T波离子迁移质谱蛋白复合物分析的基本实验程序

以下实验的总体目标是确定蛋白质复合物的整体形状。这是通过获取蛋白质复合物离子的质谱铁迁移率数据并测量每种电荷态的漂移时间值来实现的。作为第二步，验证实验条件，以确保天然蛋白质结构的迁移率测量。

接下来，将测得的漂移时间值与横截面积相关联。结果确定了具有未知三维结构的蛋白质或蛋白质复合物的碰撞截面值。这些信息提供了有关其整体形状、亚基堆积和拓扑结构的线索。

嗨，我是来自怀斯曼科学研究所生物化学系麦克风实验室的 Isaac Leski，我是同样来自 mi 实验室的 Naam Kirschenbaum。今天，我们将展示使用混合质谱和铁迁移率仪器测量碰撞横截面蛋白质复合物的程序。我们在实验室中使用该程序来研究蛋白质复合物的整体形状和组织。

那么让我们开始吧。该程序侧重于蛋白质复合物的铁迁移率、质谱或 IMM MS 分析。样品制备步骤、仪器校准以及 MS 和串联 MS 优化程序在相关的 JO 方案中进行了演示。

通常，该方案涉及挥发性缓冲液（如乙酸铵）中的低微摩尔浓度复合物。鉴于每个纳流毛细管消耗 1 到 2 微升，准备 10 到 20 微升的最小体积，以优化 MS 条件。要开始此过程，请将行波或 T 波突触 IMMS 设置为以下作迁移率模式，其中三波和压力自动设置为 IM 和离子的飞行时间分离、正离子采集和 V 模式，设置离子通过飞行管的路径和反射打开这里的所有气体。

氮气用于 IM 分离，氩气用于捕集区和转移区。IMS 装置的推荐初始值为 24 mL/min 的气体流量和 1.5 mL/min 的捕集区域。接下来，设置未知蛋白质复合物的 mast 电荷比采集范围。

最初使用较宽的质量范围，然后将其减小到所需的值，并相应地调整 MS 曲线。为了获得大型复合物的最大传输效率，采集质量范围应设置为 1030 2000 MA 电荷比，MS 曲线应设置为自动。否则，可以根据显示的图表设置配置文件。

检查 RF 设置，如有必要，调整为适合大蛋白复合物的值，如图所示。接下来，加载样品，施加毛细管电压和低纳流压力。喷雾开始后，尝试将纳流压力降低到最小值。

此外，调整毛细管相对于锥体的位置，调整 MS 采集参数以获得分辨率良好的 MS 光谱。优化沿仪器和采样锥的压力梯度，以及萃取锥偏置阱和转移的潜在设置，如相关 JoVE 方案中所述。虽然这些参数与样品有关，但以下是用于获取从肽到蛋白质复合物的各种铁质量的 MS 谱图的条件。

大离子需要更高的碰撞能量和偏置电压。还建议增加分析大蛋白复合物的背压，以尽量减少复合物的活化。尝试以大约 10 伏特的步长逐渐降低样品锥体提取、锥体陷阱和偏置电压，而不改变峰的位置。

获得最佳质谱后，在分析蛋白质组件时应调整漂移时间或 IM 曲线。质量和迁移率测量的最佳条件通常不兼容。因此，在两者之间取得适当的平衡很重要。

总体而言，应优化铁淌度图，使峰分布在整个漂移时间范围内，并且峰分布平滑。接近 gian 分布 显著的峰不对称性可能与多种构象分离不良有关，可以调整 T 波速度、T 波高度和 IMS 气体流速以优化迁移率分离。增加 T 波速度会扩大漂移时间分布分布。

虽然增加的 T 波高度值会缩小它，但同样，从每分钟 10 毫升/分钟开始增加 IMS 气体流量，将漂移时间曲线向更高的值移动，从而优化铁迁移谱。通过固定三个变量中的两个并优化第三个变量，将 T 波速度设置为每秒 250 米，将气体流量设置为每分钟 24 毫升。然后作为起点，将高度设置为 3 伏特，并以 1 伏特的增量逐步增加。

