用医用金属丝捕获循环肿瘤细胞的肿瘤细胞: 基于免疫荧光和 DNA 的3D 方法

我们提出了一种新的方法来描述肿瘤细胞。我们结合免疫荧光与 DNA 荧光-原位杂交, 以评估细胞捕获的功能性医用电线, 能够在体内的,丰富 ctc 直接从病人的血液。

该方案的总体目标是将免疫荧光染色与 3D 功能化线上的 DNA 荧光原位杂交相结合，并使用常规宽场荧光显微镜鉴定支持物上的免疫表型和 FISH 信号。该方法可以帮助回答分泌肿瘤细胞表征领域的关键问题，例如确定循环非小细胞肺癌细胞上的治疗相关靶点。该方案的主要优点是允许同时识别表型参数（如 EpCAM 阳性）和细胞体改变（如 ARC 基因状态）以检测推定的 CTC。

虽然这种方法是专门为提供原位胰岛素癌 CTC 特征而设计的，但它也可以应用于其他癌症（如乳腺癌）的研究。我们在处理用于直接免疫表型和 CTC 检测的导线时开发了该协议。为了获得更多数据，我们将免疫表型方案与 DNA 荧光原位杂交方案相关联。

处理电线并不容易，主要是因为功能化的尖端很脆弱。视觉演示将让读者重现这些步骤。开始实验时，使用 4 mL 完全培养基将汇合度为 80% 的 T75 培养瓶的全部内容物重悬于 5 mL 小瓶中。

接下来，从玻璃包装中取出电线。将金属丝的功能化金部分浸入样品瓶中，确保金属丝塞与 5 mL 样品瓶完美贴合。用实验室薄膜密封电线。

然后，在室温下将导线在管旋转器中孵育 30 分钟。旋转后，使用三个不同的干净小瓶在单折 PBS 溶液中冲洗金属丝 3 次，然后等待金属丝干燥。在通风橱中风干金属丝 10 分钟后，在室温下将金属丝浸入 5 毫升试管中的 100% 丙酮溶液中 10 分钟，以固定细胞。

确保功能化尖端上没有丙酮痕迹。在室温下风干电线 5 分钟。接下来，在 5 毫升试管中，用一倍 PBS 清洗电线两次。

在抗体稀释缓冲液中孵育导线。用与荧光染料偶联的单克隆一抗稀释液和数据表中指定的抗体稀释缓冲液制备 150 μL 抗体混合物。然后，使用 P200 尖端从导线塞中取出导线，并轻轻地将导线插入导线尖端的较大孔中。

先插入无功能的一端，然后慢慢地将电线拉过较小的孔，直到金部分刚好超出较大的孔。将 150 μL 抗体混合物轻轻加入吸头中。为避免形成气泡的风险，请轻轻旋转导线，直到功能化的一端完全插入。

密封吸头的孔，并在孔周围包裹实验室薄膜。将金属丝在 4 摄氏度的黑暗中垂直孵育过夜。第二天，通过在一倍 PBS 中洗涤导线两次来阻断抗体孵育。

将电线重新插入其电线挡块中。在 DNA-FISH 方案前 3 小时，将杂交炉设置为 75 摄氏度，并将干热炉设置为 37 摄氏度。将 0.4 倍 SSC 溶液冷却至 4 摄氏度。

在冰冷的 0.4 倍 SSC 溶液中清洗电线 3 次。在通风橱下避光晾干电线 10 分钟。10 分钟后，涡旋并旋转探头 5 秒钟。

将 10 微升探针滴入玻璃微管中，然后用实验室薄膜覆盖。用干燥的吸水纸包裹微管。放入 50 毫升试管中，短暂旋转。

小心地将干燥的电线放入微管中，然后插入电线塞。然后，用橡胶水泥密封钢丝挡块。将导线放入杂交炉中黑暗潮湿的室中，在 75 摄氏度下放置 8 分钟，以获得完全的 DNA 变性。

八分钟后，将潮湿室移至 37 摄氏度的干热烘箱中过夜。将装有 0.4 倍 SSC 溶液的载玻片染色罐放入设定为 72 摄氏度的水浴中。检查 0.4 倍 SSC 溶液温度，直到达到 72 正负 1 摄氏度。

接下来，准备两个玻璃烧杯。一种是两倍 SSC 加 0.05% 吐温溶液，另一种是蒸馏水。拆下干热烘箱的潮湿室。

用镊子小心地从金属丝挡块上取下橡胶水泥，然后将金属丝的未涂层端穿过端挡块，小心不要损坏功能化的尖端。将线材浸入 0.4 倍 SSC 溶液中，在 72 摄氏度下浸泡 2 分钟。在室温下用两倍 SSC 加 0.05% 吐温溶液清洗电线 30 秒。

然后，在室温下用蒸馏水清洗电线。在通风橱下避光干燥电线 10 分钟。将金属丝的功能化尖端与先前制备的 DAPI 溶液在 2 ml 小瓶中孵育。

在单折 PBS 中冲洗电线两次，然后风干电线。将导线放入导线支架中，小心地将功能化的尖端插入特殊支架的入口点，直到尖端与耦合点匹配。将特殊支架放在显微镜载物台上。

使用 20 倍镜头调整显微镜的焦距。首先，粗略地关注特殊支撑，然后对 DAPI 通道中显得明亮的单元格进行精细调整。仅聚焦镜头中央的单元，并使用 20 倍和 40 倍物镜的 12 位数码相机采集图像，并为红色、绿色和蓝色探头配备适当的滤光片。

最后，将电线包装在功能化尖端旁边，然后小心地将电线插入玻璃管中，准备长期存放的电线。将电线垂直或水平存放在负 20 摄氏度。免疫荧光染色不干扰 DNA-FISH 信号。

当在 3D 支撑功能化导线上进行免疫 DNA-FISH 测定时，EpCam 染色清晰可见。ALK 探针显示基因缺失。NCI-H3122 细胞系显示出异常的 LAK 基因状态，与野生型 ALKG 的 NCI-H1975 相比。

一旦掌握，该协议可以在三天内总共工作九个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是不要触摸电线的功能化部分，以防止任何损坏。按照此方案，可以使用不同的抗体和 FISH 探针来回答其他问题，例如识别具有其他表型标志物的细胞和其他细胞遗传学改变，例如 NAT 或 HAR2 基因扩增。

观看本视频后，您应该对如何通过表型参数（如 EpCAM 阳性）同时识别推定的 CTC 以及检测细胞遗传学改变（如 ARC 基因状态）有很好的了解。不要忘记，使用丙酮和烘箱可能非常危险。执行此程序时应始终采取预防措施，例如在头罩中处理丙酮和戴防护手套。