Name: T波离子迁移质谱蛋白复合物分析的基本实验程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: 学习使用离子迁移质谱分析蛋白质复合物的三维结构，通过测量漂移时间值确定碰撞截面积。该方法可揭示亚基组装方式和拓扑结构，为结构生物学研究提供关键信息。

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作者感谢Sharon课题组成员对本文的审阅以及为手稿撰写所做的贡献。我们感谢Morasha项目和Bikura项目、以色列科学基金会（资助编号：1823/07 和 378/08）、约瑟夫·科恩生物膜研究闵纳瓦中心、Chais家族新科学家研究员项目、亚伯拉罕与索尼娅·罗克林基金会、沃尔夫森家族慈善信托基金、海伦与米尔顿·A·基姆尔曼生物分子结构与组装中心、什洛莫与萨宾·贝兹温斯基遗产基金、Meil de Botton Aynsley以及英国Karen Siem提供的支持。

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未声明任何利益冲突。

本文所述方案可用于确定三维结构未知的蛋白质或蛋白质复合物的碰撞截面，旨在提供有关其整体形状、亚基排列和拓扑结构的信息。为此，在获得碰撞截面数值后，需将其转化为结构细节。该过程需要额外的实验工作以及计算分析，下文将对此进行简要讨论。
首先，建议分析具有已知结构的蛋白质或蛋白质复合物。这些测量可为方法提供有用的质量控制，并通过比较理论值与实测的 Ω 值，评估采集参数的准确性。理论横截面积可根据晶体结构坐标，使用 MOBCAL15,16 软件进行计算。MOBCAL 是一款基于 FORTRAN 的开源软件，允许用户根据需要编辑代码。运行此类计算时，需修改程序，以增加每个输入结构所执行的迭代计算次数，并使其能够接受包含大量原子的坐标文件1。
最近提出了一种利用离子迁移-质谱（IM-MS）策略来确定多组分复合物中亚基拓扑排列的方法4,6。该方法通过监测蛋白质复合物解离为较小组分的途径来实现。这种解离是通过精确调控溶液相条件实现的，从而产生一系列反映复合物“构建模块”的亚复合物。对完整复合物及其解离产物的碰撞截面（Ω值）进行同步测量，可获得结构约束参数，进而用于计算蛋白质复合物的拓扑模型。该方法的基本假设是所生成的亚复合物保持了类似天然的构象；事实上，最近的研究已证实，解离产物在溶液相和气相中均维持了其溶液结构，未发生显著的构象重排4,6。
将四级结构指派给气相蛋白质复合物离子的最后一步，是将碰撞截面值拟合到计算机生成的模型中。采用建模方法旨在探索亚基的不同可能拓扑排列，并计算其in silico的Ω值，再与实验值进行比较。目前仅使用少数几种计算方法，例如将亚基直径进行近似的球型粗粒化方法1,8。总体而言，该领域仍处于早期发展阶段，尚需进一步发展，以使该方法具有普适性，并适用于多种类型的复合物。

t波离子淌度-质谱分析：蛋白质复合物分析的基本实验流程

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

离子淌度（IM）是一种测量离子在弱电场作用下通过加压漂移管所需时间的方法。离子穿过漂移区的速度取决于其尺寸：较大的离子会与背景惰性气体（通常为N2）发生更多次碰撞，因此在IM装置中的移动速度比具有较小横截面积的离子更慢。通常情况下，离子在浓密气相中迁移所需的时间可依据其碰撞截面（Ω）实现分离。
最近，离子淌度（IM）谱法与质谱法联用，推出了采用行波（T-wave）技术的Synapt离子淌度质谱仪（IM-MS）。将质谱与离子淌度相结合，可增加一个维度的样品分离与鉴定能力，从而获得三维谱图（质荷比、强度和漂移时间）。该分离技术可减少谱图重叠，实现对质量或质荷比非常相近但漂移时间不同的异质复合物的分辨。此外，漂移时间的测量提供了重要的结构信息，因为碰撞截面（Ω）与离子的整体形状和拓扑结构相关。通过使用具有已知截面的校准蛋白质生成的校准曲线，可计算实测漂移时间值与Ω之间的相关性1。
离子迁移-质谱（IM-MS）方法的优势在于其能够在微摩尔浓度及接近生理条件下，确定蛋白质组装体的亚基排列方式和整体构型1。近年来多项针对单个蛋白质2,3以及非共价蛋白质复合物4-9的离子迁移研究已成功证明，蛋白质的四级结构在气相中得以保持，并凸显了该方法在研究几何结构未知的蛋白质组装体方面的潜力。本文中，我们详细描述了使用Synapt（四极杆-离子迁移-飞行时间）HDMS仪器（Waters有限公司；目前唯一 commercially available 的IM-MS仪器）进行蛋白质复合物IMS-MS分析的流程10。我们介绍了基本的参数优化步骤、碰撞截面的校准方法，以及数据处理与解析方法。本方案的最后一步讨论了理论Ω值的计算方法。总体而言，本方案并不试图涵盖IM-MS表征蛋白质组装体的所有方面；其目标是向该领域的新研究人员介绍该方法的实践操作要点。