当使用高偏置电压时，建议降低 IMS 气体压力，这样可以降低偏置电压。因此，复合物的激活和解离将减少。当条件未优化时，可能会出现翻转效应，在漂移时间频谱的第一部分和拖尾边缘观察到相同的峰值。

当离子不穿过 IAM 设备时，实际上它们的旅程可能需要比下一个铁包释放到移动单元所需的时间更长的时间。因此，在前一个数据包被传送到推杆区域之前，一束新的离子会从陷阱区域释放出来。要消除这种伪影，请增加 T 波高度并降低 T 波速度和 IMS 压力。

此外，还可以调整疏水阀释放时间。此外，验证传输 T 波高度是否设置为至少 5 伏特也很重要。也是为了防止离子泄漏到 IMS 池。

活动陷阱高度应保持在最高水平。转移 T 波的低速度和高振幅可能导致漂移时间分布曲线的涟漪。由于 pusha 频率和转移 T 波速度之间的部分同步，当离子的淌度分离无法通过转移区和强区保持时，就会发生这种伪影。

为了消除这种影响，应调整推杆时间或传递 T 波速度。由于 pusha 频率与质量范围有关，因此此伪影可能会再次出现。更改此参数时。

T 波高度的影响很小。尽管它的减少也可能有助于消除涟漪。一旦上述参数得到优化，就可以获取 IMMS 数据以实现高度分辨率。

女士。峰蛋白复合物通常在质谱仪内被激活，以促进残留水和缓冲液成分的剥离。但是，如果活化能增加到超过阈值，则可能会发生部分去折叠，形成多个中间状态，这不太可能对应于天然解状态结构。因此，漂移时间峰值可能会偏移和扩大，以反映未折叠结构的含氢种群。

与液相结构一致的漂移时间数据，必须在 IM 分离之前仔细控制用于加速离子的电压，因此，在监测对漂移时间光谱的影响的同时，逐步增加毛细管和锥孔电压。此外，对于高 MS 分辨率，最好增加传输电压而不是陷阱电压。首先定位 IM 设备，然后是传输区域和 TOF 分析仪。

由于 IM 测量后激活不会影响 IM，同时可以提高 MS 准确度以确保在保持复合物天然结构的条件下进行数据采集，因此在一系列实验和溶液条件下收集数据非常重要，而不是遵循一组优化的参数。因此，逐步增加陷阱碰撞电压，并以 10 伏的间隔采集数据，同时监测对铁迁移率的影响。最后，为了识别展开的确认并评估采集的数据，通过在 2 到 7 的 pH 范围内用乙酸滴定样品来手动诱导蛋白质复合物的解离，并记录数据，继续在 T 波 IMS 系统中分析数据，横截面积由漂移时间校准方法定义， 使用具有已知横截面值的 Cain 蛋白。

首先，制备每个 10 微摩尔的变性口径蛋白质溶液。用马细胞色素C马、心脏肌红蛋白和牛泛素在49、49 0.2体积比水甲醇乙酸中。接下来，在与目标蛋白质或蛋白质复合物完全相同的仪器条件下获取口径蛋白质的 IMMS 数据，保持所有电压和压力值相同，以保持 IM 分离设置。

获取数据后，提取每次充电的实验偏差时间值。Cain 蛋白的状态使用以下公式校正每个口径漂移时间 T 素数 D，其中 MOVZ 是观察到的离子的主电荷比，C 是增强的占空比 EDC 延迟系数。其值通常介于 1.4 和 1.6 之间，具体取决于工具。

EDC 值在系统中指示，一个采集设置，一个采集设置选项卡，校正每个口径横截面的铁充注状态和降低质量。其中 omega C 是校正后的横截面，omega 是文献横截面，Z 是铁电荷。状态 M 是 cain 离子的分子量，MG 是铁的分子量。

