Name: Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung der Monozyten-Transmigration und Schaumbildung in der kardiovaskulären Forschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse klinischer Proben aus frischem Blut oder gespeicherten Kohorten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren erkennen dankbar die Arbeit von Prof. William Müller und Dr. Clare Westhorpe für ihre Schlüsselrolle bei der Entwicklung der früheren Iterationen dieses Modells. Die Autoren auch möchte die AMREP Flow Cytometry Kern für die Sortierung der Monocyte Teilmengen und Alfred Hospital ansteckende Krankheit Referat klinische Forschung Krankenschwestern für die Rekrutierung von HIV + Einzelpersonen für einige Studien. Die Autoren erkennen dankbar den Beitrag zu dieser Arbeit des Victoria betriebliche Infrastruktur Support-Programms erhalten vom Burnet Institut. TAA ist durch eine RMIT University Vice-Chancellor Postdoctoral Fellowship unterstützt. Diese Arbeit wurde durch NHMRC Projekt Grant 1108792, AJ und AH ausgezeichnet unterstützt. TK stützt sich auf NIH gewährt NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # UL1TR000124.

Hinweis: alle Experimente mit menschlichen biologischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethik von Alfred Hospital Komitee der menschlichen Ethik, Melbourne durchgeführt. Alle Versuche wurden in Klasse II Biosicherheit Schränken durchgeführt, sofern nicht angegeben. " Prewarmed " bezieht sich auf Reagenzien auf 37 ° C in einem Wasserbad erwärmt.
 1. Vorbereitung der Typ I faserigem Kollagen Gele: Tag1 <ol><li>Prepare polymerisiert Kollagen Gele nacheinander hinzufügen und Mischen von 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, 4,58 mM Essigsäure und 1,71 mg/mL Typ I Kollagen faserige in 5 mL Polystyrol Rohr gemäß Tabelle 1. 
	Hinweis: Sicherstellen, dass das Kollagen gut durchmischten indem sanft nach oben und unten 5 Mal um die Bildung von Kollagen stoppen Pipettieren ' Taschen ' in der Gel-Mischung. Bereiten Sie 4-6 Gele pro Testbedingung für die Mikroskopie oder 15 Gele pro Testbedingung für Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Nun einmal gemischt, aliquoten 50 µL Kollagen Gel Mischung in jede Vertiefung einer sterilen Plattboden 96-Well-Zellkultur-Platte. Verwenden Sie nicht die äußeren Zeilen und Spalten, sondern füllen Sie diese mit 200 µL 1 X Dubecco ' s Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die Gele vor Austrocknung zu schützen. Inkubieren Platten bei 37 °C/5% CO 2 für 2 h, um das Kollagen zu polymerisieren lassen. 
	Hinweis: Legen Sie die Platten direkt auf saubere Metall Regale in den Inkubator, gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach Inkubation, überlagern die Gele mit 150 µL 1 x ergänzt M199 (siehe Tabelle der Materialien) und inkubieren Sie für 5 Tage bis zum ersten Gebrauch.</li>
</ol> 2. Erweiterung des gespeicherten HUVECS: Tag1 <ol><li>Label und Mantel einem Durchmesser von 10 cm Petrischale mit 1 mL von 50 µg/mL Fibronektin in 1 X PBS verdünnt und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Tauwetter Aliquote von kryokonservierten primären menschlichen Nabelschnur Vene Endothelzellen (HUVECS, 1.0 x 10 6-Zellen) in 10 mL M20. 
	Hinweis: HUVECS sollten bereit sein, wie zuvor 21 beschrieben und bei einem niedrigen Passagenanzahl verwendet (&lt; Abschnitt 4). HUVECS mit menschlichen koronaren Endothelzellen hier ersetzt werden kann.</li>
	<li>HUVECS in 10 mL M20 Aufschwemmen und Fibronektin beschichtete Teller, Absaugen von überschüssigem Fibronektin vor der Zugabe von Zellen und Kultur zum Zusammenfluss (ca. 5 Tage), Austauschen der Medien am 3. Tag hinzu.</li>
</ol> 3. Kultivierung von HUVECS Monolayer auf Kollagen Gele: Tag 5 <ol><li>am 5. Tag, HUVECS lösen, indem Kultur aus der Petrischale überstand Absaugen und Waschen entfernt Serum-haltigen Medien mit 10 mL serumfreien M199.</li>
	<li>HUVECS 5 mL 0,05 % Trypsin/0,53 EDTA in M199 hinzu und inkubieren Sie für 1-2 min bei Raumtemperatur, sanft schütteln, bis die Zellen trennen.</li>
	<li>Einmal gelöst, schnell spülen Petrischale mit 5 mL M20 und übertragen das Medium mit Zellen, die eine 10 mL-Tube.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur, Aspirieren überstand, Aufschwemmen Zellen in 200 µL der M20 und zählen von Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen bis 2.0 x 10 5 Zellen/mL in M20, Aspirieren M199 auf die Gele aus der 96-Well-Platte (Schritt 1.3) und jedes Kollagen Gel oben (Schritt 1.2) vorbereitet 100 µL resuspendierte HUVECS (2.0 x 10 4 Zellen) hinzuzufügen. Kultur von Platten für weitere 3 Tage bei 37 °C/5% CO 2. 
