

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, die Spezifität und Wirksamkeit von Antikörperkonjugaten für die Akkumulation in Zielzellen und Tumoren während der ersten Entwicklungsphasen zu bewerten, damit sie schließlich in der Klinik eingesetzt werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zur Antwort auf die konjugierten Felder zu beantworten, wie z.B. die Effizienz der Kernlokalisation und die gesamte interzelluläre Akkumulation. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass Forscher mithilfe der PET-Bildgebung die Wirksamkeit und Selektivität von Antikörperkonjugaten beurteilen können.

Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose von Krebs, da die ineffektive Akkumulation von Tumorzellen eine große Einschränkung bei diesen Anwendungen für Antikörperkonjugate darstellt. Nach der Synthese eines Antikörperkonjugats mit Koliksäure-Kernlokalisationssequenz gemäß dem Textprotokoll werden die Ziel-TF1A-Zellen mit 200 nanomolaren 7G3-Koliksäure-MLS-Antikörperkonjugaten behandelt. Zellen, die mit modifizierten monoklonalen Kontrollantikörpern behandelt wurden, sind einzuschließen.

Inkubieren Sie fünfmal 10 bis sechste antigenpositive Zellen mit den Konjugaten bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Entfernen Sie dann den Überstand und verwenden Sie einen Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen dreimal zu waschen. Fügen Sie frisches Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen eine weitere Stunde lang bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter PBS hinzu, das 0,25 % Trypsin und EDTA enthält, und inkubieren Sie die Zellen bis zu 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann 1,5 Milliliter RPMI1640 Medium mit 10% FBS, um das Trypsin zu neutralisieren. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal G, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 0,5 Millilitern eiskaltem PBS erneut dreimal.

Geben Sie 0,5 Milliliter 1%PFA und 1%Saccharose und PBS zu den Zellen und legen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, um sie zu fixieren. Waschen Sie die Zellen dann mit 0,5 Millilitern eiskaltem PBS dreimal und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 250-fachem G. Geben Sie dann 0,15 % Triton X-100 und PBS zu den Zellen und permeablizieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis.

Waschen Sie dann die Zellen mit eiskaltem PBS und wiederholen Sie die Zentrifugation. Suspendieren Sie die Zellen in 0,1 Millilitern PBS, die zwei Mikrogramm pro Milliliter eines antispiegelnden sekundären polyklonalen Antikörpers FC enthalten, der an Alexa Fluor 647 konjugiert ist, und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 250-fachem G und verwenden Sie 0,5 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen dreimal zu waschen.

Suspendieren Sie dann die Zellen in 0,5 Millilitern PBS. Geben Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid in die Zellen. Montieren Sie dann mit einem Eindeckmedium eine mal 10 bis fünfte Zellen auf Objektträger, bevor Sie die Probe mit einem Glasdeckglas abdecken.

Untersuchen Sie die Zellen mit einem Plan APO 60X Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur 1,42 an einem konfokalen inversen Laser-Scanning-Mikroskop. Detektieren Sie PI-Fluoreszenz mit dem 488-Nanometer-Argonlaser und dem spektralen Scanning-Prisma, das auf 600 bis 650 Nanometer eingestellt ist. Für die Fluoreszenz von AF 647 verwenden Sie den 633-Nanometer-Helium-Neon-Laser und das spektrale Scanning-Prisma-Set für 650 bis 700 Nanometer.

Erfassen Sie Bilder von PI und AF 647 nacheinander mit 1024 x 1024 Pixeln mit 2-facher Mittelwertbildung, die in Abständen von 0,5 Mikrometern über die gesamte Zelldicke aufgenommen wurde. Präsentieren Sie Bilder als Z-Projektionen. Um die Zellen zu analysieren, bewerten und aufzeichnen, ob die intrazelluläre Fluoreszenz im Zytoplasma gruppiert und nahe der Zelloberfläche oder diffus und homogen ist.

Bewerten Sie auch die relative Fluoreszenzintensität pro Zelle. Nach der Herstellung und Konzentration des radioaktiv markierten Koliksäure-NLS-Antikörperkonjugats gemäß dem Textprotokoll bestimmen Sie die Radiomarkierungseffizienz, indem Sie 0,5 Mikroliter 0,1-molares PH5,5-Natriumcitrat oder ITLC-Eluent auf einen ITLC-Streifen aufbringen. Erstellen Sie ein Autoradiogramm des Streifens und erhalten Sie ein digitales Bild.

Führen Sie eine Densitometrie durch, um das Verhältnis von gebundenem und freiem Kupfer-64 zu ermitteln. Wenn der Gehalt an freiem Kupfer-64 mehr als 5 % beträgt, konzentrieren Sie die Probe weiter. Für Studien zur zellulären Akkumulation von Kupfer-64 behandeln Sie Zellen mit 100 Nanomolaren von Kupfer-64-markierten A14-Konjugaten bei 37 Grad Celsius für ein, sechs und 24 Stunden, wie zuvor beschrieben.

Behandeln Sie die Zellen mit unmodifiziertem A14, um IL5R-Alphazyten zu blockieren, und bei vier Grad Celsius, um die Rezeptor-vermittelte Internalisierung zu blockieren. Nach dem Waschen der Zellen und der Inkubation mit frischem Medium, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, fügen Sie 0,5 Milliliter PBS mit 0,25 % Trypsin und EDTA hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor neutralisiert und gewaschen haben, fügen Sie den Zellen Plasmamembran-Lysepuffer hinzu und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.

Die plasmamembranlysierten Zellen werden fünf Minuten lang bei 90-fachem G zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein frisches Röhrchen. Dies stellt die zytoplasmatische Fraktion dar.

