博莱霉素对小鼠气管的预处理提高原位肺癌细胞植入的效率
2018年6月28日
本文介绍一种通过对气道损伤进行预适应来显著提高肺癌细胞原位植入的方法。这种方法也可以应用于研究肺微环境中的间质相互作用, 转移传播, 肺癌的共同发病, 并更有效地产生病人的移植。
该程序的总体目标是提高将肿瘤起始肺癌细胞移植到小鼠气道中的效率。这种方法可以帮助建立新的临床前模型，以回答癌症生物学中的关键问题，包括耐药性的原因以及纤维化与肺癌之间的关系。该技术的主要优点是它提高了肿瘤起始细胞移植到各种小鼠品系肺部的效率。
这项技术的影响延伸到治疗，因为它使我们能够模拟更多种类的人类肺癌亚型，已知这些亚型对治疗有不同的临床反应。对于该方案，必须首先给小鼠注射博来霉素。然后，14 天后，注射肿瘤细胞。
两种注射的程序非常相似，如此处所述。注射前 2 小时，在冰上解冻博来霉素原液并将其稀释至工作浓度。把它放在冰上。
对于细胞推注，请按照文本方案中的说明制备细胞悬液。每只鼠标的手术时间总共约为 10 分钟。请务必使用脚趾捏确认适当的麻醉，并在眼睛上涂抹兽医药膏。
此时，如果鼠标有深色毛发，则剃掉腹侧和背侧的整个肋骨区域，以便正确成像。然后，将鼠标放在插管平台上，用门牙固定鼠标，使其背靠平台。如果要注射细胞推注，请立即轻轻研磨重悬。
现在照亮上胸部区域，张开嘴巴，然后用扁平镊子轻轻拉出舌头。取出针头，为气管准备一根静脉导管，然后将其放在气管开口上。接下来，将导管插入气管，直到导管顶部靠近门牙，并照射导管内部以确认其位置。
然后，将 50 微升新鲜制备的博来霉素或细胞悬液直接分配到导管中。等待几秒钟，让整个体积沿着导管向下移动。然后，取出导管并将其丢弃在 10% 漂白剂中。
如果鼠标没有吸入液体，请仔细监测其呼吸并调整导管位置。如果鼠标停止呼吸，请立即取出导管并让鼠标呼吸，然后再将导管重新插入。拔除导管后，继续执行该程序，让五只治疗过的小鼠仍然麻醉，并准备好成像。
为了恢复，将鼠标仰卧在恢复笼中 IACUC 批准的加热垫上并监测它，直到它完全恢复。注射细胞后两到三分钟，使用胰岛素针头在眶后注射 100 微升荧光素。每次成像会话交替用于注射的眼睛。
等待至少两分钟后，在动物生物发光成像仪中将最多五只小鼠置于胸骨斜躺位置，并使用发光设置获取背侧图片。在控制面板下，调整分辨率和灵敏度设置，以测量细胞的发光。对于大多数应用程序，从 3 分钟开始，将像素合并设置为中等，将 f/stop 设置为 1，将视野设置为 d，并将主体高度设置为 1.5。
如果注射成功，则会在单肺或双肺的上胸部区域检测到信号。如果细胞聚集在气管入口处，则注射不成功。拍摄背像后，翻转小鼠并获取腹侧图像并根据需要调整设置。
成像后，按照文本方案中的说明进行术后护理。然后，在植入后 3 天和此后每周重复此成像方案。要分析图像，请使用生物发光分析软件。
首先，加载系列中所有适当的图像。本节详细介绍了一个软件包。接下来，对于每只鼠标，在系列的第一张图像中，创建一个感兴趣的方形区域，并将其放置在覆盖整个肺部区域的上胸部区域。
然后，右键单击，访问 copy all regions of interest 功能，并使用此工具将相同的感兴趣区域应用于组中的每个图像。然后，在每张图像中，调整方块的位置以覆盖每只鼠标的上胸部。对腹侧和背侧视图执行此作。
现在，在图像窗口的左上角，选择 photons 函数。然后选择 measure 选项。然后，来自感兴趣区域的数据在输出表中显示为总通量。
根据需要分析此数据。当免疫功能低下时，无胸腺小鼠用博来霉素治疗。在细胞推注植入之前，在博来霉素处理的小鼠中观察到第 14 天时观察到短暂纤维化，但在载体处理的小鼠中未观察到。
接下来，来自已建立的人肺癌细胞系 H2030 的细胞通过气管内输送到这些小鼠的肺部。35 天后，博来霉素处理的小鼠具有较高的肺肿瘤负荷。然而，在载体处理的动物中，未检测到肿瘤。
使用组织学确认肺肿瘤负荷。用载体预处理的肺没有肿瘤结节的证据，而博来霉素预处理的肺有大的肿瘤结节。移植转移性 H2030 BrM 3 细胞系后，到 39 至 57 天时，生物发光强度太强，无法成像，因此在离体远处器官中分析转移。
可以在各种组织中检测到小病变，这表明这种方法有望研究自发播散性疾病。一旦掌握，这项技术可以在每笼 10 分钟内完成，五只小鼠无需成像，每笼 20 分钟即可完成成像。在尝试此程序时，重要的是要记住确保正确插入导管并监测动物的呼吸。
在此程序之后，可以执行其他方法，例如药理学研究或收获组织的氨基乙酸化学，以回答其他问题，例如移植的肿瘤对药物的反应或表征特定于肺部的肿瘤基质相互作用。开发后，该技术可应用于不同的小鼠品系和肿瘤模型，包括生理相关环境中的患者来源的异种移植物。不要忘记，使用博来霉素可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在生物危害罩中作和正确处置。
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概述
本文描述了一种通过损伤预处理气道以增强肺癌细胞在小鼠肺中移植的方法。该技术可以促进基质相互作用、转移性扩散和肺癌共病的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 转化研究
- 临床前模型
背景
- 将肿瘤起始肺癌细胞移植到小鼠中对于研究癌症生物学至关重要。
- 了解药物耐药性和纤维化与肺癌之间的关系是必要的。
- 不同的人类肺癌亚型对治疗的反应各不相同。
- 当前的模型可能无法充分代表这些变化。
研究目的
- 提高肺癌细胞在小鼠中移植的效率。
- 建立能回答癌症生物学关键问题的临床前模型。
- 模拟更广泛的人类肺癌亚型。
使用的方法
- 用博莱霉素注射小鼠以诱导气道损伤。
- 14天后，将肿瘤细胞注射到气道中。
- 评估不同小鼠品系的移植效率。
- 进行基质相互作用和转移行为的分析。
主要结果
- 该方法显著提高了肿瘤起始细胞的移植效率。
- 它允许模拟多样化的肺癌亚型。
- 获得了关于肺癌和纤维化之间关系的见解。
- 突出了对治疗和理解药物耐药性的潜在影响。
结论
- 该技术增强了临床前模型中肺癌生物学的研究。
- 它为研究各种肺癌亚型的治疗反应提供了平台。
- 未来的研究可以利用这种方法探索新的治疗策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Establishing physiologically relevant orthotopic lung cancer models remains a bottleneck in preclinical oncology due to low engraftment efficiency. This method addresses a critical discovery-stage challenge by enhancing tumor cell take rates through airway preconditioning, enabling more reliable assessment of tumorigenic capacity. Improved model fidelity supports better go/no-go decisions in target validation and lead identification by reducing biological noise and increasing predictive confidence in downstream therapeutic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant lung microenvironment.
