Name: 用医用金属丝捕获循环肿瘤细胞的肿瘤细胞: 基于免疫荧光和 DNA 的3D 方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学习使用功能化医用金属丝结合免疫荧光与DNA-FISH技术捕获循环肿瘤细胞的方法。该技术可同时检测非小细胞肺癌CTCs的表型标志物与基因改变，为肿瘤诊断和治疗靶点研究提供重要工具。

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1. 二维盖玻片上的免疫-DNA FISH
<ol>
	<li>盖玻片准备与贴壁细胞接种 
	注意：以下所有步骤均需在层流罩内无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>将盖玻片浸入100%乙醇中以进行消毒。 
		注意：我们使用12 mm × 12 mm带硅胶支撑的方形盖玻片（所有试剂详见材料表）。</li>
		<li>将盖玻片放入培养皿（直径100 mm）中，用强制气流干燥5分钟。</li>
		<li>用15 mL无菌1×杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿。</li>
		<li>用10 mL完全培养基清洗培养皿（见表1）。</li>
		<li>通过轻轻将细胞悬液滴加至培养皿中接种贴壁细胞（约1,650,000个细胞/10 mL培养基，通过FACS分析计数），以获得均匀的细胞铺板（约30,000个细胞/cm2）。 
		注意：为达到约70%融合度，贴壁细胞应在盖玻片上培养至少48小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与通透处理 
	警告：丙酮为易燃且具刺激性的挥发性物质。仅可使用耐丙酮的塑料或玻璃容器（不可使用PVC或PVDF）。 
	注意：这些步骤应在化学通风橱中进行。
	<ol>
		<li>使用一次性移液管吸除培养基。</li>
		<li>用1× PBS清洗培养皿。</li>
		<li>使用镊子将盖玻片浸入盛有5 mL 1× PBS的玻璃烧杯中进行清洗。</li>
		<li>将盖玻片在吸水纸上干燥。</li>
		<li>将盖玻片浸入100%丙酮溶液中，在室温（RT）下固定10分钟。</li>
		<li>用镊子取出盖玻片，用强制气流干燥5分钟。 
		注意：本步骤可暂停。盖玻片应于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光实验 第1天 
	注意：此阶段需过夜（O/N）孵育（约16小时）。
	<ol>
		<li>用1× PBS清洗盖玻片两次。</li>
		<li>在盖玻片上滴加100 µL抗体稀释缓冲液（详见表1），于室温孵育30分钟。 
		注意：溶液用量应根据盖玻片表面积调整，以完全覆盖盖玻片并避免溢出风险。</li>
		<li>配制抗体混合液（表1），按照厂家说明书推荐，使用单克隆一抗（与荧光染料偶联）与抗体稀释缓冲液按1:20比例稀释。 
		注意：强烈建议使用与耐热荧光染料偶联的单克隆抗体。若使用非耐热荧光染料，本方案中DNA-FISH步骤的高温可能破坏荧光染料并导致荧光信号淬灭。本方案中选用EpCAM-FITC抗体（1:20稀释），在所用温度下未出现明显问题。</li>
		<li>用1× PBS将盖玻片清洗两次。</li>
		<li>将盖玻片细胞面向上置于湿盒中，并在盖玻片上滴加100 µL抗体混合液。 
		注意：溶液用量应根据盖玻片表面积调整，以完全覆盖盖玻片并降低溢出风险。</li>
		<li>于4 °C避光过夜（约16小时）孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光实验 第2天
	<ol>
		<li>通过用1× PBS清洗盖玻片两次以终止抗体孵育。 
		注意：将盖玻片浸入100 µL 1× PBS中，于4 °C避光、恒湿环境中保存，直至进行FISH检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维DNA-FISH 第2天 
	警告：需特别注意仪器和湿盒的高温。
	<ol>
		<li>提前约3小时设置杂交炉和干热烘箱。将杂交炉温度设为75 °C，干热烘箱设为37 °C，并将0.4× SSC溶液（pH = 7.0 ± 0.1）（SSC配方见表1）冷却至4 °C。 
		注意：FISH缓冲液的pH值至关重要：pH = 7.0 ± 0.1。</li>
		<li>用冰冻的0.4× SSC溶液清洗盖玻片三次。</li>
		<li>在化学通风橱中避光干燥10分钟。</li>
		<li>涡旋震荡探针管10秒，并快速离心，使管壁上的探针液滴沉至管底。</li>
		<li>将盖玻片细胞面向下置于载玻片上5 µL FISH探针液滴上，并用橡胶胶水密封盖玻片所有边缘。 
		警告：接下来两个步骤涉及高温，请佩戴防护手套。</li>
		<li>将载玻片放入杂交炉内的避光湿盒中，在75 °C下孵育8分钟，以完成DNA变性。</li>
		<li>将湿盒转移至37 °C干热烘箱中过夜（O/N）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维DNA-FISH 第3天
	<ol>
		<li>将水浴锅温度设为72 °C，并将盛有0.4× SSC缓冲液的染色缸放入其中（表1）。30分钟后，检查0.4× SSC缓冲液温度，应为72 ± 1 °C。</li>
		<li>准备两个玻璃烧杯：一个装有2× SSC + 0.05% Tween缓冲液（pH = 7.0 ± 0.1）（表1），另一个装有蒸馏水。</li>
		<li>从烘箱中取出湿盒，小心去除载玻片上的橡胶胶水，并用镊子取下盖玻片。</li>