离子淌度-质谱法是一种新兴的气相技术，可根据离子的碰撞截面和质量对其进行分离。该方法可提供蛋白质复合物整体拓扑结构和形状的三维信息。本文概述了仪器设置与优化、漂移时间校准以及数据分析的基本操作流程。

T波离子淌度-质谱分析：蛋白质复合物分析的基本实验流程

离子淌度（IM）是一种测量离子在弱电场作用下通过加压漂移管所需时间的方法。

以下实验的总体目标是确定蛋白质复合物的整体构型。通过获取蛋白质复合物离子的质谱离子淌度数据，并测量每个电荷态的漂移时间值来实现这一目标。第二步是验证实验条件，以确保对天然蛋白质结构进行淌度测量。接下来，将测得的漂移时间值与截面积相关联。结果可确定具有未知三维结构的蛋白质或蛋白质复合物的碰撞截面值。该信息为其整体形状、亚基排列和拓扑结构提供了线索。大家好，我是来自魏茨曼科学研究所生物化学系Mic实验室的Isaac Leski，这位是同样来自Mic实验室的Naam Kirschenbaum。今天我们将演示一种利用混合型质谱仪与离子淌度仪器测量蛋白质复合物碰撞截面的方法。在我们的实验室中，该方法用于研究蛋白质复合物的整体构象与亚基排列。那么我们开始吧。本实验主要关注蛋白质复合物的铁迁移性、质谱（IMM MS）分析。样品制备步骤、仪器校准以及质谱和串联质谱的优化程序，在相关的 JoVE 实验方案中有详细演示。通常情况下，本方案使用低微摩尔浓度的复合物，溶于乙酸铵等易挥发缓冲液中。由于每根纳米流毛细管需消耗一到两微升样品，建议至少配制10至20微升，以便优化质谱条件。开始本操作时，将行波（T-wave）离子淌度质谱（IMMS）设置为以下工作模式：迁移率-飞行时间（mobility tof）模式，该模式下三重波和压力将自动设定，以实现离子淌度和飞行时间的双重分离；选择正离子采集模式和V模式，设定离子在飞行管中的路径，并开启反射，同时在此处打开所有气体。离子迁移谱分离使用氮气，捕获和传输区域使用氩气。建议初始参数设置为：离子迁移谱设备的气体流速为 24 毫升/分钟，捕获区域的气体流速为 1.5 毫升/分钟。接下来，为未知蛋白质复合物设置母离子电荷比采集范围。首先使用较宽的质荷比范围，随后可将其调整至所需数值，并相应调整质谱模式。为实现大分子复合物的最大传输效率，采集的质荷比范围应设置为 1030 至 2000 m/z，质谱模式设为自动。否则，可根据所示图表设置质谱模式。检查射频（RF）设置，如有必要，根据所示调整为适用于大分子蛋白质复合物的参数。接着，上样，施加毛细管电压和较低的纳流压力。一旦开始喷雾，尝试将纳流压力降至最低值。此外，调整毛细管相对于锥孔的位置，并调节质谱采集参数，以获得分辨良好的质谱图。优化仪器内的压力梯度和采样锥孔，以及提取锥体偏压陷阱和传输的电位设置，具体参数详见相关的 JoVE 方案。尽管这些参数取决于样品，但以下列出了用于获取从肽到蛋白质复合物中不同铁质量质谱图的实验条件。大离子需要更高的碰撞能量和偏置电压。建议在分析大分子蛋白质复合物时增加背压，以尽量减少复合物的活化。在不改变峰位置的前提下，尝试以约10伏为步长逐步降低样品锥提取电压、锥体捕集电压和偏置电压。获得最佳质谱图后，在分析蛋白质复合物时应调整漂移时间或离子淌度（IM）谱图。质量和淌度测量的最佳条件通常难以同时满足，因此在二者之间取得适当平衡至关重要。总体而言，应优化铁离子迁移率图谱，使峰分布在整个漂移时间范围内，且峰形平滑。当接近高斯分布时，显著的峰不对称性可能与多种构象分离效果不佳有关，可通过调节T波速度、T波高度和IMS气体流速来优化迁移率分离效果。提高T波速度会拓宽漂移时间分布曲线。