背景气体，通常是 T 素数 D 的氮气与 Omega C 的 thelan 的对比，所得曲线对应于以下方程。参数 X 和 A 可以通过将图拟合到线性关系来提取。斜率 X 对应于指数比例因子，A 表示拟合确定的常数。

计算拟合相关系数 R 的平方。R 平方的可接受值大于 0.95。较低的相关系数值可能是由于蛋白质的不完全展开、样品的老化。

用于不同口径蛋白质的不同实验条件、噪声光谱和数据处理不完整或计算错误。使用确定的指数因子 X 校正 ca 漂移时间，并通过重新分配 omega C 与 T 素数 D 来验证您的计算。与前面描述的步骤类似，预期高于 0.95 的值，校正测得的目标蛋白质或蛋白质复合物的漂移时间，并使用计算的指数因子 X 校准目标蛋白质或蛋白质复合物的漂移时间。对每个实验条件重复这些步骤。

在定义未知蛋白质或蛋白质复合物的横截面积时，我们建议每个实验至少重复三次，一旦确定了碰撞截面值，就确定了这些一式三份测量的标准偏差。采用建模方法来预测复合体的拓扑或排列。这是通过将实验碰撞截面值拟合到从生成的模型结构整体计算的计算机 Omega 值来完成的，该领域仍处于早期阶段，需要进一步发展以使该方法通用并适用于广泛的复合物。

此处显示了牛血红蛋白的四聚体形式的表面表示。氧转运蛋白血红蛋白复合物可以作为上述方法的一个例子。血红蛋白是一种四聚体蛋白复合物，由两个 α 和两个 β 亚基组成，分别呈蓝色和红色，形成 α β 二聚体的二聚体。

血红蛋白的 IMMS 谱如下所示。复合物的获得性 IM ms 谱图揭示了对应于完整复合物和次要电荷序列的主要电荷序列分布，该分布适合 α β 二聚体以及 α 和 β 单体亚基的质量。此处显示了不同形式血红蛋白的理论和测量 CCS。

使用二聚体和四聚体形式的几种电荷态检索的漂移时间值来计算 omega 值。这些与理论值进行了比较。鉴于四聚体复合物具有三种可能的结合可能性，环状二面体或链状填料。

通过计算从二聚体移动到四聚体时 omega 的增加，可以预测结构组织。以前的研究和我们自己的实验表明，测得的 ccss 与来自晶体结构数据的蛋白质表面积之间存在很强的相关性。这种相关性可用于计算不同填料形式的四聚体与二聚体相比的预期表面积增加。

这是通过考虑每个子基非球面对象来完成的。链状组装将使四聚体 CCS 增加约两倍，而 C 四或 D 二填料将分别增加约 1.5 和 1.67。血红蛋白的四聚体和 DME 形式的测量 CCS 值之间的计算比率为 1.57 正负 0.03。

这个数字说明天然结构不是线性组织的，而是以更紧凑的形式排列，要么是环状的，要么是二面体的四聚体。当对血红蛋白的分离晶体结构重复相同的计算时，四聚体与 DME 形式的表面积之比为 1.63，这符合 D 2 对称性。显然，这个几何模型被简化了，蛋白质亚基不仅仅是球形的。

然而，这种计算表明了 IMMS 在揭示具有未知高分辨率结构的复合物的堆积方面具有令人兴奋的潜力。我刚刚向您展示了如何测量蛋白质的漂移时间，而蛋白质复合物需要如何计算它们的碰撞截面值。在执行此过程时，使用与目标蛋白质或蛋白质复合物完全相同的条件获取口径蛋白质的 IMMS 数据非常重要。

此外，我们强烈建议至少重复这些实验的 3 次，并确定这些一式三份测量的标准偏差。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。