	Hinweis: Die Integrität des HUVECS Monolage kann nach 3 Tagen durch Silbernitrat Färbung 22 oder Immunohistochemistry für enge Kreuzung Proteine 23 zu diesem Zeitpunkt bestätigt werden. Weitere Gele müssen dazu bereit sein.</li>
</ol> 4. Aktivierung des HUVECS Monolage und Isolation/Aktivierung von Monozyten für Seelenwanderung: Tag 8 <ol><li>am 8. Tag, jeder HUVECS monomolekularen Film vor der Zugabe von Monozyten durch Absaugen der M20 aktivieren Medien überlagern die Gele und das Hinzufügen von 100 µL 10 ng/mL menschlichen TNF in M20 pro Gel. Inkubation bei 37 °C/5% CO 2 für 4 Std. 
	Hinweis: Nicht aktivierte HUVECS Bedingungen auch möglicherweise enthalten ggf. als Steuerelemente.</li>
	<li>Während die 4 h HUVECS Aktivierungsschritt, isolieren Monozyten von PBMCs mit magnetischer Wulst Techniken negativ für Zellen des Herstellers wählen ' Anweisungen. Mindestens 6,5 x 10 6 PBMCs sollte bei diesem Schritt genutzt werden, um zuverlässig wiederherstellen 3.0 x 10 5 Monozyten erforderlich für eine Bedingung, da in der Regel ca. 10-15 % der PBMCs Monozyten ausmachen. 
	Hinweis: Um die Wirkung der Monocyte Aktivierung vor Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewerten, können Monozyten in dieser Phase aktiviert werden. Monozyten können von aufgetauten PBMCs bei Bedarf (d.h. gespeicherte Patientenproben) isoliert werden. Monocyte Teilmengen durch FACS Sortierung isoliert zubereitet werden, für die Addition, Gele (Abbildung 1).</li>
</ol> 5. Transmigration von primären menschlichen Monozyten: Tag 8 <ol><li>zur Messung Monocyte Seelenwanderung, TNF-haltigen Medien zu entfernen und waschen Gele zweimal mit 100 µL M199 durch hinzufügen und Entfernen von Medien. Nach waschen, hinzufügen 2.0 x 10 5 frisch isoliert oder aufgetaut und gewaschen kryokonserviert PBMCs oder 5,0 x 10 4 frisch isolierte Monozyten oder gereinigt Monocyte Teilmengen zu HUVECS Monolagen in 100 µL M20. Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 vorwärts Transmigration von Monozyten in das Gel zu ermöglichen. Es empfiehlt sich, 6 Brunnen für jeden Versuchsbedingung untersucht lassen. 
	Hinweis: Um die Wirkung von autologem Serum auf Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewerten, inkubieren Sie Zellen mit M20, enthalten die gewünschte Konzentration von Hitze-inaktivierten Spender Serum und vergleichen mit Bedingungen mit einer gepoolten Humanserum-Kontrolle. Leukozyten als Monozyten können in diesem Stadium hinzugefügt werden. Wenn bestimmte Lipide/Lipid-Arten (z.B., HDL, OxHDL) zu untersuchen, führen Sie alle folgenden Schritte mit serumfreien Medium mit 20-50 µg/mL Lipide.</li>
	<li>Nach 1 h nach vorne Seelenwanderung, sammeln die nicht transmigrated Zellen durch Waschen Gele zweimal mit 100 µL vorgewärmte 1 mM EGTA mit 1 X PBS-Puffer, und einmal mit 100 µL M199 (gleiche Zentrifugieren Bedingungen), Bündelung der Überstände aus jedem Brunnen desselben Versuchsbedingung (in der Regel 6 Brunnen) zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis. Die nicht transmigrated Zellen bei 4 ° C, 300 X g für 5 min Zentrifugieren und in 30 µL 1 X PBS Aufschwemmen.</li>
	<li>Zählen der Zellen in der Überstand zu bestimmen, die Anzahl der nach vorne transmigrated Zellen gesammelt.</li>
	<li>Der Anteil der vorderen transmigrated Zellen wird wie folgt ermittelt: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg"></li> <li>decken die gewaschenen Gele mit transmigrated Zellen mit 100 µL M20 und inkubieren Sie für eine weitere 48 h</li>
	<li>Nach 48 h, sammeln des Überstands und waschen nicht transmigrated Zellen zweimal mit 100 µL 1 mM EGTA/PBS, Sammlung und Bündelung des Überstands von jedem Zustand wie im Schritt 5.2 vorgewärmt. 
	Hinweis: Der Phänotyp der umgekehrte transmigrated Zellen kann auf diese Zellen f getestet werdenAch standard Durchflusszytometrie Fleckenbildung Protokolle.</li>
	<li>Zellen bei 4 ° C, 300 X g für 5 min Zentrifugieren und Aufschwemmen Zellen mit 30 µL 1 X PBS-Puffer. Zählen Sie Zellen und bestimmen die Lebensfähigkeit über Trypan blau Färbung.</li>
	<li>Den Anteil der umgekehrte transmigrated Zellen mithilfe von der folgenden Gleichung ermitteln: 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg"> Hinweis: Rechnungswesen für die Gesamtzahl der vorderen transmigrated Zellen eine genauere Angabe der umgekehrte Seelenwanderung gibt, wie es ist unwahrscheinlich, dass vorwärts Seelenwanderung werden 100 %.</li>
	<li>Für die Analyse von Mikroskopie, beheben die Gele durch Zugabe von 100 µL 2 % Formaldehyd (Endkonzentration) in jede Vertiefung decken die Platten in Aluminium Folie und bis zur Analyse bei 4 ° C lagern. Beheben Sie für Durchflusszytometrie die Zellen nicht in diesem Stadium. Die Protokolle unter für die Mikroskopie (siehe Abschnitt 6) oder Flow-Zytometrie (Abschnitt 7)-Analyse zu sehen. 