尽管增大T波高度值会使其变窄，但同样地，从最小10毫升/分钟开始增加IMS气体流速，会使漂移时间分布向更高值偏移，从而优化离子迁移谱。通过固定三个变量中的两个并优化第三个变量，将T波速度设为250米/秒，气体流速设为24毫升/分钟。然后以3伏为起始点，逐步以每次1伏的增幅提高电压。当使用高偏置电压时，建议降低离子迁移谱（IMS）气体压力，从而实现偏置电压的降低。这样可减少复杂的活化和解离过程。当条件未优化时，可能会出现卷边效应，表现为漂移时间谱前段和拖尾边缘出现相同的峰。当离子未能完全通过 IAM 装置时，其实际迁移时间可能超过下一个离子包被释放到迁移池所需的时间。结果，在前一个离子包尚未被输送至推斥区域之前，新的离子束已从捕获区域释放。为消除这一伪影，应提高 T 波高度，并降低 T 波速度和离子迁移谱（IMS）压力。此外，可以调整捕集释放时间。同时，必须验证传输T波高度已设置为至少五伏，以防止离子向IMS池发生泄漏。迁移率陷阱高度应保持在最高水平。传输T波的低速度和高振幅可能导致漂移时间分布曲线出现波纹状伪影。当推注频率与传输T波速度之间存在部分同步，导致离子在传输区和强场区的迁移率分离无法维持时，便会产生此伪影。为了消除这种效应，应调整推扫时间或传输T波速度。由于推扫频率与质量范围相关，当改变该参数时，此伪影可能会重新出现。T波高度影响较小，但降低T波也可能有助于消除振荡。一旦上述参数得到优化，即可采集IMMS数据，以获得高分辨率结果。MS.Peaks 蛋白质复合物通常在质谱仪内被活化，以促进去除残留的水和缓冲液成分。然而，若活化能量超过某一阈值，可能发生部分去折叠，形成多个中间态，这些中间态不太可能对应于溶液中的天然结构状态。因此，迁移时间峰可能会发生偏移并展宽，反映出由去折叠结构组成的异质种群。为了获得与溶液相结构一致的漂移时间数据，必须严格控制离子在进入离子淌度分离前的加速电压，因此需逐步提高毛细管电压和锥孔电压，同时监测其对漂移时间谱图的影响。此外，为实现高质谱分辨率，应优先提高传输电压而非捕获电压。离子淌度装置位于首位，随后是传输区域和飞行时间分析器。由于激活过程在离子淌度测量之后进行，因此对离子淌度（IM）无影响，而质谱（MS）的准确性可以提高，以确保数据采集在能够维持复合物天然结构的条件下进行。因此，重要的是应在一系列不同的实验条件和溶液条件下采集数据，而非局限于单一优化的参数组合。为此，应逐步提高捕集碰撞电压，并以10伏特为间隔采集数据，同时监测其对离子淌度分布曲线的影响。最后，为识别去折叠构象并手动评估所获得的数据，可通过在pH 2至7范围内滴定乙酸对样品进行滴定，诱导蛋白复合物解离，记录数据后，使用已知截面面积的Cain蛋白，通过漂移时间校准方法在T波离子淌度质谱（IMS）系统中分析数据，确定其截面面积。首先，分别制备浓度为10微摩尔的变性校准蛋白溶液。使用马细胞色素C、马心肌红蛋白和牛泛素，溶剂为水-甲醇-乙酸按49:49:0.2体积比混合的溶液。接着，在与目标蛋白或蛋白复合物完全相同的仪器条件下采集校准蛋白的离子淌度质谱（IMMS）数据，保持所有电压和压力值一致，以维持离子淌度分离参数不变。获取数据后，提取每个电荷的实验漂移时间值。利用以下公式对 Cain 蛋白质的每种校准漂移时间 T′D 进行校正，其中 MOVZ 是观测离子的主电荷比，C 为增强型占空比 EDC 延迟系数。该系数值通常在 1.4 至 1.6 之间，具体数值取决于仪器。EDC 值在系统的一次采集设置中的一次采集配置选项卡内标示，需针对铁的电荷态和还原质量对每个校准截面进行校正。