		<li>将盖玻片在72 °C的0.4× SSC溶液中浸洗2分钟。</li>
		<li>将盖玻片在2× SSC + 0.05% Tween缓冲液中浸洗30秒。</li>
		<li>用蒸馏水冲洗盖玻片。</li>
		<li>在化学通风橱中避光干燥10分钟。</li>
		<li>将盖玻片用含1.5 µg/mL 4´,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的液体封片剂封片，以对总DNA进行复染。将盖玻片细胞面向下置于载玻片上5 µL封片剂液滴上，用镊子轻压盖玻片以排出气泡，并用指甲油密封。 
		注意：封片剂用量应根据盖玻片大小进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维显微镜观察与分析 
	注意：图像可使用不同显微镜系统采集。我们使用配备标准商用图像采集软件的常规荧光显微镜（材料表）。
	<ol>
		<li>使用12位数字相机，配合20×/0.50 NA和40×/0.65 NA物镜，以及适用于红色（激发：599 nm，发射：588 nm）、绿色（激发：509 nm，发射：524 nm）和蓝色（激发：367 nm，发射：452 nm）探针的滤光片采集图像。</li>
		<li>使用合适的软件工具进行图像分析。 
		注意：为评估免疫荧光染色及ALK探针定位，我们使用ImageJ软件。载玻片可在避光条件下于-20 °C保存最多3周。如需长期保存，建议使用专用于长期保存的封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 导线上的免疫- DNA FISH
<ol>
	<li>细胞系加标至导线（三维支持） 
	注意：初步准备需根据EpCAM阳性准确选择贴壁细胞系。导线经抗EpCAM抗体功能化处理，因此仅EpCAM阳性细胞会被标记。 
	注意：请勿触碰导线的功能化部分，以免造成损伤。 
	注意：所有步骤均应在超净工作台内无菌条件下进行。
	<ol>
		<li>使用4 mL完全培养基将T75培养瓶（80%融合度）中的全部内容物重悬于5 mL离心管中；单次加标建议使用约2,000,000个细胞，以最大化细胞在导线上的黏附效率。</li>
		<li>从玻璃包装中取出导线。</li>
		<li>将导线的功能化金质部分浸入离心管中，确保导线塞与离心管紧密贴合，不漏水。用实验室封口膜密封。 
		注意：建议使用5 mL离心管，以确保导线塞与离心管正确匹配。</li>
		<li>在室温下使用试管旋转仪孵育30分钟（0–120°角度）。</li>
		<li>使用3个不同的洁净离心管，用1× PBS溶液将导线冲洗三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定与通透处理 
	警告：丙酮为易燃物质，可能刺激呼吸道。仅可使用耐丙酮的塑料或玻璃容器（不可使用PVC或PVDF）。 
	注意：这些步骤应在化学通风橱内进行。
	<ol>
		<li>将导线在空气中干燥。</li>
		<li>将导线浸入100%丙酮溶液中，在室温下固定10分钟。使用5 mL离心管。 
		注意：导线塞不得接触固定液。</li>
		<li>在室温下空气中干燥5分钟。 
		注意：本步骤可暂停。导线必须在-20 °C下保存。长期储存时，请将导线塞置于功能化端附近，小心将导线插入储存用玻璃管中，注意避免损伤功能化端。盖紧储存管，于-20 °C（垂直或水平）保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光第1天 
	注意：此阶段需过夜孵育（约16小时）。
	<ol>
		<li>使用5 mL离心管，用1× PBS溶液洗涤两次。</li>
		<li>将导线置于抗体稀释缓冲液中，在室温下孵育30分钟，使用5 mL离心管。</li>
		<li>根据说明书，在抗体稀释缓冲液中配制150 µL抗体混合液，单克隆一抗（偶联荧光染料）按指定比例稀释。例如，EpCAM-FITC抗体使用1:20稀释比例。</li>
		<li>使用P200枪头进行孵育操作：将导线从导线塞中取出，轻轻将导线从枪头较大孔端插入。先插入非功能化端，缓慢拉动导线使其通过较小孔，直至金质部分刚好超出较大孔端。</li>
		<li>轻轻将150 µL抗体混合液（例如1:20稀释的抗EpCAM-FITC抗体）滴加至枪头内。为避免气泡产生，轻轻旋转导线，直至功能化部分完全浸没。</li>
		<li>密封枪头开口。可用实验室封口膜包裹开口处以加强密封。</li>
		<li>在4 °C黑暗环境中垂直孵育过夜（约16小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光第2天
	<ol>
		<li>通过用1× PBS溶液洗涤两次，终止抗体孵育。</li>
		<li>将导线重新插入其导线塞中。 
		注意：储存于5 mL离心管内的1× PBS溶液中，4 °C保存，直至进行FISH检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维DNA-FISH第2天 
	警告：操作过程中需特别注意仪器和湿盒的高温。
	<ol>
		<li>提前约3小时设置杂交炉和干热烘箱。将杂交炉温度设为75 °C，干热烘箱设为37 °C，并将0.4× SSC溶液（pH = 7.0 ± 0.1）冷却至4 °C。 
		注意：FISH缓冲液的pH值至关重要，必须维持在7.0 ± 0.1。</li>
		<li>用预冷的0.4× SSC溶液洗涤导线三次。 
		注意：后续操作中需将导线避光保存，以防荧光染料光漂白。</li>
		<li>在通风橱内避光干燥10分钟。</li>
		<li>涡旋并短暂离心探针5秒。</li>
