Name: 免疫荧光对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞的半自动PD-L1特征化及枚举 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学习利用微流控技术分离非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞并进行PD-L1免疫荧光检测的方法。该技术无需特定生物标志物即可实现高提取率，支持细胞培养、遗传学分析及转录组学研究，为肺癌患者的精准管理提供可靠工具。

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本研究得到了阿斯利康（英国伦敦）、Biolidics（新加坡）以及法国索恩-卢瓦尔省抗癌联盟（Ligue Contre le Cancer）研究基金的资助。作者感谢阿斯利康和Biolidics公司提供的资金支持。

样本在里昂大学医院的CIRCAN（&#34;CIRculating CANcer&#34;）队列研究框架内，根据患者的书面知情同意，前瞻性地收集。本研究纳入CIRCAN_ALL队列。CIRCAN_ALL研究已于2015年4月11日由法国东南部第四伦理审查委员会（CPP South-East IV）认定为非干预性研究，编号L15-188；其修订版本于2016年9月20日以编号L16-160再次被认定为非干预性研究。CIRCAN_ALL研究已于2015年12月1日向里昂市立医院（Hospices Civils de Lyon）的信息技术与自由事务代表完成申报，申报编号为15-131。血液采集在临床医生观察到肿瘤进展的最早迹象时进行。
注意：请使用材料表中列出的所有试剂和材料，并按照相应的储存条件进行分析前样本制备和免疫荧光检测。替换试剂和/或修改储存条件可能导致检测性能不理想。
1. 螺旋微流控装置的去污染
注意：螺旋微流控装置的去污染是必要的步骤，旨在去除由细菌污染产生的所有免疫荧光背景，以便观察循环肿瘤细胞（CTC）的细胞形态学特征，并能够将其与正常免疫细胞区分开来。本方案已针对在采血后6小时内采集于K2EDTA管中的血液样本进行优化，并在洁净条件下使用螺旋微流控装置完成细胞富集。若将该检测用于其他类型的样本（如其他生物体液），可能需要进一步优化。此去污染程序应每周执行一次。
<ol>
	<li>试剂的准备
	<ol>
		<li>稀释缓冲液的制备
		<ol>
			<li>使用 0.22 µm 注射器滤器对 20 mL 稀释添加剂试剂进行灭菌，并直接加入 1 L 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，超纯级）中（材料表）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>试剂和输入吸管的灭菌
		<ol>
			<li>使用 0.22 µm 注射器滤器对红细胞裂解缓冲液和重悬缓冲液（RSB；材料表）进行灭菌，并分别储存于新的 50 mL 聚丙烯锥形管中。</li>
			<li>通过在通用清洁试剂（材料表）中室温（RT）孵育 1 小时，对输入吸管进行灭菌。将吸管转移至含次氯酸钠的清洁剂（材料表）中，并在室温下继续孵育 1 小时。</li>
			<li>用无菌 PBS 将输入吸管冲洗两次，每次 1 小时，并将已灭菌的输入吸管保存于外科级无菌袋中（材料表）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>螺旋微流控装置的去污染处理
	<ol>
		<li>使用通用清洁试剂进行消毒
		<ol>
			<li>拧开棕色螺钉，将稀释液瓶盖从螺旋微流控装置的稀释液端口上拆下。在微生物安全柜内，将最多 250 mL 的通用清洁试剂（材料表）转移至一个新的空瓶中。</li>
			<li>在微生物安全柜内，将稀释液瓶盖和吸管拧接到装有 250 mL 通用清洁试剂的瓶子上。通过重新拧紧棕色螺钉，将该瓶子连接至螺旋微流控装置的稀释液端口。</li>
			<li>在微生物安全柜内，使用移液管将最多 100 mL 次氯酸钠溶液（终浓度 1%；材料表）转移至运行试剂盒中提供的废液容器中（图 1A）。</li>
			<li>在输入端口安装一根新的无菌输入吸管至螺旋微流控装置（材料表）。在输入端口放置一个新的 50 mL 离心管。在输出端口放置另一个新的 50 mL 离心管。</li>
			<li>点击螺旋微流控装置上的启动按钮，开始预冲洗程序（3 分钟）。预冲洗完成后，移除输入管。</li>
			<li>在微生物安全柜内，使用刻度移液管将最多 15 mL 通用清洁试剂转移至一个新的 50 mL 离心管中，并将该管连接至螺旋微流控装置的输入端口。</li>
			<li>开始运行前，检查溶液中是否存在过多气泡。如有气泡，使用移液器缓慢吸取以去除。</li>
			<li>在螺旋微流控装置中装载一个去污染用微流控芯片。点击运行按钮并选择程序 3（31 分钟），启动程序。 
			注：螺旋微流控装置的程序 3 可在 31 分钟内实现循环肿瘤细胞（CTCs）的快速富集。</li>
			<li>继续使用输入管中剩余的通用清洁试剂完成螺旋微流控装置的清洗步骤。</li>
