Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, die Fähigkeit von Monozyten aus humanen klinischen Proben zu quantifizieren, eine transendotheliale Migration und Schaumzellbildung zu durchlaufen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, wie z. B. das atherogene Potenzial von Zellen von Personen, die ein Risiko für eine akute koronare Herzkrankheit haben. Der große Vorteil dieser Technik besteht darin, dass klinische Proben sowohl aus frischem Vollblut als auch aus gelagerten Patientenkohorten gemessen werden können.

Darüber hinaus kann die Bildung von Schaumzellen sowohl durch Mikroskopie als auch durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden. Bereiten Sie zunächst die polymerisierten Kollagengele aus einer frischen Kollagensuspension vor. Zu einem Fünf-Milliliter-Polystyrol-Röhrchen fügen Sie Natriumhydroxid, dann 10 mal M199, dann saure Säure und schließlich faseriges Kollagen hinzu.

Mischen Sie dies gut durch Pipettieren. Als nächstes aliquotieren Sie 50 Mikroliter in die internen Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden. In die Außenkanten der Vertiefungen 200 Mikroliter einmaliges Dulbecco PBS laden, um ein Austrocknen zu verhindern.

Nach zweistündiger Inkubation bei 37 Grad Celsius polymerisiert das Kollagen. Überlagern Sie dann die Gele mit 150 Mikrolitern einmalig supplementiertem M199 und inkubieren Sie sie, bis sie fünf Tage später verwendet werden können. Um die gelagerten Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene zu erweitern, bereiten Sie einen 25 Quadratzentimeter großen Kulturkolben mit einem Milliliter Fibronektinlösung vor und inkubieren Sie die Schale 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

In der Zwischenzeit tauen Sie die gelagerten Zellen in einem Wasserbad auf, um sie in M20 wieder zu suspendieren. Sobald die Zellen aufgetaut sind, aspirieren Sie die restliche Fibronektinlösung aus der Schale und verteilen Sie die Zellen. Dann Kultur zum Zusammenfluss, indem die Medien nach zwei bis drei Tagen ausgetauscht werden.

Die HUVECs sollten am fünften Tag der Kultivierung zusammenfließen. Trennen Sie sie, indem Sie den Überstand der Kultur aus dem Kolben aspirieren, und waschen Sie dann das serumhaltige Medium mit zwei bis drei Millilitern einmaligem PBS ab. Fügen Sie dann fünf Milliliter verdünntes Trypsin hinzu und inkubieren Sie die Zellen kurz bei Raumtemperatur, indem Sie die Zellen vorsichtig schütteln, bis sie abgelöst erscheinen.

Sammeln Sie sie dann schnell mit fünf Millilitern M20 und geben Sie die Suspension in ein 10-Milliliter-Röhrchen und zentrifugierte Zellen. Resuspendieren Sie nun die Zellen in M20 bei 200.000 Zellen pro Milliliter. Aspirieren Sie dann das M199 aus der vorbereiteten Kollagenplatte und fügen Sie jedem Gel 100 Mikroliter HUVECs hinzu.

Setzen Sie die Kultur drei Tage lang fort. Am achten Tag der Kultivierung der HUVECs aktivieren Sie die Monoschichten, bevor Sie die Monozyten hinzufügen. Nach dem Aspirieren des überlagernden Mediums werden 100 Mikroliter humane TNF-alpha-Lösung in jede Vertiefung gegeben.

Inkubieren Sie die Platte dann vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Gele zweimal mit 100 Mikrolitern M199 pro Waschgang. Fügen Sie nun 50.000 frisch isolierte Monozyten oder gereinigte Monozyten-Untergruppen in 100 Mikrolitern M20 zu den HUVEC-Monolayern hinzu.

Nachdem Sie die Monozyten hinzugefügt haben, inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang, um eine Vorwärtstransmigration der Zellen zu ermöglichen. Nach einer Stunde sammeln Sie die nicht transmigrierten Zellen in Waschlösung. Beginnen Sie mit dem Poolen von zwei EGTA-Waschungen mit 100 Mikrolitern pro Vertiefung.