	Achtung: Formaldehyd ist giftig und ätzend; persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu verwenden. Vorsicht beim Hinzufügen von Formaldehyd, aber dieser Schritt muss nicht durchgeführt werden, unter einem Abzug aufgrund der geringen Konzentration verwendet.</li>
</ol> 6. Quantifizierung des Schaum-Zellen und Makrophagen durch Mikroskopie (Öl-rot färben O) <ol><li>das Formaldehyd zu entfernen und waschen Sie die Gele mit 100 µL von 50 % (V/V) Methanol für 5 min und dann 100 µL 78 % (V/V) Methanol für 15 min. 
	Hinweis: Die Färbung Schritte können durchgeführt werden, auf dem Labortisch und nicht in einem Klasse-II-Biohazard-Schrank.</li>
	<li>Fleck für Lipid Tröpfchen durch Hinzufügen von 100 µL der frisch zubereiteten 0,2 % (w/V) Öl-rot O (siehe Tabelle der Materialien für Details) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flecken durch Waschen die Gele 4 Mal mit 100 µL 78 % (V/V) Methanol, Absaugen und Abwerfen des Überstands nach jeder Wash.</li>
	<li>Für 15 min bei Raumtemperatur mit 100 µL Giemsa, 01:10 in destilliertem Wasser verdünnt Gegenfärbung.</li>
	<li>Aspirieren Giemsa Fleck und Gele einmal mit Wasser zu waschen.</li>
	<li>Um die Gele aus der Platte zu entfernen, die Brunnen mit einer Nadel 21 G mit der Schräge nach außen, um den Rand des Gels Felge.</li>
	<li>, Die Gele auf einen Objektträger zu montieren Schlag zwei Löcher (Durchmesser von 6,35 mm) in einem 2,54 cm x 1,5 cm Streifen doppelseitiges Klebeband. Das Band zu einem standard Mikroskop-Seite befestigen und Entfernen der Schutzschicht von oben.
	<ol><li>Add einen Tropfen Wasser auf die Löcher in das Band mit einer Transferpipette. Übertragen Sie Gele mit einer Pinzette, sanft auf die Löcher in der Band und mit einem Deckgläschen Größe 1,5 Glas werden. Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas auf dem Band einzuhalten.</li>
	</ol></li> <li>Untersuchen mit differential Interferenz Kontrast Hellfeld Mikroskopie mit 40 X Objektiv auf einem inversen Mikroskop.
	<ol><li>Bringen die HUVECS Monolayer in den Fokus bei 40 X Vergrößerung und scrollen Sie nach ' in ' Gel, Makrophagen/Schaumzellen in die gesamte Tiefe des Gels zu zählen. Wiederholen Sie für drei unterschiedliche Sichtfelder befindet sich in einer ähnlichen Entfernung vom Rand des Gels um mögliche Randeffekte zu minimieren. Dadurch wird sichergestellt, dass Gel Tiefe ist konsistent zwischen Regionen zählen. 
		Hinweis: Gäste Zellen in das Gel entweder als Schaumzellen (definiert als Zellen mit &gt; 1/3 von ihrem Zytoplasma als Öl-rot O gebeizt Lipid-Tropfen) oder Makrophagen innerhalb 2 h nach Montage auf Folien ( Abbildung 2). Zelle Schaumbildung wird ausgedrückt als Prozentsatz der Schaumzellen bezogen auf die Gesamtzahl der migrierten Zellen und wird ausgedrückt als die mediane Grafen in 3 Gesichtsfelder für 6 Gele pro Zustand, daher einen Median von 18 Messungen pro Zustand untersucht. Ein Beispiel für rohe Zellenzahlen von ein typisches Experiment ist in Tabelle 2 gezeigt. 
		Hinweis: Eine Zelle als ein Schaum Zelle Vs Makrophagen durch Mikroskopie zu klassifizieren ist subjektiv und kann folglich sein Ermittler-abhängige. In klinischen Studien, wo Experimente über einen längeren Zeitraum hinweg durchgeführt werden, ist es wichtig für alle zählen, geblendet durch eine einzelne Prüfer durchgeführt werden. Schaumzellen und Makrophagen in Gele sind Beispiele in Abbildung 2.</li>
	</ol></li></ol> 7. Analyse der Transmigrated Zellen durch Flow Cytometry <ol><li>phänotypisch Schaumzellen und Makrophagen, die nach der Transendothelial Migration zu charakterisieren, die Gele durch Zugabe von 100 µL 37 ° C vorgewärmt 1 mg/mL Kollagenase D verdünnt in M199 zu verdauen jedes gut und inkubieren Sie für 20 min bei 37 °C/5% CO 2. 
	Hinweis: Legen Sie die 96-Well-Platten direkt auf saubere Metall Regale in den Inkubator, gleichmäßige Wärmeverteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach Inkubation, die Gele mit einer Pipettenspitze 200 µL mazeriert und inkubieren Sie für weitere 20 min bei 37 °C/5% CO 2.</li>
	<li>Einmal vollständig verdaut, Filter und Pool die verdaute replizieren Gele durch 35 µm Nylon mesh angeschnittene Ärmel FACS-Röhren auf Eis gelegt und waschen mit FACS einmal waschen (siehe Tabelle der Materialien), bei 4 ° C, 300 X g. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL FACS Washington</li>
	<li>Die resultierenden Zellen mit spezifischen Fluorophor-konjugierten Antikörpern inkubieren CD45, einen lebenden/Toten Zelle Marker und Oberfläche/intrazellulären phänotypische oder funktionelle Marker mit standard Flow Cytometry Protokolle. 