			<li>清洗步骤完成后，丢弃输入管，保留输入吸管。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用含氯清洁剂进行去污染
		<ol>
			<li>拧开棕色螺钉，将通用清洁试剂瓶盖从螺旋微流控装置的稀释液端口上拆下。在微生物安全柜内，将最多 250 mL 含氯清洁剂（材料表）转移至一个新的空瓶中（图 1A）。</li>
			<li>在微生物安全柜内，将通用清洁试剂瓶盖和吸管拧接到装有含氯清洁剂的瓶子上。通过重新拧紧棕色螺钉，将该瓶子连接至螺旋微流控装置的稀释液端口。</li>
			<li>在微生物安全柜内，使用刻度移液管将最多 15 mL 含氯清洁剂转移至一个新的 50 mL 离心管（作为输入管）。将该 50 mL 离心管置于输入位置。在输出位置放置一个空管。</li>
			<li>运行前，检查样品中是否存在过多气泡；如有，使用移液器缓慢吸取以去除气泡。</li>
			<li>点击运行按钮并选择程序 3（31 分钟）启动程序。运行结束后，立即使用输入管中剩余的含氯清洁剂继续进行清洗步骤。</li>
			<li>丢弃输入管和输出管。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>冲洗螺旋微流控装置
		<ol>
			<li>拧开棕色螺钉，将含氯清洁剂瓶盖从螺旋微流控装置的稀释液端口上拆下。在微生物安全柜内，将吸管从含氯清洁剂瓶中取出，转移至装有稀释缓冲液的新瓶中。将该瓶拧接到螺旋微流控装置上。</li>
			<li>在微生物安全柜内，使用刻度移液管将最多 15 mL 灭菌水（材料表）转移至一个新的 50 mL 离心管（作为输入管）。将该 50 mL 离心管置于输入位置。在输出位置放置一个空管。</li>
			<li>运行前，检查样品中是否存在过多气泡；如有，使用移液器缓慢吸取以去除气泡。</li>
			<li>点击运行按钮并选择程序 3（31 分钟）启动程序。运行结束后，立即使用输入管中剩余的灭菌水继续进行清洗步骤。</li>
			<li>丢弃输入管和输出管。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 保持螺旋微流控装置无细菌的维护
注意：日常维护应在每天最后一次清洁步骤结束时进行。
<ol>
	<li>在微生物安全柜内，使用刻度移液管将最多 7 mL 含氯漂白消毒剂转移至新的 50 mL 离心管中。将含氯漂白消毒剂管拧入螺旋微流控装置的进样口。</li>
	<li>在开始清洗运行前，检查进样样品中是否含有过多气泡；如有气泡，需用移液器缓慢吸取以去除气泡。</li>
	<li>在螺旋微流控装置上运行清洗程序。</li>
</ol>
3. 患者血液样本中循环肿瘤细胞的预分析富集
<ol>
	<li>在K2EDTA管中采集7.5 mL血液，并轻轻振荡以避免细胞沉淀和凝固。应在6小时内完成处理。 
	注意：若血液采集于含有防腐剂的无细胞DNA血液采集管中，请在4 °C保存直至处理。确保在进行富集步骤前，血液样本、红细胞裂解缓冲液和RSB缓冲液均处于室温（RT）。</li>
	<li>在生物安全柜内，使用移液管将最多7.5 mL全血转移至新的50 mL离心管中。</li>
	<li>在室温下以1,600 × g离心10分钟。用移液器小心收集血浆组分，避免扰动白膜层。随后直接加入等体积的PBS，补足至7.5 mL，以替代已移除的血浆。</li>
	<li>向血液样本中轻柔加入红细胞裂解缓冲液（材料表），终体积为30 mL（用于K2EDTA管）或37.5 mL（用于无细胞DNA血液采集管）。轻柔倒置混匀10次，并在室温下孵育10分钟。 
	注意：红细胞裂解过程中，样本颜色会变为更深的红色。若孵育10分钟后未观察到明显变化（即仍为深红色且不透明），可再轻柔倒置3次，静置最多5分钟。切勿将样本在红细胞裂解缓冲液中停留超过15分钟，以免影响样本质量和检测性能。</li>
	<li>将裂解后的血液样本在室温下以500 × g离心10分钟，离心机刹车设为开启状态（或最高速度减速）。使用巴斯德移液管或移液管小心吸除上清液，直至剩余体积达到4–5 mL刻度线。然后使用带滤芯的微量移液器吸头吸除剩余上清液。</li>
	<li>使用带滤芯吸头的P1000微量移液器，沿50 mL离心管内壁加入1.0 mL RSB缓冲液。为避免引入气泡，应轻柔地反复吹打重悬细胞沉淀，直至样本均匀。</li>
	<li>沿50 mL离心管内壁再加入3 mL RSB缓冲液（总体积达4 mL）。避免引入气泡。通过轻柔反复吹打，充分混匀细胞悬液。 
	注意：若常规吹打无法有效分散可见的细胞团块（定义为肉眼可见或堵塞移液器吸头），应通过40 μm细胞筛过滤样本以去除团块。为补偿过滤过程中的体积损失，向样本中加入150 μL RSB缓冲液。请注意，该方法仅应在观察到较大团块时谨慎使用。</li>
	<li>在进入富集步骤前，检查样本中是否存在过多气泡；如有，应小心去除气泡，注意避免丢弃任何样本。若仅有微小气泡存在，则无需去除。</li>
	<li>将样本在螺旋微流控装置上进行处理。</li>
</ol>
4. 使用螺旋微流控装置从患者全血中富集循环肿瘤细胞
<ol>
	<li>安装一个新的螺旋微流控芯片。在输入端口和输出端口分别装入两个空的 50 mL 离心管。</li>