Anschließend schleudern Sie die kombinierten Waschlösungen bei 300 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius herunter. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 30 Mikrolitern PBS und zählen Sie die Zellen, um den Prozentsatz der vorwärts transmigrierten Zellen zu bestimmen. Waschen Sie nun die Plattenvertiefungen einmal mit M199 und geben Sie 100 Mikroliter frisches M20 in die Plattenvertiefungen und inkubieren Sie die Platte zwei Tage lang.

Wiederholen Sie nach zwei Tagen das Verfahren zum Sammeln der nicht transmigrierten Zellen in EGTA-Waschlösung, um umgekehrt transmigrierte Zellen zu sammeln und mit der phänotypischen Analyse der Zellen fortzufahren. Um die gelgebundenen Zellen durch FACS-Analyse phänotypisch zu charakterisieren, verdauen Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 37 Grad Celsius warmes Kollagen D hinzufügen und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation mazerieren Sie die Gele mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze und inkubieren Sie sie weitere 20 Minuten lang, um die Gele vollständig zu verdauen.

Sobald sie vollständig verdaut sind, filtrieren und poolen Sie die verdauten Replikatgele durch ein 35-Mikron-Nylonnetz in einem FACS-Röhrchen auf Eis. Waschen Sie nun die gefilterten Zellen einmal mit kalter FACS-Waschlösung. Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern Kaltwaschlösung.

Führen Sie dann die FACS-Färbung und -Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. Um die Zellen mikroskopisch zu analysieren, färben Sie die Zellen zunächst wie im Textprotokoll beschrieben. Um die gefärbten Zellen zu lösen, umranden Sie die Vertiefungen mit einer 21-Gauge-Nadel, wobei die Fase nach außen zeigt.

Bereiten Sie als Nächstes Objektträger vor, um die Gele zu montieren. Stanzen Sie zwei kleine Löcher in einen Streifen doppelseitiges Klebeband und befestigen Sie dann das Klebeband an der Rutsche und entfernen Sie die Schutzbeschichtung. Geben Sie als Nächstes einen Tropfen Wasser in jedes Loch im Klebeband.

Übertragen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig zwei Gele auf die beiden Löcher und decken Sie das Klebeband ab. Befestigen Sie abschließend vorsichtig ein Deckglas an dem Klebeband und fahren Sie mit der Visualisierung der Zellen fort. Nach der Transmigration wurden nicht transmigrierte Zellen wie beschrieben gezählt.

Insgesamt wurden 15.000 nicht transmigrierte Zellen geborgen, und der Prozentsatz der Vorwärtstransmigration wurde auf 95 % bestimmt. Nach 48 Stunden weiterer Inkubation wurden 36.000 rückwärts transmigrierte Zellen gewonnen, was einer Rückwärtstransmigration von 12,6 % entspricht. Beim Färben der Gele mit ölrotem O kamen Schaumzellen zum Vorschein, die durch weiße Pfeile gekennzeichnet waren, und Makrophagen, die mit schwarzen Pfeilen gekennzeichnet waren. Diese Monozyten wurden während der Transmigration mit oxidiertem LDL behandelt, einer Substanz, die in herkömmlichen Schaumzell-Induktionsmodellen zur Induktion von Schaumzellen verwendet wird.

Aggregierte Zellzahldaten von 12 Spendern bestätigten, dass die Inkubation von Monozyten mit oxidiertem LDL eine stärkere Schaumzellbildung induzierte als bei der alleinigen Inkubation von Monozyten mit nativen LDL- oder M199-Medien. Die transmigrierten Zellen wurden ebenfalls mittels Durchflusszytometrie analysiert. Nach Ausschluss von toten Zellen, Dubletten und CD45-negativen HUVECs wurde die Hauptpopulation migrierter Zellen ausgewählt und die mittlere Fluoreszenzintensität der interessierenden Rezeptoren mit den Fluoreszenz-minus eins- oder Isotyp-Kontrolldaten verglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diesen Assay zur Quantifizierung der transendothelialen Monozytenmigration und der Schaumzellbildung aus klinischen Proben des Menschen verwenden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen klinischen Proben äußerst gefährlich sein kann und immer eine gute Labortechnik verwendet werden muss.