- Operational Value: Increases engraftment efficiency from 0-17% to 71-100%, reducing animal use and experimental variability.
- Strategic Value: Supports target de-risking by allowing consistent tumorigenic capacity assessment across mouse strains and tumor origins.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts for longitudinal tumor burden monitoring.
- Operational Value: Standardizes orthotopic engraftment procedure across diverse murine models and cell sources.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of therapeutic agents in models that recapitulate lung-specific stromal interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models metastatic dissemination to distant organs, enabling study of clinically relevant disease progression.
- Operational Value: Works with limiting cell numbers, supporting preclinical testing of patient-derived xenografts and rare biospecimens.
- Strategic Value: Enhances preclinical continuity by linking fibrosis modulation to lung cancer outgrowth and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for lung cancer programs where stromal context influences drug response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on fibrosis-cancer interactions and stromal-mediated tumorigenicity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor take metrics essential for assay validation and compound prioritization.
- Analytics: Provides longitudinal bioluminescence and histological endpoints for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Models lung-to-organ metastasis, enabling evaluation of anti-metastatic strategies in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for engrafting diverse lung cancer subtypes across strains, reducing model development time.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumorigenicity assays by reducing false-negative engraftment rates.
- Operational Value: Requires only 10-20 minutes per cage of five mice, supporting high-throughput model generation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by improving model reliability in preclinical efficacy studies.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of lung cancer targets with enhanced preclinical validation in orthotopic settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine intubation and intratracheal injection techniques.
- Necessitates biosafety precautions for bleomycin handling, including use of a biohazard hood and proper waste disposal.
- Depends on access to bioluminescence imaging infrastructure for longitudinal engraftment monitoring.
- Requires standardization of bleomycin dosing and 14-day injury-to-engraftment interval across sites.
- Limited to immunocompromised or syngeneic models where engraftment is measurable; not applicable to immunocompetent syngeneic models without adaptation.