Waschen Sie dann die Zellkerne mit eiskaltem PBS dreimal und geben Sie die Waschungen zur zytoplasmatischen Fraktion. Stellen Sie sicher, dass die Fläschchen mit den nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen versiegelt sind, und legen Sie sie dann in einen für Kupfer-64 kalibrierten Gammazähler, um die Rohzahlen in Megabecaril umzuwandeln. Bestimmung der Qualität der Zellkernisolierung durch Durchführung einer Western-Blot-Analyse auf Lamin AC, ein eingeschränktes Kernprotein; und Rab-7, ein reichlich vorhandenes zytoplasmatisches Protein, auf Großhandelslysat-, Kern- und zytoplasmatischen Fraktionen.

Behandeln Sie die sechs Zellen fünfmal 10 mit 500 Mikrolitern Radio-Amino-Fällungs-Assay oder RIPA-Puffer und Plasma-Membran-Lysepuffer mit 1 %2 % und 4 % NP-40. Darüber hinaus werden die isolierten Zellkerne mit 500 Mikrolitern RIPA-Puffer behandelt, um isolierte Kernproteine zu erhalten. Geben Sie das vierfache Probenvolumen an kaltem Aceton zu den isolierten nuklearen, zytoplasmatischen und Großhandelsproteinen und inkubieren Sie 60 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius.

Die Proben werden 10 Minuten lang bei 13.000 mal G zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass sich das Proteinpellet nicht löst. Fügen Sie dann 100 Mikroliter PBS hinzu, um die Proteine aufzulösen.

Western Blotting wie zuvor beschrieben durchgeführt haben, schneiden Sie die Membran am 40-Kilodalton-Molekulargewichtsmarker in zwei Hälften. Verwenden Sie Lamin-AC-spezifische Antikörper, um den Blot mit den Proteinen mit höhermolekularem Gewicht zu untersuchen, und verwenden Sie Rab-7-spezifische Antikörper, um die untere Hälfte der Membran zu untersuchen. In Gruppen mit vier Nodskit-Mäusen werden 20 bis 30 Mikrogramm radioaktiv markiertes A14-Koliksäure-NLS-Antikörperkonjugat, radioaktiv markiertes A14 NLS und radioaktiv markiertes A14 in die Schwanzvene injiziert

Am selben Tag wird ein zylindrisches Phantom mit fünf Megabecaril Kupfer-64 in den PET-Scanner eingesetzt, um die radioaktive Zahl pro Sekunde in die injizierte Dosis pro Gramm Gewebe umzuwandeln. 48 Stunden später, nachdem die Mäuse gemäß dem Textprotokoll betäubt wurden, wird eine Maus schnell auf einen PET-Scannertisch in Bauchlage mit einem Nasenkonus für Isofluran übertragen. Starten Sie die PET-Datenerfassung mit einer regulären Abtastmodus-Einstellung und einem Energiefenster von 250 bis 650 Kiloelektronenvolt.

Entfernen Sie nach dem Scan die Maus aus dem Scanner und setzen Sie sie wieder in den Käfig ein. Wie in dieser Abbildung gezeigt, zeigen die Pfeile den Unterschied bei der Bewertung der Antikörperkonjugatakkumulation mit und ohne Trypsinisierung. In Zellen, die nicht trypsinisiert sind, ist die intrazelluläre Akkumulation und Verteilung aufgrund der Überexpression der Oberflächenrezeptoren der Zielzelle schwer zu bewerten.

Die Pfeile zeigen den Unterschied in der intrazellulären Akkumulation und Verteilung von zwei Antikörperkonjugatkandidaten, wenn die Zellen richtig trypsinisiert sind. Radioaktiv markiertes A14-Koliksäure-NLS-Antikörperkonjugat zeigt eine nanomolare Affinität zu IL5R alpha. Mit zunehmender Konzentration von radioaktiv markiertem A14-Koliksäure-NLS-Antikörperkonjugat näherte sich die spezifische Bindung des A14-Koliksäure-NLS-Antikörperkonjugats sowohl in HT-1376- als auch in HT-B9-Zellen der Sättigung bei Konzentrationen von 3,5 Nanomolaren.

Die Gamma-Zählung zeigt, dass die Zunahme der Radioaktivität im Zellkern und im Zytoplasma durch radioaktiv markiertes A14-Koliksäure-NLS-Antikörperkonjugat spezifisch ist und mit der Zeit zunimmt. HT-1376- und HT-B9-Zellen wurden mit einem Plasmamembran-Lysepuffer inkubiert, der 1%2%oder 4%NP-40 enthielt. Bei HT-1376- und HT-B9-Zellen wurde der Lysepuffer, der ein oder 2%NP-40 Rap-7 enthielt, in der Kernfraktion nicht nachgewiesen, und Lamin AC wurde in der zytoplasmatischen Fraktion nicht nachgewiesen.

Die PET-Bildgebung ermöglicht die Bewertung von Antikörperkonjugatkandidaten auf ihre Fähigkeit, auf antigenpositive Tumoren, rote und blaue Pfeile, abzuzielen, und ihre damit verbundenen Bioverteilungseigenschaften im Vergleich zum elterlichen nicht-peptidmodifizierten Antikörper. Man kann die Signalakkumulation im Tumor sehen, um das Potenzial für ein entwickeltes Antikörperkonjugat auszuwählen. Die PET-Bildgebung ermöglicht auch die Bewertung der Aufnahme von Antikörperkonjugatkandidaten in gesundes Gewebe wie die Leber.

Nach der Beherrschung dieser Techniken werden Forscher auf dem Gebiet der gezielten Tumorverabreichung von molekularen Nutzlasten in der Lage sein, zusätzliche Wirkstoffe zu erforschen, bei denen die Tumorzellakkumulation durch Endosomeneinschluss behindert wird.