		<li>向玻璃微量管中加入10 µL探针。用实验室封口膜覆盖。</li>
		<li>按如下方式离心微量管：将微量管包裹于干燥吸水纸上，放入50 mL离心管中，短暂离心。</li>
		<li>小心将干燥后的导线放入微量管中，并插入导线塞。用橡胶胶水密封。 
		警告：接下来两个步骤涉及高温操作，请佩戴防护手套。</li>
		<li>将导线放入杂交炉内的避光湿盒中，在75 °C下孵育8分钟，以实现完全DNA变性。</li>
		<li>将湿盒转移至37 °C干热烘箱中过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维DNA-FISH第3天
	<ol>
		<li>将装有0.4× SSC溶液的载片染色缸放入水浴锅中，并设定温度为72 °C。</li>
		<li>监测0.4× SSC溶液温度，直至达到72 ± 1 °C。</li>
		<li>准备两个玻璃烧杯，一个装有2× SSC + 0.05% Tween（pH = 7.0 ± 0.1）溶液，另一个装有去离子水。</li>
		<li>从干热烘箱中取出湿盒，用镊子小心去除导线塞上的橡胶胶水，取出导线。 
		注意：小心将导线的非涂层端穿过IN-Stopper，注意避免损伤功能化端。</li>
		<li>将导线在72 °C的0.4× SSC溶液中浸渍2分钟。</li>
		<li>在室温下用2× SSC + 0.05% Tween溶液洗涤导线30秒。</li>
		<li>在室温下用去离子水洗涤导线。</li>
		<li>在通风橱内避光干燥10分钟。</li>
		<li>在2 mL 1× PBS中配制1.43 µM的DAPI储备液。</li>
		<li>将导线的功能化端浸入2 mL离心管中的DAPI溶液，在室温避光条件下孵育1小时。</li>
		<li>用1× PBS冲洗导线两次，并在空气中干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维显微镜观察与分析
	<ol>
		<li>将导线放入导线支架中。小心将功能化端穿过专用支架的入口，直至尖端与耦合点对齐。注意避免损伤功能化端（图1a）。</li>
		<li>将专用支架置于显微镜载物台上。使用20×物镜调节显微镜焦距。先粗略聚焦于专用支架，再精细调节至DAPI通道中呈现明亮信号的细胞。</li>
		<li>仅对位于镜头中央的细胞进行聚焦。 
		注意：图像可使用不同显微镜系统采集。本实验中采用配备标准商用图像采集软件的传统荧光显微镜。</li>
		<li>使用12位数字相机，配合20×/0.50 NA和40×/0.65 NA物镜，以及适用于红色（激发：599 nm，发射：588 nm）、绿色（激发：509 nm，发射：524 nm）和蓝色（激发：367 nm，发射：452 nm）探针的滤光片采集图像。 
		注意：图像可使用多种工具和软件进行可视化分析。本实验使用ImageJ评估免疫荧光染色及ALK探针定位。 
		注意：本步骤可暂停。导线必须在-20 °C下保存。长期储存时，请将导线塞置于功能化端附近，小心将导线插入储存用玻璃管中，注意避免损伤功能化端。盖紧储存管，于-20 °C（垂直或水平）保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int. J. Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
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<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci. Rep. 7 (February), 43424(2017).</li>
<li>Masuda, T., Hayashi, N., Iguchi, T., Ito, S., Eguchi, H., Mimori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+biological+significance+of+circulating+tumor+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical and biological significance of circulating tumor cells in cancer.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 408-417 (2016).</li>
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<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> N. Engl. J. Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Costa, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Experience+With+Crizotinib+in+Patients+With+Advanced+ALK+-Rearranged+Non-Small-Cell+Lung+Cancer+and+Brain+Metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical Experience With Crizotinib in Patients With Advanced ALK -Rearranged Non-Small-Cell Lung Cancer and Brain Metastases.</a> J. Clin. Oncol. 33 (17), 1881-1888 (2015).</li>
