完整蛋白质复合物的化学交联和质谱分析研究多亚基蛋白质组合体的体系结构

将交联与非变性质谱相结合的总体目标是获得多亚基蛋白质组装体的互补结构信息，这有助于阐明它们的三维排列。化学交联和非变性质谱有助于回答结构生物学中的关键问题，例如组成、连接和化学计量。结合多种技术的主要优点是可以获得互补信息，而这种信息是仅靠一种技术无法获得的。

我们的工作流程可应用于任何其他蛋白质复合物。它可以从盐或组织中纯化，也可以从纯化的蛋白质中重构。首先，将 7.5 μL 的 4 倍简单缓冲液和 3 μL 的 10 倍还原剂涂到所需的蛋白质复合物中。

以 16 倍重力的 200 倍离心样品 1 分钟。离心后，将样品在 70 °C 下加热 10 分钟。准备 4% 至 12% 梯度的凝胶进行电泳，并将凝胶放入电泳室中。

用水稀释先前制备的电泳缓冲液 20 倍，并填充电泳室。然后，向内腔中加入 0.5 毫升的抗氧剂。在凝胶的第一个腔中加载合适的蛋白质标记物，并将蛋白质样品加载到其余腔中。

然后，在 200 伏电压下分离蛋白质适当的时间。要对蛋白质条带进行染色，请将凝胶转移到凝胶染色盒中，并用水基考马斯静置溶液覆盖凝胶。将凝胶在室温下在水平凝胶振荡器上孵育过夜。

第二天，用水代替染色液，对凝胶进行脱色。重复上一步大约 3 到 5 次，直到凝胶背景看起来清晰。现在，使用手术刀从凝胶上切下由蓝色考马斯染色可见的蛋白质条带。

小心地将蛋白质条带切成大约 1 x 1 毫升的小块。然后，用水和乙腈洗涤蛋白质条带。用 DTT 还原二硫键，然后用碘乙酰胺烷基化半胱氨酸残基。

在此之后，按照文本方案中的说明用胰蛋白酶消化蛋白质。为了提取肽，将凝胶块与碳酸氢铵和乙腈一起孵育，并收集含肽的上清液。然后，将凝胶块与 5% 甲酸和乙腈一起孵育，并收集含肽的上清液。

收集含肽的上清液后，混合两种上清液，并通过在真空离心机中蒸发溶剂来干燥提取的肽。肽干燥后，将它们与 20 微升 2% 乙腈和 0.1% 甲酸溶液混合。用超声处理浴溶解肽 2 到 3 分钟。

然后，在离心机中以 16 倍、200 倍重力离心样品 30 分钟。将样品转移到自动进样器样品瓶中后，向纳离子 LC-MS/MS 系统中注入 5 μL，然后将肽混合物上样到反相 C18 预柱上，以在线脱盐和浓缩肽。通过在 1， 000 倍重力和 4 摄氏度下离心 1 分钟，从尺寸排阻离心柱中取出储存缓冲液。

弃去流通液后，加入 500 μL 200 毫摩尔乙酸铵，然后离心，将色谱柱洗涤 3 次。离心后，将 20 μL 蛋白质样品上样到色谱柱上，并以 1， 000 倍重力和 4 摄氏度离心 4 分钟。现在，将先前准备好的镀金毛细管放入毛细管支架中。

打开针尖，用 1 到 4 微升蛋白质样品填充毛细管。将毛细管支架与质谱仪的纳米电喷雾源连接，并将毛细管尖端定位在距锥孔 0.5 至 1.5 厘米的位置。使用每小时 80 至 150 升纳流气体开始喷雾，并调整气流以保持喷雾稳定。

调整 Q-TOF 乐器的参数和 Tune 页面。然后，单击 Acquire 按钮开始采集，并结合尽可能多的扫描以获得良好的质谱。溶解 1.43 毫克 BS3 和 100 微升水，制备 25 毫摩尔储备液。

接下来，将 BS3 添加到蛋白质复合物中。使用不同量的 BS3 来确定最佳交联剂浓度。将反应混合物在 25 摄氏度下在热混合器中孵育 1 小时。

现在，用 4% 至 12% 梯度凝胶对交联蛋白进行 SDS 页面。如前所述，切开凝胶条带并通过凝胶内消化消化蛋白质。从凝胶内消化获得肽后，如前所述进行液相色谱耦合质谱法。

异源十聚体 RvB1/B2 和异八聚体 CPS 复合物的所有蛋白质亚基均以高可信度鉴定。RvB1/RvB2 的质谱揭示了对应于六聚体和十二聚体双环的两个物种。RvB1/B2 复合物的晶体结构显示了双环的排列。

将 BS3 添加到 RvB1/RvB2 复合物中会导致蛋白质的共价键，从而导致蛋白质条带具有更高的分子量。增加的 BS3 会产生更多的交联物质，而非交联蛋白亚基减少。交联二肽谱图显示两种肽的 Y 离子系列，证实了这种蛋白质相互作用。

BS3 交联的结果在显示分子内相互作用以及不同亚基之间的相互作用的相互作用网络中可视化。CPS 的天然质谱显示了异二聚体、异四聚体和异八聚体。四聚体和八聚体 CPS 的串联质谱法揭示了小 CPS 亚基的解离。

CPS 与 BS3 交联剂的化学交联显示 CPS 大亚基的两个拷贝之间存在几个分子内交联。晶体结构表明，四组核心和外围小亚基之间的相互作用表面非常小，这可能解释了亚基间相互作用的缺乏。一旦掌握，如果执行得当，我们的工作流程可以在一周内完成。

由于蛋白质组装太复杂，因此需要额外的时间进行数据分析。按照此程序，随后可以执行计算建模以获得蛋白质复合物的三维模型。观看本视频后，您应该对如何进行化学交联和非变性质谱实验有很好的了解，直到这两种互补的技术有助于阐明蛋白质组装体的结构。