免疫荧光对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞的半自动PD-L1特征化及枚举

基于微流体技术，从正常血细胞分离和表征CTC不需要使用特定的CTC生物标志物，并且与细胞培养相容。该协议通过评估恶性细胞形态特征，促进高CTC提取率，并提供广泛的细胞学分析。CTC的PD-L1表达在肺癌管理中具有预测价值。

利用此测试改进其检测可促进长期更好的患者管理。该协议的其他应用包括使用 FISH 检测遗传畸变，或对 CTC 进行转录分析，以及隔离母亲体内胎儿起源的细胞。演示这个程序的将是朱莉·巴兰迪尔，一个来自我们实验室的技术人员。

对于预分析循环肿瘤细胞富集，首先将7.5毫升血液收集到EDTA钾管中，并保持样品在温和搅拌下，以避免细胞沉淀和凝固。在采集的6小时内，使用微生物安全柜下的血清移液器，将高达7.5毫升全血转移到新的50毫升离心管中，并在室温下以1600倍G离心10分钟。在离心结束时，使用转移移液器收集血浆分数，而不会干扰薄毛涂层，并使用相当于 PBS 的量稀释等离子体，高达 7.5 毫升。

接下来，在血液样本中小心添加红细胞解液缓冲液，最终体积为30毫升，轻轻反转血液采集管三次，然后将导管置于室温下10分钟。在孵化结束时，通过离心收集细胞，并小心地去除除最后四到五毫升的上经剂。使用过滤的微移液来去除剩余的上清液，并使用带过滤尖端的 P1000 微移子在管壁上添加一毫升的再增液缓冲液。

为了避免引入气泡，用温和的移液重新暂停细胞颗粒，直到样品是均匀的。当颗粒重新分配时，在管壁上再加三毫升的再增缓冲液，而不产生气泡，然后再次轻轻地混合细胞。对于循环肿瘤细胞富集的螺旋微流体装置，首先将一个新的螺旋微流体芯片加载到装置上，然后将一个空的50毫升离心管加载到每个输入和输出端口中。

单击素数以对螺旋微流体设备进行三分钟的准备。在循环结束时拆下输入和输出管。将重新暂停的血液样本加载到输入端口中，然后将一个 15 毫升的透明锥形管加载到输出端口中。

然后单击运行，并选择程序三启动31分钟循环肿瘤细胞富集程序。在循环结束时，将输出管转移到离心机，并使用五毫升血清移液器去除除最后两毫升的上流液器的所有部分。然后使用微管去除除最后100微升的上一升剂。

对于免疫荧光染色，在血细胞计中计算细胞，将富集的样品稀释至每100微升0.2%抗结合溶液浓度的10至5个细胞的1倍。接下来，使用用 50 微升防结合溶液浸泡的棉签来滋润样品室的轮廓，并在样品室中放置多晶硅玻璃滑梯。关闭腔室，上下移液器三次，用结合溶液涂覆微管尖端，然后再将样品重新在上流液的最后 100 微升中重新制备。

将细胞溶液转移到样品室，并在专用离心机中以每分钟 400 次旋转的速度将样品固定，以低加速度进行 4 分钟。离心结束时，在沉积区域周围放置一个硅胶隔离器，让滑轨在微生物安全柜下干燥两分钟，然后在室温下用100微升4%半甲醛将细胞孢子样品固定10分钟，然后用每次洗涤的200微升PBS进行三次两分钟洗涤。上次洗涤后，在室温下用30分钟的孵化阻断试剂，阻断任何非特异性结合，然后用100微升的抗体溶液进行标记。

将标有的幻灯片放在 100 到 15 毫升的培养皿中，放在用两毫升无菌水润湿的吸水纸上，并在四摄氏度的夜间将盘子关闭，防止光线。第二天早上，如所示，用PBS清洗样品三次，用10微升适当的安装溶液和玻璃盖滑将样品安装。然后用透明指甲油密封盖滑。

要对细胞孢子样本进行成像，请用 X Y 电动平台将幻灯片加载到直荧光显微镜上，然后根据用于抗体标记的荧光团选择 20 倍的靶点和适当的通道。打开汞灯，使显微镜和相关软件适应半自动拍摄。当灯准备就绪时，在采集菜单中定义四个通道，设置曝光时间，并定义要扫描的磁贴。

单击磁贴和高级实验，并定义要扫描的区域。然后调整屏幕上的焦点，然后单击"开始实验"。在实验结束时，导出每个通道的 TIF 文件，并特别命名该文件以包括样本、时间、染料和子切片数。

对于图像分析，从广院网站打开图像分析软件，然后单击文件、管道文件和分析四个通道CTC。将文件放入文件列表中，并更新元数据以按磁贴对文件进行分组。然后单击分析图像以打开与测量强度参数对应的电子表格文件。

如果没有优化的去污方案，仅在24小时后，在富集A549细胞系的组织培养中观察到高细菌污染，导致真核细胞死亡和细胞形态变化。相比之下，在清洁方案之后，活的 A549 细胞在组织培养和培养中去除 10 小时后，在 3D 培养条件下和在患者样本中获得 2D 培养。使用液体免疫荧光染色测定或多晶硅涂层幻灯片上的免疫荧光染色测定，可以观察到两种测定之间列举的核数。

如果没有细胞素步骤，很难区分白血球和肿瘤细胞，因为非细胞素细胞准备的模糊轮廓。在这里，可以从不同的患者样本中观察到不同的代表性结果，特别是白血球的残留计数被确定为强变量，并取决于整个血液样本。在获得循环肿瘤细胞子种群中也观察到高变异性。

细胞针上的每个细胞由图像分析软件识别，并能够跟踪细胞并手动确认结果。事实上，试验性分析表明，手动枚举和图像分析软件枚举之间是一致性的。内部为蛋白质抗体杂交设计的湿培养皿的设置至关重要，因为在整个孵化过程中，该装置仍然足够潮湿。