其中，ω_C 为校正后的截面，ω 为文献截面，Z 为铁的电荷态，M 为阳离子的分子量，MG 为铁的分子量。背景气体通常为氮气，将T′对D作图，再对ωC作图。所得曲线符合以下方程。通过将该图拟合为线性关系，可提取参数X和A。斜率X对应指数比例因子，A代表由拟合确定的常数。计算拟合相关系数 R 平方。R 平方的可接受值应大于 0.95。较低的相关系数值可能由蛋白质未完全去折叠或样品老化所致。不同分子量的蛋白质所采用的实验条件差异、谱图噪声、数据处理不完整或计算误差。使用确定的指数因子 X 校正钙离子的漂移时间，并通过重新绘制 ωC 与 T′D 的关系图来验证计算结果。重新定义相关系数，其值应高于 0.95，与之前所述步骤类似。校正目标蛋白质或蛋白质复合物的实测漂移时间，并使用计算得到的指数因子 X 对其漂移时间进行校准。利用拟合确定的常数 A 计算目标蛋白质或蛋白质复合物的 ω 值，其中 ω 等于 aTD。对每种实验条件重复上述步骤。在确定未知蛋白质或蛋白质复合物的截面面积时，建议每项实验至少重复三次，并在获得碰撞截面值后，计算这些三次重复测量结果的标准偏差。通过建模方法可预测复合物的拓扑结构或空间排列方式，该过程通过将实验测得的碰撞截面值与通过生成的模型结构计算得到的理论Ω值进行拟合来实现。然而，该领域仍处于发展初期，尚需进一步发展，以使该方法具有普适性并适用于多种不同类型的复合物。此处展示了牛血红蛋白四聚体形式的表面结构。作为氧气运输蛋白的血红蛋白复合物可作为上述方法的一个示例。血红蛋白是一种由两个α亚基和两个β亚基组成的四聚体蛋白复合物，分别用蓝色和红色表示，形成αβ二聚体的二聚体结构。此处展示了血红蛋白的IMMS谱图。所获得的该复合物的IM ms谱图显示了一个主要的电荷系列分布，对应于完整的复合物，以及次要的电荷系列，符合αβ二聚体以及α和β单体亚基的质量。此处列出了血红蛋白不同形式的理论与实测CCS值。通过二聚体和四聚体不同电荷态的漂移时间值计算得到Ω值，并将其与理论值进行比较。由于四聚体复合物存在三种可能的结合方式，即环状、二面体或链状堆积。通过计算从二聚体转变为四聚体时omega值的增加，可以预测其结构排列方式。以往的研究及我们自身的实验均表明，实测的ccss值与基于晶体结构数据得出的蛋白质表面积之间存在显著相关性。该相关性可用于计算不同堆积形式下四聚体相较于二聚体预期的表面积增加量。这是通过将每个亚基视为非球形物体来实现的。链状组装会使四聚体的碰撞截面积（CCS）增加约两倍，而C4或D2堆积方式则分别导致约1.5和1.67的增加。血红蛋白四聚体形式与DME形式实测CCS值之间的计算比值为1.57 ± 0.03。该数值表明，天然结构并非线性排列，而是以更紧凑的形式存在，可能是环状或二面体四聚体。当对血红蛋白的解析晶体结构重复进行相同计算时，四聚体形式与DME形式的表面积之比为1.63，符合D2对称性。显然，这一几何模型是简化的，蛋白质亚基并不仅仅是球形的。然而，该计算展示了离子迁移质谱（IMMS）在揭示具有未知高分辨率结构的复合物排列方式方面所具有的巨大潜力。我刚刚向您展示了如何测量蛋白质及其复合物的漂移时间，并说明了如何计算它们的碰撞截面值。在进行此操作时，重要的是要使用与目标蛋白质或蛋白质复合物完全相同的实验条件来采集校准蛋白质的IMMS数据。此外，我们强烈建议至少重复三次这些实验，并计算三次重复测量的标准偏差。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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