博莱霉素对小鼠气管的预处理提高原位肺癌细胞植入的效率

该程序的总体目标是提高将肿瘤起始肺癌细胞移植到小鼠气道中的效率。这种方法可以帮助建立新的临床前模型，以回答癌症生物学中的关键问题，包括耐药性的原因以及纤维化与肺癌之间的关系。该技术的主要优点是它提高了肿瘤起始细胞移植到各种小鼠品系肺部的效率。

这项技术的影响延伸到治疗，因为它使我们能够模拟更多种类的人类肺癌亚型，已知这些亚型对治疗有不同的临床反应。对于该方案，必须首先给小鼠注射博来霉素。然后，14 天后，注射肿瘤细胞。

两种注射的程序非常相似，如此处所述。注射前 2 小时，在冰上解冻博来霉素原液并将其稀释至工作浓度。把它放在冰上。

对于细胞推注，请按照文本方案中的说明制备细胞悬液。每只鼠标的手术时间总共约为 10 分钟。请务必使用脚趾捏确认适当的麻醉，并在眼睛上涂抹兽医药膏。

此时，如果鼠标有深色毛发，则剃掉腹侧和背侧的整个肋骨区域，以便正确成像。然后，将鼠标放在插管平台上，用门牙固定鼠标，使其背靠平台。如果要注射细胞推注，请立即轻轻研磨重悬。

现在照亮上胸部区域，张开嘴巴，然后用扁平镊子轻轻拉出舌头。取出针头，为气管准备一根静脉导管，然后将其放在气管开口上。接下来，将导管插入气管，直到导管顶部靠近门牙，并照射导管内部以确认其位置。

然后，将 50 微升新鲜制备的博来霉素或细胞悬液直接分配到导管中。等待几秒钟，让整个体积沿着导管向下移动。然后，取出导管并将其丢弃在 10% 漂白剂中。

如果鼠标没有吸入液体，请仔细监测其呼吸并调整导管位置。如果鼠标停止呼吸，请立即取出导管并让鼠标呼吸，然后再将导管重新插入。拔除导管后，继续执行该程序，让五只治疗过的小鼠仍然麻醉，并准备好成像。

为了恢复，将鼠标仰卧在恢复笼中 IACUC 批准的加热垫上并监测它，直到它完全恢复。注射细胞后两到三分钟，使用胰岛素针头在眶后注射 100 微升荧光素。每次成像会话交替用于注射的眼睛。

等待至少两分钟后，在动物生物发光成像仪中将最多五只小鼠置于胸骨斜躺位置，并使用发光设置获取背侧图片。在控制面板下，调整分辨率和灵敏度设置，以测量细胞的发光。对于大多数应用程序，从 3 分钟开始，将像素合并设置为中等，将 f/stop 设置为 1，将视野设置为 d，并将主体高度设置为 1.5。

如果注射成功，则会在单肺或双肺的上胸部区域检测到信号。如果细胞聚集在气管入口处，则注射不成功。拍摄背像后，翻转小鼠并获取腹侧图像并根据需要调整设置。

成像后，按照文本方案中的说明进行术后护理。然后，在植入后 3 天和此后每周重复此成像方案。要分析图像，请使用生物发光分析软件。

首先，加载系列中所有适当的图像。本节详细介绍了一个软件包。接下来，对于每只鼠标，在系列的第一张图像中，创建一个感兴趣的方形区域，并将其放置在覆盖整个肺部区域的上胸部区域。

然后，右键单击，访问 copy all regions of interest 功能，并使用此工具将相同的感兴趣区域应用于组中的每个图像。然后，在每张图像中，调整方块的位置以覆盖每只鼠标的上胸部。对腹侧和背侧视图执行此作。

现在，在图像窗口的左上角，选择 photons 函数。然后选择 measure 选项。然后，来自感兴趣区域的数据在输出表中显示为总通量。

根据需要分析此数据。当免疫功能低下时，无胸腺小鼠用博来霉素治疗。在细胞推注植入之前，在博来霉素处理的小鼠中观察到第 14 天时观察到短暂纤维化，但在载体处理的小鼠中未观察到。

接下来，来自已建立的人肺癌细胞系 H2030 的细胞通过气管内输送到这些小鼠的肺部。35 天后，博来霉素处理的小鼠具有较高的肺肿瘤负荷。然而，在载体处理的动物中，未检测到肿瘤。

使用组织学确认肺肿瘤负荷。用载体预处理的肺没有肿瘤结节的证据，而博来霉素预处理的肺有大的肿瘤结节。移植转移性 H2030 BrM 3 细胞系后，到 39 至 57 天时，生物发光强度太强，无法成像，因此在离体远处器官中分析转移。

可以在各种组织中检测到小病变，这表明这种方法有望研究自发播散性疾病。一旦掌握，这项技术可以在每笼 10 分钟内完成，五只小鼠无需成像，每笼 20 分钟即可完成成像。在尝试此程序时，重要的是要记住确保正确插入导管并监测动物的呼吸。

在此程序之后，可以执行其他方法，例如药理学研究或收获组织的氨基乙酸化学，以回答其他问题，例如移植的肿瘤对药物的反应或表征特定于肺部的肿瘤基质相互作用。开发后，该技术可应用于不同的小鼠品系和肿瘤模型，包括生理相关环境中的患者来源的异种移植物。不要忘记，使用博来霉素可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在生物危害罩中作和正确处置。