<li>Fischer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+leukapheresis+enables+reliable+detection+of+circulating+tumor+cells+of+nonmetastatic+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Diagnostic leukapheresis enables reliable detection of circulating tumor cells of nonmetastatic cancer patients.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (41), 16580-16585 (2013).</li>
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<li>Allard, W. J., Terstappen, L. W. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR+20th+Anniversary+Commentary%3A+Paving+the+Way+for+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 21 (13), 2883-2885 (2015).</li>
<li>Theil, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+new+CellCollector+to+isolate+circulating+tumor+cells+from+the+blood+of+patients+with+different+stages+of+prostate+cancer+and+clinical+outcomes+-+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of a new CellCollector to isolate circulating tumor cells from the blood of patients with different stages of prostate cancer and clinical outcomes - A proof-of-concept study.</a> PLoS One. 11 (8), 1-14 (2016).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin. Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文首次提出了一种将免疫荧光染色与DNA FISH相结合的方法，用于功能化导丝样本的分析，该方法被称为Immuno-DNA FISH。该技术的开发旨在基于表型参数（如EpCAM阳性，事件1）对3D导丝上潜在的循环肿瘤细胞（CTC）进行同步识别，同时有助于检测分子改变（如ALK基因状态，事件2）。两个事件的同步识别可实现其共定位的检测。因此，该方法可被定制用于识别和表征从癌症患者血液中捕获的CTC。血液成分和白细胞对染色过程的潜在影响通常不会干扰实验操作。特别是，文献报道的数据表明，血液成分和白细胞不会影响附着在导丝上的细胞的免疫荧光染色，而该步骤是识别真实CTC的关键1,15。
免疫-DNA FISH 的荧光亮度略低于传统的免疫表型分析实验，这是由于 FISH 实验需要高温处理所致。然而，免疫荧光染色信号仍然可观。例如，在 EpCAM 低表达的细胞系 NCIH1975 中仍可检测到微弱信号。FISH 实验所需的高温是选择合适荧光染料标记抗体时的主要限制因素。在本实验方案中，抗体必须连接耐热荧光染料，以耐受 DNA 变性温度。例如，藻红蛋白（phycoerythrin）是一种对热敏感的荧光染料，由于高温会导致其降解，因此不推荐在此类实验中使用。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）是一个理想的选择，也是 FISH 探针中常用的荧光染料。在标准二维载体上，免疫-DNA FISH 的自发荧光信号非常微弱。在金属丝载体上，聚合物层可能会引起轻微的自发荧光信号，尤其是在红色通道中。与二维背景不同，金属丝上可观察到非特异性背景信号，但该信号不会显著影响细胞核的识别或细胞的表征。
由于光学显微镜在观察圆柱形三维结构表面时存在局限性，因此对导线进行显微镜观察比在二维平面上更加疲劳。然而，通过旋转导线支架并获取主要沿导线中轴线分布的图像，可以克服这一困难。导线支架可实现导线360°旋转。一旦对准细胞核焦平面，切换荧光通道并不一定能够保持目标区域的聚焦状态，因此，维持对细胞内目标区域的聚焦至关重要。
该技术可针对不同类型的三维支架上的细胞进行检测和表征。也可使用不同的抗体和FISH探针。若选择使用不同的抗体，需重点考虑荧光染料的热稳定性以及靶抗原在细胞膜上的表达水平。细胞内胞质抗原也可进行染色。使用不同FISH探针时，应仔细查阅产品说明书中的变性步骤参数，并据此相应地制备FISH检测所需的细胞样本。