	<li>点击螺旋微流控设备上的Prime（启动）进行预运行（3 分钟）。移除输入和输出管，将待处理的样本加入输入端口。</li>
	<li>在输出端口安装一个透明的 15 mL 锥形管以收集富集的循环肿瘤细胞（CTCs）。点击Run（运行），选择Program 3（程序 3）并开始运行（31 分钟）。</li>
	<li>取出输出端的离心管，在 500 × g 条件下离心 10 分钟（加速度：9；减速度：5）。使用 5 mL 血清移液管吸除上清液，至 15 mL 锥形管的 2 mL 刻度线处停止。再用微量移液器继续吸除上清液，至 15 mL 锥形管的 100 µL 刻度线处停止。直接对富集后的样本进行免疫荧光染色处理。</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>使用带有血细胞计数板型网格的计数板，在计数室中测定每毫升的细胞数量。用0.2%防粘附溶液（材料表）稀释富集后的样品，使其浓度达到每次细胞离心100,000个细胞/100 µL。</li>
	<li>用棉签（材料表）蘸取50 µL的0.2%防粘附溶液润湿样品室边缘。将一张多聚赖氨酸包被的玻片放入样品室内并盖紧。</li>
	<li>用移液器吸取并吹打0.2%防粘附溶液3次，以润洗枪头。重悬富集后的样品，并将细胞悬液转移至样品室中。使用专用离心机（材料表）在400 rpm条件下离心4分钟（低速加速）。</li>
	<li>在沉积区域周围放置硅胶隔离圈。将玻片置于生物安全柜中干燥2分钟。</li>
	<li>通过将1 mL的16%多聚甲醛（PFA）与3 mL无菌PBS混合，配制固定液。每个样本加入100 µL固定液（4% PFA），室温孵育10分钟。移除固定液后，用200 µL PBS洗涤三次，每次室温孵育2分钟。 
	注意： 使用PFA时应在化学安全柜内操作，以防吸入。</li>
	<li>在无菌PBS中分别将胎牛血清（FBS）稀释至5%、Fc受体（FcR）阻断试剂稀释至5%、牛血清白蛋白（BSA）稀释至1%，配制成封闭液（材料表）。每个样本加入100 µL封闭液，室温孵育30分钟。移除封闭液。</li>
	<li>每个样本加入100 µL抗体溶液（CD45抗体1/20；PanCK抗体1/500；PD-L1抗体1/200；Qsp封闭液100 µL）（材料表）。将多聚赖氨酸包被的玻片放入直径100 mm、高15 mm的培养皿中。在吸水纸上加入2 mL无菌水润湿，盖上培养皿盖子。4 °C避光孵育过夜。</li>
	<li>移除抗体混合液，用200 µL PBS洗涤三次，每次孵育2分钟。让样本避光干燥5分钟。在沉积区域滴加10 µL封片液（材料表），加盖显微镜盖玻片，避免产生气泡。用指甲油密封盖玻片。</li>
</ol>
6. 使用直立荧光显微镜及配套软件获取免疫荧光图像
<ol>
	<li>使用带有 X/Y 轴电动载物台的直立荧光显微镜。采用 20 倍物镜，在四个通道中拍摄 8 位 RGB 的 TIFF 图像，分别对应 DNA 染料（4',6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）、PanCK 染料（异硫氰酸荧光素 [FITC]）、PD-L1 染料（CY3）和 CD45 染料（CY5）。使用前 15 分钟打开汞灯，并将显微镜及相关软件设置为半自动拍摄模式。</li>
	<li>将玻片放置在载物台上。</li>
	<li>在采集菜单中，定义四个通道并设置曝光时间（DAPI：15 ms，FITC [PanCK]：500 ms；CY3 [PD-L1]：800 ms；CY5 [CD45]：1,000 ms）。定义需要扫描的图像区域。点击 图像拼接（Tiles）。在 高级实验（Advanced experiment） 中，设定扫描区域。</li>
	<li>在屏幕上调节焦距。点击 开始实验（Start experiment）。</li>
	<li>导出每个通道的 TIF 文件，并根据以下信息为图像文件命名：样本_图像区域编号_染料_子区域编号.tif（例如：Sample1_TR1_c1m01）。染料命名规则如下：DAPI 通道为 c1，FITC 通道为 c2，CY3 通道为 c3，CY5 通道为 c4。</li>
</ol>
7. 使用图像分析软件分析免疫荧光图像
<ol>
	<li>从 Broad Institute 网站下载并安装免费的图像分析软件。安装过程中接受所有默认设置。打开图像分析软件，点击 文件 | 从文件加载流程 | Analysis_4channels_CTC.cppipe。 
	注意：该分析流程将 RGB 彩色图像转换为灰度图像，通过中值滤波平滑图像以去除伪影，识别细胞核与细胞质，量化各通道的荧光强度，并将结果导出至 Excel 文件。</li>
	<li>将文件拖放到 文件列表 中。更新元数据，按图像块（tiles）对文件进行分组。 
	注意：所有关于图像分组的操作说明均在软件中指定。在 NamesAndTypes 模块中显示的文件名将根据每个样本的图像块编号和通道进行分组。</li>
	<li>点击 查看输出设置，指定正确的默认输出路径。点击 分析图像。打开与 measure_intensity 参数对应的电子表格文件。</li>
</ol>