	Hinweis: Bereiten Sie Kontrolle Rohre für Entschädigung unter Verwendung der entsprechenden Fluorophore und Ig Entschädigung Perlen. Entnommene Zellen können auch auf Glas-Objektträger für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Cytospinning gesammelt werden. Alternativ haben wir erfolgreich gesammelt Zellen unter Verwendung dieses Protokolls zur Beurteilung über bildgebende Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Zellen mit einem Durchflusszytometer zu erwerben, und führen Sie Entschädigung Bedarf. 
	Hinweis: Da Schaum Zellen/Makrophagen nicht einzelne Populationen mit Lichtstreuung Eigenschaften bilden und sehr unterschiedlich in Größe und Form können kann, setzen liberale forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Tore um alle migrierten Zellen zu erfassen, wie in gezeigt &lt; starke Klasse = "Xfig" &gt; Abbildung 3A.</li>
	<li>Nach Übernahme, die Datenanalyse mit Flow Cytometry Software durchführen. Um migrierten Zellen zu identifizieren, markieren Sie zuerst Zellen als negativ für die lebenden/Toten-Marker, wie in Abbildung 3 b gezeigt. Führen Sie dann eine einzelne Zelle Diskriminierung durch die Schaffung einer engen Tor um die Zellen auf einem SSC-Bereich Vs SSC-Höhe Grundstück gezeigt.</li>
	<li>Wählen Sie CD45 + Zellen und Tor die großen Bevölkerung von migrierten Zellen in einem FSC/SSC-Grundstück sind die Makrophagen/Schaumzellen.</li>
</ol>

<ol><li>Napoli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+streak+formation+occurs+in+human+fetal+aortas+and+is+greatly+enhanced+by+maternal+hypercholesterolemia.+Intimal+accumulation+of+low+density+lipoprotein+and+its+oxidation+precede+monocyte+recruitment+into+early+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fatty streak formation occurs in human fetal aortas and is greatly enhanced by maternal hypercholesterolemia. Intimal accumulation of low density lipoprotein and its oxidation precede monocyte recruitment into early atherosclerotic lesions.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2680-2690 (1997).</li>
<li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+in+atherosclerosis%3A+subsets+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7 (2), 77-86 (2010).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foamy+Monocytes+Form+Early+and+Contribute+to+Nascent+Atherosclerosis+in+Mice+With+Hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Foamy Monocytes Form Early and Contribute to Nascent Atherosclerosis in Mice With Hypercholesterolemia.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (8), 1787-1797 (2015).</li>
<li>Jackson, W. D., Weinrich, T. W., Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very-low+and+low-density+lipoproteins+induce+neutral+lipid+accumulation+and+impair+migration+in+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Very-low and low-density lipoproteins induce neutral lipid accumulation and impair migration in monocyte subsets.</a> Scientific Reports. 6, 20038(2016).</li>
<li>Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Jaworowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+foam+cell+formation+in+chronic+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced foam cell formation in chronic inflammatory disease.</a> Immunol. Cell. Biol. 93 (8), 683-693 (2015).</li>
<li>Llodrá, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emigration+of+monocyte-derived+cells+from+atherosclerotic+lesions+characterizes+regressive%2C+but+not+progressive%2C+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Emigration of monocyte-derived cells from atherosclerotic lesions characterizes regressive, but not progressive, plaques.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (32), 11779-11784 (2004).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3331926/">Animal Models of Atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).</li>
<li>Meir, K. S., Leitersdorf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+in+the+Apolipoprotein+E-Deficient+Mouse.+A+Decade+of+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis in the Apolipoprotein E-Deficient Mouse. A Decade of Progress.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24 (6), 1006-1014 (2004).</li>
<li>Hilgendorf, I., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+difference%3A+Monocyte+Heterogeneity+in+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Atheroscler.+Rep%22%5BJournal%5D)">Making a difference: Monocyte Heterogeneity in Cardiovascular Disease.</a> Curr. Atheroscler. Rep. 14 (5), 450-459 (2012).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+Apo+A-I+and+Lower+HDL-C+Levels+Are+Associated+With+Higher+Intermediate+CD14%2B%2BCD16%2B+Monocyte+Counts+That+Predict+Cardiovascular+Events+in+Chronic+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lower Apo A-I and Lower HDL-C Levels Are Associated With Higher Intermediate CD14++CD16+ Monocyte Counts That Predict Cardiovascular Events in Chronic Kidney Disease.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34 (9), 2120-2127 (2014).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B%2BCD16%2B+Monocytes+Independently+Predict+Cardiovascular+Events%3A+A+Cohort+Study+of+951+Patients+Referred+for+Elective+Coronary+Angiography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">CD14++CD16+ Monocytes Independently Predict Cardiovascular Events: A Cohort Study of 951 Patients Referred for Elective Coronary Angiography.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 60 (16), 1512-1520 (2012).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chemotactic+Effect+Of+Mixtures+Of+Antibody+And+Antigen+On+Polymorphonuclear+Leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The Chemotactic Effect Of Mixtures Of Antibody And Antigen On Polymorphonuclear Leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li>
<li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+activation+promotes+foam+cell+formation+by+monocytes+following+transendothelial+migration+in+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell activation promotes foam cell formation by monocytes following transendothelial migration in an in vitro model.</a> Exp. Mol. Pathol. 93, 220-226 (2012).</li>