循环肿瘤细胞代表了癌细胞扩散的关键步骤1它们在患者外周血中的存在与（转移性）复发及疾病进展相关。2,3从癌症患者血液中分离和表征循环肿瘤细胞是一种非侵入性液体活检。近年来，越来越多的研究表明，利用此类分析监测肿瘤在不同治疗下的进展和治疗反应，可提供重要的临床信息4,5当手术不可行或无法获得原发性肿瘤组织时，液体活检更具应用价值。 即，适用于不可活检的病灶。因此，该方法在特定癌症情况下具有应用前景，例如转移性非小细胞肺癌（NSCLC），其中循环肿瘤细胞（CTCs）的存在已被证实具有负面预后意义6非小细胞肺癌是一种尤其适用于靶向治疗策略的肿瘤7,8,9 旨在作用于已知参与疾病生长、进展和扩散的特定分子（分子靶点）。因此，有必要在疾病进展过程中检测这些特异性靶点。循环肿瘤细胞（CTC）检测是一种极具前景的诊断方法，可在无需原发性或转移性组织的情况下实现对药物靶点的检测与监测。例如，在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中检测到ALK基因重排，提示对克唑替尼（crizotinib）这一特异性靶向治疗药物具有敏感性。10然而，目前ALK基因重排的检测仅能通过细针穿刺或小组织活检样本进行；因此，若缺乏肿瘤组织，便无法开展ALK分析。循环肿瘤细胞（CTCs）可作为基于肿瘤组织检测的潜在替代方案，是一种极具前景的伴随诊断方法。
尽管循环肿瘤细胞（CTCs）可能具有重要意义，但由于其极为稀少（每毫升外周血中仅含1-10个细胞11），目前在科研领域仍存在广泛争议。现有的液体活检方法仅使用有限体积的血液（即，1-30 mL）12,13，但这导致检测CTCs的灵敏度不理想。因此，有必要开展研究，探索新方法并开发新设备，以实现对更大体积外周血进行靶向CTCs的液体活检。
一种替代装置，即功能化医用导丝（参见 材料表），已开发出来以克服血液采样的局限性，从而获得对循环肿瘤细胞（CTCs）更具代表性的分析。这种功能化导丝是一种获得CE认证的医疗器械，可直接从癌症患者的血液中捕获CTCs。1由一根16厘米长的不锈钢丝组成（图1a）带有一个2 cm长的功能化尖端，其表面涂覆有一层0.2 µm厚的金层，金层上再覆盖一层1至5 µm厚的聚羧酸盐水凝胶层，该水凝胶层通过共价键偶联了针对EpCAM的抗体，EpCAM是循环肿瘤细胞（CTC）表面表达最广泛的抗原之一14将功能化处理的导丝尖端插入患者手臂的静脉中，并保持至少30分钟。该方法可实现循环肿瘤细胞（CTCs）的分离。 体内 直接在全血中进行，并筛查约1.5–3.0 L的血液（约为其他方法所用体积的300倍）1.
Pantel 等证明了该方法在直接从肺癌患者手臂静脉中分离循环肿瘤细胞（CTC）方面的有效性15。他们采用导丝免疫荧光染色法，使用针对EpCAM和广谱细胞角蛋白的传统抗体以及用于白细胞检测的CD45抗体来识别CTC。通过光学荧光显微镜观察导丝15。作者证明该装置能够成功分离CTC，但未对任何与治疗相关的靶点（如ALK基因重排）进行研究。
所提出的方法旨在基于表型参数鉴定非小细胞肺癌细胞系中可能的循环肿瘤细胞（CTCs）， 例如，EpCAM 阳性以及分子生物标志物的存在，例如 ALK 状态（图1b）。该为期三天的实验流程结合了功能化金属丝与免疫荧光染色以及DNA荧光-原位-杂交（DNA FISH），称为免疫-DNA-FISH。由于循环肿瘤细胞（CTCs）极为稀少，该方案的优势在于可在同一根导线上同时对CTCs的免疫表型特征和DNA重排进行表征。

<table><tbody><tr><td>乙醇</td><td>Carlo Erba</td><td># 414605</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>BIO RAD</td><td># 1706531</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）&amp;nbsp;</td><td>Medicago</td><td># 09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 534064-500ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td># A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 去垢剂</td><td>BIO RAD</td><td># 1610407</td><td></td></tr><tr><td>橡胶胶水</td><td>Royal Talens</td><td># 95306500</td><td></td></tr><tr><td>Vysis 20X SSC（66g）</td><td>Abbott Molecular Inc.&amp;nbsp;</td><td># 30-804850</td><td>粉末，按推荐方法用蒸馏 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 溶解</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td># 31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Gibco</td><td># 10270-098</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td># 25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>MilliPore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XT ALK BA</td><td>MetaSystems Probes</td><td># D-6001-100-OG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI，FluoroPure 