<ol><li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+in+Metastatic+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).</li>
<li>Paz-Ares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+plus+Chemotherapy+for+Squamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).</li>
<li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced%2C+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+randomised%2C+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li>
<li>Hellmann, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Mutational+Burden+and+Efficacy+of+Nivolumab+Monotherapy+and+in+Combination+with+Ipilimumab+in+Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer.</a> Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).</li>
<li>Chouaid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+and+clinical+impact+of+re-biopsy+in+advanced+non+small-cell+lung+cancer%3A+a+prospective+multicenter+study+in+a+real-world+setting+%28GFPC+study+12-01%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cancer%22%5BJournal%5D)">Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01).</a> Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).</li>
<li>Nosaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-biopsy+status+among+non-small+cell+lung+cancer+patients+in+Japan%3A+A+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cancer%22%5BJournal%5D)">Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study.</a> Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).</li>
<li>Uozu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+tissue+re-biopsy+in+non-small+cell+lung+cancers+resistant+to+previous+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175(2017).</li>
<li>Kim, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+re-biopsy+and+EGFR+mutation+analysis+in+patients+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cancer%22%5BJournal%5D)">Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer.</a> Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).</li>
<li>Nicolazzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+PD-L1+positive+circulating+tumor+cells+in+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+the+PD-1+inhibitor+Nivolumab%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab.</a> Scientific Reports. 6, 31726(2016).</li>
<li>Guibert, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+circulating+tumor+cells+of+advanced+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+nivolumab%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab.</a> Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+Expression+in+Circulating+Tumor+Cells+Increases+during+Radio%28chemo%29therapy+and+Indicates+Poor+Prognosis+in+Non-small+Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer.</a> Scientific Reports. 9 (1), 566(2019).</li>
<li>Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-based+separation+methods+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Size-based separation methods of circulating tumor cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).</li>
<li>Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-based+enrichment+technologies+for+CTC+detection+and+characterization.+Recent+results+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Fortschritte+der+Krebsforschung.+Progres+dans+les+recherches+sur+le+cancer%22%5BJournal%5D)">Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research.</a> Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).</li>
<li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+Circulating+Tumor+DNA+%28ctDNA%29+in+Plasma+of+non-small+cell+lung+cancer+%28NSCLC%29+patients%2C+Monitoring+of+EGFR+p.T790M+mutated+allelic+fraction+using+BEAMing+Companion+Assay+and+Evaluation+in+future+application+in+mimicking+Circulating+Tumors+Cells+%28mCTC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC).</a> Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).</li>
<li>Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pre-analytical+conditions+and+comparison+of+the+performance+of+several+digital+PCR+assays+for+the+detection+of+major+EGFR+mutations+in+circulating+DNA+from+non-small+cell+lung+cancers%3A+the+CIRCAN_0+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study.</a> Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).</li>
<li>Lustberg, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+atypical+cell+populations+are+present+in+blood+of+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients.</a> Breast Cancer Research. 16 (2), 23(2014).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Sentinel%22+circulating+tumor+cells+allow+early+diagnosis+of+lung+cancer+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">"Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLoS ONE. 9 (10), 111597(2014).</li>
<li>Khoo, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+an+ultra+high-throughput+spiral+microfluidics+for+the+detection+and+enrichment+of+viable+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells.</a> PLoS ONE. 9 (7), 99409(2014).</li>
<li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Comparison+among+cytology%2C+small+biopsy%2C+and+surgical+resection+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li>
<li>Biswas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+performance+of+endobronchial+ultrasound-guided+transbronchial+needle+aspiration+for+assessing+programmed+death+ligand-1+expression+in+nonsmall+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer.</a> Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).</li>
<li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing%3A+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li>
</ol>