<li>Quinn, M. T., Parthasarathy, S., Fong, L. G., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidatively+modified+low+density+lipoproteins%3A+a+potential+role+in+recruitment+and+retention+of+monocyte%2Fmacrophages+during+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (9), 2995-2998 (1987).</li>
<li>Henriksen, T., Mahoney, E. M., Steinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+macrophage+degradation+of+biologically+modified+low+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhanced macrophage degradation of biologically modified low density lipoprotein.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 3 (2), 149-159 (1983).</li>
<li>Parthasarathy, S., Raghavamenon, A., Garelnabi, M. O., Santanam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+Low-Density+Lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxidized Low-Density Lipoprotein.</a> Methods Mol. Biol. 610, 403-417 (2010).</li>
<li>Muller, W. A., Weigl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-selective+transendothelial+migration%3A+dissection+of+the+binding+and+transmigration+phases+by+an+in+vitro+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-selective transendothelial migration: dissection of the binding and transmigration phases by an in vitro assay.</a> J. Exp. Med. 176 (3), 819-828 (1992).</li>
<li>Maisa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+from+HIV-infected+individuals+show+impaired+cholesterol+efflux+and+increased+foam+cell+formation+after+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Monocytes from HIV-infected individuals show impaired cholesterol efflux and increased foam cell formation after transendothelial migration.</a> AIDS. 29 (12), 1445-1457 (2015).</li>
<li>Angelovich, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+foam+cell+formation+is+enhanced+in+monocytes+from+older+individuals+by+both+extrinsic+and+intrinsic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo foam cell formation is enhanced in monocytes from older individuals by both extrinsic and intrinsic mechanisms.</a> Exp. Gerontol. 80, 17-26 (2016).</li>
<li>Westhorpe, C. L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+HIV-1+infection+in+vitro+on+transendothelial+migration+by+monocytes+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of HIV-1 infection in vitro on transendothelial migration by monocytes and monocyte-derived macrophages.</a> J. Leukoc. Biol. 85 (6), 1027-1035 (2009).</li>
<li>Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+endothelial+cell+monolayers+that+restrict+the+transendothelial+passage+of+macromolecules+and+electrical+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current.</a> J. Cell Biol. 98 (3), 1033-1041 (1984).</li>
<li>Müller, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Endothelial+Markers+PECAM-1%2C+vWf%2C+and+CD34+in+Vivo+and+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Endothelial Markers PECAM-1, vWf, and CD34 in Vivo and in Vitro.</a> Exp. Mol. Pathol. 72 (3), 221-229 (2002).</li>
<li>Kelesidis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+impaired+HDL+function+in+HIV-1+infected+compared+to+uninfected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acquir.+Immune+Defic.+Syndr%22%5BJournal%5D)">Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals.</a> J. Acquir. Immune Defic. Syndr. , (2017).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+heterogeneity+in+obesity+and+subclinical+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis.</a> European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).</li>
<li>Gacka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+and+atherogenic+activity+of+monocytes+in+Type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Complications%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory and atherogenic activity of monocytes in Type 2 diabetes.</a> J. Diabetes Complications. 24 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Rogacev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%2B%2BCD16%2B+monocytes+and+cardiovascular+outcome+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">CD14++CD16+ monocytes and cardiovascular outcome in patients with chronic kidney disease.</a> Eur. Heart J. 32 (1), 84-92 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine vielseitige und physiologisch relevante Methode für die Bewertung der Atherogenicity von Monozyten aus menschlichen klinischen Kohorten durch die Kombination von Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung. Dieses Modell bietet Vorteile gegenüber alternativen Methoden der Zelle Schaumbildung wie es die Wirkung der Monocyte Seelenwanderung auf Zelle Schaumbildung berücksichtigt und die Messung von reverse Seelenwanderung6 neben der inhärenten ermögli...

Monocyte Seelenwanderung ist ein entscheidender Schritt in der Entwicklung von atherosklerotischen Plaques, die zu Thrombosen, Schlaganfall und Herzinfarkt führen kann. Arteriosklerotische Plaques entwickeln sich aus fetthaltige Streifen, in der Regel an den Standorten des geringen oszillierenden Blutflusses in Medium zu großen Arterien, wo hinterlegten Lipid trägt zur endotheliale Aktivierung und lokalisierte Entzündung1vorhanden. Monozyten rekrutiert, Endothelzellen in fetthaltige Streifen über Monocyte chemotaktische Proteine (z. B. CCL2) und transmigrate in der Intima-2. Im Anschluss an Seelenwanderung können Monozyten bilden atherogenen, Lipid-beladene Makrophagen Schaumzellen infolge Lipid-Aufnahme, Lipid-Synthese, Down-Regulierung des Cholesterins Ausfluss oder eine Kombination aus den oben genannten Faktoren genannt. Monozyten können auch Lipide in der Zirkulation zu sammeln und haben einen "schaumigen" Phänotyp, eventuell prädisponierende Zellen für Schaum Zelle Bildung3,4. Schaumzellen sind das bestimmende Merkmal der fetthaltige Streifen und frühe arteriosklerotische Plaques und ihrer Entstehung wird von Lipid und Entzündungsmediatoren5beeinflusst. Monozyten haben alternativ die Möglichkeit, umzukehren transmigrate von der Arterie in die Blutbahn6, wodurch Lipid aus der Intima und Handeln zur Erhaltung der Gesundheit der Arterie entfernt.