级</td><td>Invitrogen</td><td># D21490</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Life Technologies</td><td># S36973</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM-FITC（克隆：HEA-125）</td><td>Mitenyi</td><td># 130-080-301</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 M-Tube18</td><td>Gilupi Nanomedizin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor CANCER01 EpCAM</td><td>Gilupi Nanomedizin</td><td></td><td>功能化导线</td></tr><tr><td>STAR FROST 显微镜载玻片</td><td>Knittel GL&amp;Auml;SER</td><td>VS1117# 076FKB</td><td></td></tr><tr><td>SecureSlip 硅胶支撑盖玻片</td><td>GRACE BIO-LABS</td><td># 104112</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS 荧光显微镜 Axioskop&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 64 位软件</td><td>Nikon</td><td>BR 4.11.00</td><td></td></tr><tr><td>Nikon DS-QiMc 12 位数字相机</td><td>Nikon</td><td>DS-QiMc</td><td></td></tr></tbody></table>

利用用于捕获循环肿瘤细胞的医用导丝对肿瘤细胞进行表征：一种基于免疫荧光和dna fish的三维方法

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

循环肿瘤细胞（CTCs）与转移性癌症患者的不良生存预后相关。对这些细胞的鉴定、表型分析和基因分型有助于深入理解肿瘤异质性，从而促进个体化治疗患者的筛选。然而，由于CTCs极为稀少，上述研究受到限制。本文介绍一种创新方法，可采集患者大量血液样本，并获取有关CTCs存在性、表型特征及基因易位的信息。该方法结合了免疫荧光染色与DNA荧光-原位-杂交（DNA FISH），基于一种功能化的医用导丝。该导丝是一种创新装置，可实现 体内 从大量外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）。通过30分钟的导丝操作，筛查的血液体积约为1.5–3 L。为验证该方法的可行性，采用免疫-DNA FISH技术对功能化导丝捕获的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系进行上皮细胞黏附分子（EpCAM）表达及ALK基因染色体易位的检测。本研究的主要挑战在于如何在三维结构——功能化导丝上进行实验，并利用常规荧光显微镜在该载体上确定免疫表型和FISH信号。实验结果表明，捕获CTCs并分析其表型特征和染色体重排，可能代表一种新型伴随诊断方法，为提升个体化癌症治疗提供创新策略。

利用上述方法，可在经功能化导线富集的循环肿瘤细胞（CTC）或其他类似细胞上进行免疫-DNA FISH 检测。在建立本实验方案之前，需先在标准二维载体上验证两种技术（免疫荧光与FISH）的兼容性。为此选择了两种表达EpCAM的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系（EpCAM是细胞黏附于连接抗EpCAM抗体的导线所必需的）。这两个细胞系具有不同的ALK状态，有助于测试不同的起始条件。其中，NCI-H1975细胞系具有野生型（WT）ALK基因，而NCI-H3122细胞系则具有ALK基因易位。
用于FISH检测的ALK基因断裂分离探针系统。该系统包含两个探针，一个（橙色）与位于2p23上ALK基因近端区域杂交，另一个（绿色）与ALK基因远端区域杂交。在二维载体上，免疫-DNA FISH为抗体和探针均提供了清晰明确的信号。图2）。特别是，两种细胞系均显示出明确的EpCAM膜定位。此外，探针信号明亮且清晰：NCI-H1975细胞中橙色与绿色探针信号重叠，证实ALK基因为野生型状态（图 2a，b)。相反，NCI-H3122 细胞显示出重叠的信号和单独的绿色点，反映出 ALK 基因的缺失（图2c, d）。当在功能化三维支架导线上进行免疫-DNA FISH检测时，抗体和探针信号通常较二维支架上的信号更不清晰。EpCAM染色可见。ALK探针信号虽不够清晰，但仍反映了预期的ALK状态（图3）。结果显示，免疫荧光染色未对DNA FISH信号产生干扰，探针与其靶标特异性结合。NCI-H3122细胞系显示异常的ALK基因状态（图3b），与具有野生型 ALK 基因的 NCI-H1975 细胞系相反（图3a).