Jean-Philippe Aurel 和 Kathryn Weiqi Li 是 Biolidics 公司的员工，该公司生产本文所用的仪器。其他作者无任何利益冲突需要披露。

本研究提出了两个主要问题，第一个涉及工作流程在临床应用转化中的表现，第二个涉及所获得荧光图像分析中主观性的降低。
通过CTC无标记微流控系统（螺旋微流控装置）富集细胞后，采用可定制的免疫荧光检测方法，初步确定了一种高效且优化的CTC计数工作流程。利用该工作流程，一项初步研究证实，所有转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的样本中均存在非典型细胞，且均为CD45阴性[CD45(-)]。这些细胞可选择性地表达上皮细胞角蛋白（PanCK）和/或PD-L1生物标志物；但也可能对所有检测的生物标志物均呈阴性[即CD45(-)、PanCK(-)和PD-L1(-)，如S19样本中所观察到的（表2）]。这一发现突出表明，亟需增加可用于CTC亚群表型鉴定的其他生物标志物。因此，建议增加上皮-间质转化相关生物标志物，如EpCAM、波形蛋白（Vimentin）和N-钙黏蛋白（N-Cadherin）；癌症干细胞标志物，包括CD44和CD133；以及特定肿瘤标志物，如肺腺癌中的TTF1。
在初步研究中，3.5 mL 全血...

肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）通过一种称为癌症&#34;免疫监视&#34;的过程，在抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用。免疫检查点阻断抗体（如CTLA-4抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂）可增强CTLs的抗肿瘤功能。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，抗PD-1/PD-L1治疗在PD-L1阴性肿瘤患者中的应答率为0%-17%，而在PD-L1阳性表达患者中则为36%-100%。黑色素瘤和非小细胞肺癌中对PD-1/PD-L1阻断治疗的显著应答已有充分证据，表现为总体应答率（RR）提高、持久的临床获益以及无进展生存期（PFS）延长。目前，在二线治疗中，无论PD-L1表达水平如何，纳武利尤单抗（nivolumab）均为NSCLC的标准治疗方案；而对于PD-L1表达≥1%的患者，帕博利珠单抗（pembrolizumab）也是标准选择。在一线治疗中，对于PD-L1表达≥50%的NSCLC患者，单独使用帕博利珠单抗是标准治疗方案，并可根据组织学亚型联合化疗（铂类药物与双药组合）以进一步增强疗效1,2。
然而，这种患者管理方法存在争议3，因为通过免疫组织化学（IHC）检测肿瘤细胞中的PD-L1表达可能并非最理想的伴随生物标志物。其他标志物如肿瘤突变负荷4（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和/或微生物群，在此背景下单独或联合应用也可能具有重要意义。非小细胞肺癌（NSCLC）具有空间异质性（不同肿瘤部位之间）和时间异质性（从诊断到复发期间）。NSCLC患者通常体质较弱，反复进行有创组织活检可能带来困难。事实上，首次进展时的再活检率在不同研究系列中为46%–84%，而成功的再活检（指完成组织学和全面分子分析）比例为33%–75%。这意味着在首次进展期间，有25%–67%的患者无法接受全面的再活检分析5,6,7,8。
随着……的到来 &#34;液体活检&#34; 因此在这一特定背景下引起了极大关注，因为它能够通过检测源自循环肿瘤细胞（CTCs）的游离DNA（cfDNA），对疾病进展过程中的分子改变进行关键性重新评估。这些活细胞从肿瘤组织释放进入血液，并在其中自由循环。尽管目前尚未常规应用，但CTC分析在肺癌的分子与表型特征刻画、预后判断及预测意义方面均显示出高度前景。通过 DNA测序、RNA测序、miRNA和蛋白质分析）。事实上，CTCs可能携带反映活动性疾病状态的表型特征，而非初始诊断时通过组织活检检测到的标志物。此外，CTCs可规避肿瘤组织空间异质性所带来的问题，而这一问题在小样本活检中可能尤为关键。因此，CTCs上的PD-L1表达或有助于阐明在使用肿瘤组织作为预测性生物标志物时所产生的结果差异。
近期已在非小细胞肺癌（NSCLC）患者的循环肿瘤细胞（CTCs）中检测PD-L1的表达。几乎所有接受检测的患者9均为PD-L1阳性，这使得结果的解读及其临床应用变得复杂。总体而言，在平均每毫升4.5个细胞的样本中，69.4%的样本检测到PD-L1阳性的CTCs10。开始放疗后，PD-L1阳性CTCs的比例显著增加，表明辐射可上调PD-L1的表达11。因此，对PD-L1阳性CTCs的分析可能用于监测肿瘤动态变化及免疫应答情况，从而反映患者对化疗、放疗以及可能的免疫治疗（IT）的应答情况。
迄今为止，循环肿瘤细胞（CTC）的分离和PD-L1表征依赖于多种方法，例如基于抗EpCAM包被的磁珠捕获CTC、无需富集的检测方法以及基于尺寸的12,13 CTC捕获检测技术。然而，在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，CTC仅能在45%–65%的患者中被检测到，因此限制了其为超过一半的转移性NSCLC患者提供信息的能力。此外，在大多数采用基于尺寸分离方法的研究中，CTC计数较低10。此外，该方法还导致了一些争议性发现，例如在健康供体的血液中检测到CD45(-)/DAPI(+)细胞，且具有&#34;恶性肿瘤的细胞形态学特征”。这些问题凸显了迫切需要一种高灵敏度的CTC富集方法，并结合使用其他癌症生物标志物（如TTF1、Vimentin、EpCAM和CD44）对来自健康全血中的非典型CD45(-)细胞进行免疫表型分析，以应用于NSCLC研究。
因此，我们评估了一种螺旋微流控装置，该装置利用惯性力和迪恩拖拽力，通过微流控芯片根据细胞的大小和可变形性实现细胞分离。微流控芯片中形成的迪恩涡流使得较大的循环肿瘤细胞（CTC）位于芯片内壁，而较小的免疫细胞则位于外壁。通过将较大的细胞虹吸至收集出口，即可完成富集过程，获得富集的CTC组分。该方法具有较高的灵敏度和特异性（可检测约1个CTC/mL全血）14，并可结合定制化的免疫荧光（IF）分析。这些工具将有助于建立用于临床解读的阳性阈值。本文由此描述了一套工作流程，使生物学家能够以高回收率和高特异性分离并进行CTC的免疫表型分析。本方案详细说明了螺旋微流控装置收集CTC的最佳使用方法、可根据癌症类型定制优化的IF检测方法，以及利用免费开源软件对细胞图像进行测量和分析，从而根据荧光染色实现细胞的半自动计数。此外，可根据可用的荧光滤光片/标记物数量进行显微镜多重成像。