Bestimmung der Neigung von Monozyten, transmigrate über arteriellen Endothel und Form Schaumzellen in der Intima oder umgekehrt transmigrate und Lipid aus die Plakette zu tragen, ist eine wesentliche Voraussetzung für das Verständnis der Rolle der Monocyte-Aktivierung bei der Erhöhung arteriosklerotische Risiko. Maus-Modellen der CADs wie Atherosklerose sind in Aufklärung Informationen in Echtzeit in Vivo auf fetthaltige Streifen/atherosklerotischen Plaque Entwicklung wichtig. Diese Modelle erfordern jedoch eine genetische Veränderung der natürlichen Verarbeitung Fähigkeiten dieser Tiere in der Regel verbunden mit drastischen Veränderungen in der Ernährung (z. B. das ApoE/Western-Typ-Diät Modell)7,8, wodurch Cholesterin, Induktion unphysiologischen Anhäufung von zirkulierenden Lipid Ebenen der Antriebsentwicklung Plaque. Diese Modelle können Relevanz für chronische entzündliche menschlichen Erkrankungen wie HIV-Infektion begrenzt haben, die nicht zugeordnet sind erhöhte zirkulierende Cholesterin oder Low density Lipoprotein (LDL) Ebenen. Darüber hinaus Monocyte Biologie Unterschiede zwischen Menschen und Mäusen, die Prüfung der immunologische Fragen bezüglich der Relevanz der Subpopulationen von Monozyten (z. B. Mittelstufe Monozyten (CD14++CD16+))9 schwierig. Dies ist wichtig, bei der Untersuchung der Mechanismen, die Herz-Kreislauf-Krankheit zu fahren, wie fortgeschrittene Monocyte zählt unabhängig kardiovaskuläre Ereignisse10,11Vorhersagen. Während Tests existieren, um entweder Monocyte Seelenwanderung oder Schaum Zellbildung isoliert nacheinander zu messen, ist kein in-vitro- Test zur Quantifizierung der beide Aspekte der frühen Atherogenese verwenden die gleichen Zellen aus klinischer Kohorten validiert worden. Transwell Modelle verwenden ein modifizierte Boyden Zweikammer-System, wobei Zellen werden in die obere Kammer geladen und über eine poröse Kunststoff Barriere oder Cell Monolayer in eine untere Kammer, die in der Regel Medien mit Lockstoffgradient12 enthält transmigrate , 13. während am meisten benutzt für die Analyse von Leukozyten Seelenwanderung, diese Modelle nicht in der Regel einen Layer für die Intima, was zu transmigrated Zellen migrieren in Lösung integrieren und lassen sich nicht für die Messung von Schaum Zelle Bildung oder umgekehrte Seelenwanderung die gleichen Zellen. Modelle von Schaumbildung Zelle machen sich dagegen nicht transmigratory-induzierte Änderungen Monozyten oder Auswirkungen der endotheliale Aktivierung, die dazu beitragen, Schaum-Zelle Bildung14bekannt ist. Darüber hinaus verursachen diese Systeme Schaum Zellbildung von Makrophagen eingehalten Zellplatten Kultur durch die Zugabe von Sättigung Konzentrationen von exogenen oxidierten Low density Lipoprotein (OxLDL)15,16, eine wesentliche Induktor von Zelle Schaumbildung. LDL in diesen Modellen verwendeten ist daher oft durch nicht physiologisch relevanten Prozesse wie CuSO4 Behandlung17, oxidiert die physiologische Bedeutung der Studien mit diesen Modellen in Frage zu stellen.
Hier beschreiben wir eine Probe, die quantifiziert Monocyte Seelenwanderung und Zelle Schaumbildung der gleichen Zellen erfordern nicht die Zugabe von exogenen OxLDL, somit besser modellieren die Rolle von Monozyten in Zelle Schaumbildung. Dieses Modell wurde ursprünglich von Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)18entwickelt und weiterentwickelt in unserem Labor ex Vivo Atherogenicity von Monozyten isoliert unter nicht-Aktivierung bewerten Bedingungen von Einzelpersonen mit zugrunde liegenden entzündlichen Erkrankungen Begleiterkrankungen wie z. B. HIV-Infektion19 sowie Alterung20, sind, die mit einem erhöhten Risiko für Arteriosklerose in Verbindung gebracht. Dieses Modell bietet auch eine Plattform für die Beantwortung der grundlegenden biologischen Fragen die Neigung der verschiedenen Monocyte Teilmengen Form Schaum Zellen20, den Einfluss der endotheliale Aktivierung von Zytokinen wie TNF auf Zelle Schaumbildung14 , und die wandernden Eigenschaften von Monozyten wie die Tiefe und Geschwindigkeit der Seelenwanderung in Gele19. Darüber hinaus Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung mit standard-Mikroskopie quantifiziert werden kann, live Cell Imaging, flow Cytometry und Bildgebung Durchflusszytometrie, daher bietet eine vielseitige Methode zur Bewertung der Rolle von Monozyten in Atherogenese.