<img alt="平衡图；功能化金属丝尖端装置，基因表达结果；光谱装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：功能化金属丝、ALK断裂探针的示意图、ALK重排预期模式示意图以及专用支架。（a）红色框标出了金属丝的三个主要部分：功能化尖端、金属丝止位器和非功能化尖端。功能化尖端是金属丝最精细的部分，在操作过程中不得触碰，以避免细胞脱落或损伤。（b）绿色和红色探针分别结合于ALK基因位点上游和下游的序列（左侧）。右侧展示了典型的ALK排列模式。正常细胞中显示红色和绿色信号共定位；绿色与红色信号分离表明ALK基因染色体断裂（ALK基因易位）并出现一个绿色-橙色共定位信号（异常细胞-1）；一个红色信号和两个绿色信号提示一个红色信号丢失，提示存在染色体易位和缺失（异常细胞-2）。（c）金属丝支架；红色框标出在显微镜分析过程中操作金属丝时需小心的区域。通过旋转转轴，可对金属丝进行360°全方位观察。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像，细胞核中的蛋白质定位，比例尺分别为 100 μm 和 50 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：在二维载体（盖玻片）上进行的免疫-DNA FISH 检测。 （a，b）EpCAM 弱阳性的 NCI-H1975 细胞。EpCAM FITC 信号清晰可见。ALK 断裂探针的橙色和绿色信号重叠，证实 NCI-H1975 细胞系中 ALK 基因为野生型。由于该细胞系存在非整倍性，部分细胞显示出两对以上的信号。（c，d）在高表达 EpCAM 的 NCI-H3122 细胞系中，免疫荧光信号较强，且在细胞间连接处更为明显。FISH 分析证实了 ALK 基因的缺失，这是该细胞系的典型特征。红色箭头指示单独的绿色探针（无对应的橙色探针），反映 ALK 基因缺失。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较细胞结构的荧光显微镜图像，标尺为100 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56936/56936fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：利用功能化金属丝作为三维支撑的免疫-DNA FISH检测。（a）金属丝上NCI-H1975细胞的代表性图像。尽管细胞在金属丝上的三维形态使得难以获取完全聚焦的图像，但所有细胞中的EpCAM信号均清晰可见。（b）金属丝上NCI-H3122细胞的代表性图像。ALK探针显示基因缺失（红色箭头），与此前在二维支撑材料上观察到的结果一致。可见的背景信号很可能源于聚合物层的存在，但并未显著影响细胞识别或荧光分析。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56936/56936fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>缓冲液</td>
			<td>组成</td>
			<td>注意</td>
			<td>库存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞完全培养基</td>
			<td>RPMI 1640 + 2 mM 谷氨酰胺 + 5–10% 胎牛血清（FBS）</td>
			<td></td>
			<td>RPMI: 4 °C；谷氨酰胺，FBS：阴性20 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抗体稀释缓冲液</td>
			<td>1% BSA，0.3% Triton X-100 溶于 1x PBS 中 </td>
			<td></td>
			<td>室温。用封口膜密封。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC 溶液</td>
			<td>3 M 氯化钠，300 mM 柠檬酸三钠溶于 ddH₂O20 </td>
			<td>过滤溶液，并用 HCl 调节 pH 至 7.0 ± 0.1</td>
			<td>室温。用封口膜密封。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4x SSC 溶液</td>
			<td>将20倍浓度的SSC贮存液用蒸馏水稀释2O </td>
			<td>过滤溶液，并用 HCl 调节 pH 至 7.0 ± 0.1</td>
			<td>室温。用封口膜密封。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SSC + 0.05% Tween 20 溶液</td>
			<td>将20倍浓度的SSC贮存液用蒸馏水稀释2O + 0.05% Tween 20</td>
			<td>过滤溶液，并用 HCl 调节 pH 至 7.0 ± 0.1</td>
			<td>室温。用封口膜密封。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 溶液 30 nM</td>
			<td>稀释原液 1.43 µM 在1x PBS中</td>
			<td></td>
			<td>-20 °C 在避光条件下，可直接使用分装液</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：溶液配方。

我们提出一种表征肿瘤细胞的新方法。将免疫荧光与DNA荧光相结合原位-杂交以评估由功能化医用导丝捕获的细胞 体内 直接从患者血液中富集循环肿瘤细胞。

利用用于捕获循环肿瘤细胞的医用导丝对肿瘤细胞进行表征：一种基于免疫荧光和DNA FISH的三维方法

循环肿瘤细胞（CTCs）与转移性癌症患者的生存率较差相关。对这些细胞的鉴定、表型分析和基因分型可能有助于……