<table><tbody><tr><td>4',6-二脒基-2-苯并咪唑酮&amp;eacute;尼林哚（DAPI）</td><td>Ozyme</td><td>BLE 422801</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BD Facs Clean &amp;ndash; 5 L</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>基于漂白剂的清洁剂。储存条件：室温</td></tr><tr><td>1% 次氯酸钠清洗液 100 mL</td><td>Biolidics</td><td>CBB-F016012</td><td>漂白剂。储存条件：室温</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）7.5%</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CD45单克隆抗体（克隆HI30）Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>BLE304020</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CellProfiler 软件</td><td>布罗德研究所</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>离心装置</td><td>Hettich</td><td>4706</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430-829</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Biolidics</td><td>CBB-F001004-25</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>ClearCell FX-1 系统</td><td>Biolidics</td><td>CBB-F011002</td><td>螺旋微流控装置。储存条件：室温</td></tr><tr><td>库尔特克伦茨清洗剂 &amp;ndash; 5 L</td><td>贝克曼库尔特</td><td>8448222</td><td>通用清洁试剂。储存条件：室温</td></tr><tr><td>CTChip FR1S</td><td>Biolidics</td><td>CBB-FR001002</td><td>微流控芯片。储存条件：室温</td></tr><tr><td>Cytospin 4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A78300003</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>稀释液添加剂试剂 &amp;ndash; 20 mL</td><td>Biolidics</td><td>CBB-F016009</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>EZ 细胞进样槽</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A78710003</td><td>带有棉絮的样本室。储存条件：室温</td></tr><tr><td>FcR阻断剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Sigma</td><td>F4680</td><td>封片液。储存条件：室温</td></tr><tr><td>两性霉素B - 50 mg</td><td>百时美施贵宝</td><td>90129TB29</td><td>抗真菌试剂。储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>FX1 输入管（带锁紧盖）</td><td>Biolidics</td><td>CBB-F013005</td><td>稻草。储存条件：室温</td></tr><tr><td>KovaSlide</td><td>Dutscher</td><td>50126</td><td>带腔载玻片。储存条件：室温</td></tr><tr><td>PanCK单克隆抗体（克隆AE1/AE3）Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>53-9003-80</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11490570</td><td>固定液。储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD-L1 单克隆抗体（克隆号 29E2A3）- 藻红蛋白</td><td>BioLegend</td><td>BLE329706</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Dutscher</td><td>632180</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Ozyme</td><td>BE17-512F</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>超纯级磷酸盐缓冲液 1x &amp;ndash; 1 L</td><td>1st Base 实验室</td><td>BUF-2040-1X1L</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10%</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td>抗结合溶液。储存条件：室温</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J2800AMNZ</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液 &amp;ndash; 100 mL</td><td>G Biosciences</td><td>786-649</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液 &amp;ndash; 250 mL</td><td>G Biosciences</td><td>786-650</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重悬缓冲液（RSB）</td><td>Biolidics</td><td>CBB-F016003</td><td>储存条件：+4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Shandon Cytopsin4 离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>A78300003</td><td>专用离心机。储存条件：室温</td></tr><tr><td>硅基隔离器</td><td>Grace bio-Labs</td><td>664270</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>无菌去离子水 &amp;ndash; 100 mL</td><td>1st Base 实验室</td><td>CUS-4100-100ml</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>直立荧光显微镜 Axio Imager D1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>无菌手术袋</td><td>SPS Laboratoires</td><td>98ULT01240</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>20 mL 无菌注射器 BD Discardit II</td><td>BD 生物科学</td><td>300296</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>0.22 微米注射器滤器 &amp;micro;m 33 mm 无菌</td><td>ClearLine</td><td>51732</td><td>储存条件：室温</td></tr><tr><td>Zen lite 2.3 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td>显微镜配套软件</td></tr></tbody></table>