<table><tbody><tr><td>Präparationsreagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-500G</td><td>0,1 M NaOH verdünnt in H20</td></tr><tr><td>10x M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td></td></tr><tr><td>AcCOOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td>20 mM Essigsäure verdünnt in H20</td></tr><tr><td>Cultrex Rinderkollagen I</td><td>F& Forschung D Systems</td><td>3442-050-01</td><td>Typ I Faserkollagen</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>M199-Medien, die Earle-Salze, L-Glutamin und 2,2 g/l Natriumbicarbonat enthalten. Medien, ergänzt mit 100 &; micro; g/mL L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td></tr><tr><td>M20</td><td></td><td></td>: <td>Supplementiertes M199 mit 20 % hitzeinaktiviertem Pool- oder Spenderserum. Einzelne Lipidspezies wie LDL können zu M199 hinzugefügt werden.</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>Primäre humane Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) können aus Nabelschnüren isoliert werden, die mit Einverständniserklärung und Ethikgenehmigung gespendet wurden. Isolierte HUVEC können auch kommerziell erworben werden.</td></tr><tr>Endothelzellen <td></td><td></td><td>der menschlichen Koronararterien</td><td>Primäre Endothelzellen der Koronararterien können aus gespendeten Arterien mit Einverständniserklärung und Ethikgenehmigung isoliert werden. Isolierte Zellen können auch kommerziell erworben werden.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH Merck</td><td>10093,5V</td><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) - 0,5 M, pH 8,0</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-500G</td><td>Ethylenglykol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA) - 1 mM, pH 8,0</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0,05 % Trypsin/0,53 EDTA (1X)</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>L-Glutamin (200 mM)</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml Penicillin und 10.000 &micro; g/mL Streptomycin)</td></tr><tr><td>Serum für neugeborene Kälber</td><td>Gibco</td><td>16010-142</td><td>Serum für neugeborene Kälber: neuseeländischen Ursprungs</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056-1MG</td><td>Fibronektin - 50 & micro; g/mL Aliquots hergestellt und gelagert</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung (10x): Verdünnt auf 1x mit sterilem H20</td></tr><tr><td>0,1% TNF</td><td>Gibco</td><td>PHC3015</td><td>Rekombinantes humanes TNF - Rekonstituiert in H20 und gelagert in 10 & Mikro; g/mL Aliquote</td></tr><tr><td>Low-Density Lipoprotein</td><td>Merck Millipore</td><td>LP2-2MG</td><td>Low-Density Lipoprotein (LDL)</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Mikroskopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 oder 2% Formaldehyd</td><td>Polysciences</td><td>4018</td><td>1 oder 2 % Formaldehyd, verdünnt mit sterilem H20</td></tr>, <tr><td>50 % und 78 % Methanol</td><td>Ajax Finechem</td><td>318-2.5L GL</td><td>50 % oder 78 % v/v Methanol, verdünnt mit H20</td></tr><tr><td>Öl Rot O-Färbung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>Verdünnen auf 2 mg/ml in 22 % 1M NaOH und 78 % (v/v) Methanol</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Mikro-Glass</td><td>S41104AMK</td><td>Zwei mattierte 45 Grad geschliffene Mikroskop-Objektträger (25 x 76 mm)</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>MENCS224015GP</td><td>22 x 40 mm #1,5 Glasabdeckgläser</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M Scotch</td><td>4011</td><td>Superstarkes Außenmontageband (25,4 mm x 1,51 m)</td></tr><tr><td>Giemsa stain</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>Giemsas Azur Eosin Methylenblau Lösung (verdünntes Material 1:10 in H20)</td></tr><tr><td>Locher</td><td></td><td></td><td>Handgeführter Einzellocher (6,35 mm Locher)</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td> Roche <td>Diagnostics</td><td>11088858001</td><td>Kollagenase D verdünnt in M199-Medien auf 1 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>35 & Mikro; m Nylon-Mesh-beschichtete Polystyrol-FACS-Schläuche</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>35 &micro; m Nylon-Mesh-bedeckte Polystyrol-FACS-Schläuche</td></tr><tr><td>Lebend/tot fixierbarer gelber Fleck für tote Zellen</td><td>Life Technologies</td><td>L34959</td><td>Lebend/tot fixierbarer gelber Fleck für tote Zellen</td></tr><tr><td>FACS-Waschen</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie sich vor, indem Sie 1 x PBS-, 2 mM EDTA und 1 % Serum für neugeborene Kälber</td></tr> <tr><td>mischenName</td><td><>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer </td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Plasticware96 Well-Platte</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Nunclon</td><td>167008</td><td>Delta surface flat-bottom 96 well plate</td></tr><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Steril 10 cm Petrischale</td></tr><tr><td>1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>Eppendorf Röhrchen</td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Samco Scientific</td><td>222-20S</td><td>Sterile Transferpipette (1 mL, großer Kolben)</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der monocyte seelenwanderung und schaumbildung zelle von personen mit chronischen entzündlichen erkrankungen