本实验方案的总体目标是在三维功能化金属丝上结合免疫荧光染色与DNA荧光原位杂交技术，并利用常规的宽场荧光显微镜在载体上识别免疫表型及FISH信号。该方法有助于解答分泌性肿瘤细胞表征领域中的关键问题，例如识别循环中的非小细胞肺癌细胞中与治疗相关的靶点。本方案的主要优势在于能够同时鉴定表型参数（如EpCAM阳性）和胞核/胞质的遗传改变（如ARC基因状态），从而检测潜在的循环肿瘤细胞（CTCs）。尽管该方法最初是为提供原位胰岛素瘤循环肿瘤细胞（CTC）特征而专门设计的，但也可应用于其他癌症的研究，如乳腺癌。我们在处理导丝用于直接免疫表型分析和CTC检测时开发了此方案。为了获得更全面的数据，我们将免疫表型分析方案与DNA荧光原位杂交（FISH）方案相结合。操作该金属丝并不容易，主要是因为功能化的尖端较为脆弱。通过视觉演示，读者可准确重现操作步骤。开始实验时，用四毫升完全培养基将一个处于80%融合度的T75培养瓶中的全部内容物重悬于一个五毫升小瓶中。接下来，将导线从其玻璃包装中取出。将导线上经过功能化的金质部分浸入小瓶中，确保导线塞子与5毫升小瓶之间密封严实。用实验室封口膜密封导线。然后，将金属丝置于室温下，在试管旋转仪中孵育30分钟。旋转结束后，使用三个不同的洁净小瓶，用一倍浓度的PBS溶液将金属丝清洗三次，并等待金属丝干燥。在通风橱中将金属丝空气干燥10分钟后，将金属丝浸入5毫升试管中的100%丙酮溶液中，于室温下固定细胞10分钟。确保功能化探针上无任何丙酮残留。在室温下将导线晾干五分钟。接着，在一个5 mL离心管中，用一倍浓度的PBS缓冲液清洗导线两次。将金属丝孵育在抗体稀释缓冲液中。根据说明书中的要求，用荧光染料标记的单克隆一抗和抗体稀释缓冲液配制150微升的抗体混合液。然后，使用P200枪头从金属丝塞中取出金属丝，并轻轻将金属丝穿过枪头较大的孔。先将未修饰的一端插入，并缓慢将导线穿过小孔，直至金质部分刚好穿过大孔。轻轻加入150 µL抗体混合液至尖端。为避免产生气泡，轻柔旋转导线，直至修饰端完全浸入。封闭尖端的孔洞，并用实验室薄膜包裹孔洞处。将导线在4°C黑暗条件下垂直孵育过夜。第二天，用一倍浓度的PBS洗涤导线两次，以封闭抗体孵育步骤。将金属丝重新插入其金属丝塞中。在进行DNA-FISH实验前3小时，将杂交炉温度设定为75摄氏度，并将干热烘箱温度设定为37摄氏度。将0.4倍浓度的SSC溶液冷却至4摄氏度。用预冷的0.4倍SSC溶液将金属丝清洗三次。在通风橱内避光干燥10分钟。10分钟后，涡旋并离心探针5秒。取10微升探针液滴入玻璃微量离心管中，然后用实验室封口膜覆盖。用干燥吸水纸包裹微量离心管。放入50毫升离心管中，短暂离心。将干燥的金属丝小心放入微量离心管中，并插入金属丝塞。然后，用橡胶胶水密封金属丝塞。将该管置于杂交炉内的避光湿盒中，在 75 摄氏度下孵育 8 分钟，以实现 DNA 的完全变性。八分钟后，将湿盒转移至37摄氏度的干热烘箱中过夜。将装有0.4倍SSC溶液的玻片染色缸放入设定为72摄氏度的水浴中。监测0.4倍SSC溶液的温度，直至其达到72±1摄氏度。接下来，准备两个玻璃烧杯，一个装有两倍浓度的 SSC 加 0.05% Tween 溶液，另一个装有蒸馏水。将湿化室从干热烘箱中取出。使用镊子小心地将橡胶胶水从导线塞中移除，并将导线未涂覆的一端穿过末端塞，注意不要损坏功能化尖端。将导线浸入0.4倍SSC溶液中，在72摄氏度下孵育2分钟。随后在2倍SSC加0.05% Tween溶液中室温洗涤30秒。然后，用室温的蒸馏水清洗金属丝。在避光条件下，于通风橱中干燥金属丝10分钟。将金属丝的功能化尖端与预先配制的DAPI溶液在2毫升小瓶中孵育。用一倍浓度的 PBS 将金属丝冲洗两次，并使其自然晾干。将金属丝置于金属丝固定装置中，小心地将功能化的一端穿过特殊固定装置的入口，直至尖端与耦合点对齐。将该特殊固定装置放置在显微镜载物台上。使用20倍物镜调节显微镜的焦距。首先对特殊支撑结构进行粗调聚焦，然后在DAPI通道中呈现亮色的细胞上进行精细调节。仅对位于物镜视野中央的细胞进行聚焦，并使用12位数字相机，在20倍和40倍物镜下，结合红、绿、蓝探针的适当滤光片采集图像。最后，将导线与功能化尖端并排放置并小心地插入玻璃管中，以准备长期保存。将导线在负20摄氏度下垂直或水平储存。免疫荧光染色未对DNA-FISH信号产生干扰。在功能化三维支架导线上进行免疫-DNA-FISH 检测时，可清晰观察到 EpCam 染色。ALK 探针显示了基因缺失。NCI-H3122 细胞系表现出异常的 LAK 基因状态，而 NCI-H1975 细胞系则为 ALK 基因野生型。掌握该方案后，可在三天内总共九个工作小时内完成。在操作过程中，应注意不要触碰导线的功能化部分，以防止造成任何损伤。根据本方案，可使用不同的抗体和FISH探针来回答其他问题，例如鉴定具有其他表型标志物的细胞，以及其他细胞遗传学改变，如NAT或HAR2基因扩增。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过表型参数（如 EpCAM 阳性）同时鉴定循环肿瘤细胞（CTC）的疑似细胞，并检测细胞遗传学改变（如 ARC 基因状态）。请注意，使用丙酮和烘箱时可能存在极高危险性。在进行该操作时，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作丙酮，并佩戴防护手套。

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采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

循环肿瘤细胞（CTCs）对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文介绍了一种高通量、一体化的CTC富集与单个CTC测序方案，在提高捕获效率和CTC纯度的同时，降低了污染风险和测序成本，从而推动了精准肿瘤学研究及临床应用的发展。...

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