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Koronare Herzkrankheit (KHK) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Arteriosklerose, eine führende Ursache für CAD, ist initiiert von der Seelenwanderung des angeborenen Immunsystems Monozyten zu entzündlichen Websites hinterlegten Lipid namens fetthaltige Streifen, die in Arterienwände des Mediums zu großen Arterien vorhanden sind. Die pathogenen Läsionen in diesem frühen Stadium der Arteriosklerose zeichnet sich die Reifung von Monozyten, die in Arterien zu Schaumzellen oder Lipid-beladene Makrophagen zu migrieren. Beträchtlichen Beweis stützt die Hypothese, das Risiko von Arteriosklerose wird durch chronische Entzündungszustände Begleiterkrankungen wie rheumatoide Arthritis und HIV sowie allgemeine Alterung erhöht, und das dieses Risiko wird durch Monocyte vorhergesagt Aktivierung. Während Maus-Modelle eine gute Plattform bieten, um die Rolle von Monozyten in Atherogenese in Vivozu untersuchen, sie erfordern genetische Veränderung der natürlichen Cholesterin-Stoffwechsel und drastische Veränderung der normalen Maus Diäten, und haben nur begrenzte Eignung für die Studie der atherogenen Einflüsse der menschlichen Comorbid Krankheiten. Dies hat uns motiviert, ein menschlichen in-vitro- Modell zur Messung der atherogenen Potenzials von Monozyten von Individuen mit bestimmten Krankheitszuständen isoliert zu entwickeln. Derzeit sind menschlichen in-vitro- Modelle begrenzt, insofern sie Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung isoliert zu bewerten. Hier beschreiben wir ein Protokoll in der Monozyten aus Patientenblut isolierte transmigrate in menschlichen Endothelzellen in einem Typ-1-Kollagen-Matrix und ihre Neigung zu Schaumzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von exogenen Lipid heranreifen wird gemessen. Das Protokoll wurde für die Verwendung von menschlichen Monozyten von Personen mit HIV-Infektion und älteren Menschen, die HIV-nicht infizierten gereinigt validiert. Dieses Modell ist vielseitig und ermöglicht Monocyte Seelenwanderung und Schaum Zellbildung zu bewertenden Verwendung entweder Mikroskopie oder Durchflusszytometrie sowie ermöglicht die Beurteilung der atherogenen Faktoren im Serum oder Plasma zu präsentieren.

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung
Monozyten werden hinzugefügt, um das Modell wie in Abbildung 1beschrieben, und sechs Gele sind bereit für jede Bedingung. Monozyten für 6 Gele pro Spender (d.h., 5.0 x 104 Monozyten pro Gel 6 Gele = 3,0 x 105 Monozyten pro Spender) sind zu einem Endvolumen von 600 µL M199 Medien enthält die erforderlichen Se...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung der Seelenwanderung von Monozyten in menschlichen Endothelzellen Monolagen und ihre anschließende Reifung in Schaumzellen. Dies stellt eine vielseitige Methode, die atherogenen Eigenschaften von Monozyten aus Menschen mit unterschiedlichen Erkrankungen isoliert zu beurteilen und Faktoren im Blut zu bewerten, die diese Neigung erhöhen können.

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die Fähigkeit von Monozyten aus humanen klinischen Proben zu quantifizieren, eine transendotheliale Migration und Schaumzellbildung zu durchlaufen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, wie z. B. das atherogene Potenzial von Zellen von Personen, die ein Risiko für eine akute koronare Herzkrankheit haben. Der große Vorteil dieser Technik besteht darin, dass klinische Proben sowohl aus frischem Vollblut als auch aus gelagerten Patientenkohorten gemessen werden können.Darüber hinaus kann die Bildung von Schaumzellen sowohl durch Mikroskopie als auch durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden. Bereiten Sie zunächst die polymerisierten Kollagengele aus einer frischen Kollagensuspension vor. Zu einem Fünf-Milliliter-Polystyrol-Röhrchen fügen Sie Natriumhydroxid, dann 10 mal M199, dann saure Säure und schließlich faseriges Kollagen hinzu.Mischen Sie dies gut durch Pipettieren. Als nächstes aliquotieren Sie 50 Mikroliter in die internen Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden. In die Außenkanten der Vertiefungen 200 Mikroliter einmaliges Dulbecco

quantification-monocyte-transmigration-foam-cell-formation-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu...

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Wir berichten über eine in vitro Methode, die die Quantifizierung der tatsächlichen Anzahl von Adhäsionszellen innerhalb einer Endothelzell-Monoschicht ermöglicht.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Charakterisierung von Monocyte Teilmengen von Vollblut Durchflusszytometrie. Dazu gehören wie Tor die Teilmengen und bewerten ihren Ausdruck der oberflächenmarker skizziert und geben ein Beispiel für die Beurteilung des Ausdrucks (entzündlich) M1 und M2-Marker (entzündungshemmend).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Hier präsentieren wir Ihnen eine integrierte Protokoll, die Monocyte Subpopulation Handel unter in-vitro-Fluss durch Verwendung von spezifischen Oberflächenmarker und konfokale Fluoreszenzmikroskopie misst. Dieses Protokoll kann sequentielle Rekrutierung Schritte sowie zu erkunden, andere Leukozyten-Subtypen mit anderen spezifischen Oberflächenmarker Profil verwendet werden.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung der chemotaktischen Aktivität von Blutmonozyten in Mausmodellen vor, um die Auswirkungen ernährungsphysiologischer, pharmakologischer und genetischer Interventionen auf die Blutmonozyten zu bewerten und die von Denmonzyten abgeleiteten Makrophagen in Mausmodelle mit monocyt-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-geladenen Kellermembran-gelüfteten Gelsteckern.

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.

Durchflusszytometrie Analyse von Immunzell-Subsets innerhalb der Murinenmilen, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe in einem Osteoarthritis-Modell

Erfahren Sie die Quantifizierung der Monozyten-Transmigration und Schaumbildung in der kardiovaskulären Forschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse klinischer Proben aus frischem Blut oder gespeicherten Kohorten.

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Weitere Videos entdecken