通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动pd-l1表征与计数

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

源自原发性肿瘤的循环肿瘤细胞（CTCs）会脱落进入血液或淋巴系统。这些稀有细胞（每毫升血液中仅含1−10个）提示预后不良，并与多种癌症（如乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌）的总体生存期缩短相关。目前，基于抗EpCAM包被的磁珠捕获CTC的系统是美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于计数血液中CTC的金标准检测方法。该检测利用包被有抗EpCAM标记物的磁珠，特异性靶向上皮来源的癌细胞。许多研究表明，EpCAM并非CTC检测的最佳标志物。事实上，CTC是具有异质性的癌细胞亚群，能够经历与转移性增殖和侵袭相关的上皮-间质转化（EMT）。这些CTC可降低细胞表面的上皮标志物EpCAM的表达，同时增加波形蛋白（vimentin）等间质标志物的表达。为克服这一技术难题，研究人员已开发出基于CTC物理特性的其他分离方法。微流控技术可实现无需标记的CTC富集，从全血样本中分离CTC。螺旋式微流控技术利用惯性力和Dean拖曳力，在螺旋微流控芯片内的弯曲通道中形成连续流动，根据正常血细胞与肿瘤细胞在大小和可塑性上的差异实现细胞分离。本实验方案详细描述了结合螺旋式微流控装置与可定制的免疫荧光（IF）标志物组合，对CTC中程序性死亡配体1（PD-L1）表达进行表征的各项步骤。

首要前提条件是获得无污染（无病原体）的循环肿瘤细胞（CTC）样本用于组织培养，并避免产生免疫荧光背景信号。去污染方案能够清洁所有管道和泵，从而以较高的回收率收集到无细菌污染的CTC。通过螺旋微流控装置，比较了采用与不采用去污染流程的富集样品。为验证去污染方案的有效性，使用A549细胞系在无全血存在的情况下直接通过螺旋微流控装置进行富集。若未采用优化后的去污染方案，在富集后的A549细胞系组织培养中仅24小时即观察到严重的细菌污染，导致真核细胞死亡及细胞形态学改变（图1B）。
相比之下，在清洗方案处理后，通过组织培养和培养基去除10小时后，在二维培养条件下以及三维条件下均获得了存活的A549细胞（图1B），同时也获得了患者样本（图1C）。潜在的循环肿瘤细胞以红色叉号标记（<strong class="xfi...

循环肿瘤细胞（CTC）的表征是转化研究中的一个热门课题。本方案描述了一种半自动免疫荧光（IF）检测方法，用于对非小细胞肺癌（NSCLC）患者样本中的CTC进行PD-L1表征及计数。

通过免疫荧光法对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞进行半自动PD-L1表征与计数

循环肿瘤细胞（CTCs）来源于原发性肿瘤，可脱落进入血液或淋巴系统。这些稀有细胞（每毫升血液中1−10个细胞）...

基于微流控技术，从正常血细胞中分离和表征循环肿瘤细胞（CTCs）无需使用特定的CTC生物标志物，且与细胞培养兼容。该方案可实现高效率的CTC提取，并通过评估恶性细胞形态学特征，对CTCs进行深入的细胞学分析。CTCs表达PD-L1在肺癌管理中具有预测价值。通过本检测方法提高其检出率，从长远来看可能促进对患者的更好管理。该方案的其他应用包括使用FISH检测基因异常，对循环肿瘤细胞（CTCs）进行转录组分析，以及从孕妇体内分离胎儿来源的细胞。本次操作演示将由本实验室的技术员Julie Balandier进行。在进行循环肿瘤细胞的预分析富集时，首先将7.5毫升血液采集至含钾EDTA的采血管中，并保持样本轻柔振荡，以避免细胞沉降和凝血。采集后六小时内，在生物安全柜中使用血清移液管将最多7.5毫升全血转移至新的50毫升离心管中，在室温下以1600 × g离心10分钟。离心结束后，使用移液管小心收集血浆组分，避免扰动白膜层，并用等体积的PBS将血浆稀释至最多7.5毫升。接下来，向血液样本中小心加入红细胞裂解缓冲液，终体积为 30 毫升，轻轻倒置采血管 3 次，然后将试管置于室温下孵育 10 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，小心弃去上清液，仅保留最后 4 至 5 毫升。使用带滤膜的微量移液器移除剩余的上清液，并用带滤膜吸头的 P1000 移液器沿管壁缓慢加入 1 毫升重悬缓冲液。为避免产生气泡，需轻柔吹打重悬细胞沉淀，直至样品均匀。当沉淀完全重悬后，沿管壁加入额外的三毫升重悬缓冲液，避免引入气泡，并再次轻柔混匀细胞。对于螺旋微流控装置循环肿瘤细胞富集，首先将新的螺旋微流控芯片装载到装置上，并在进样口和出样口各装入一个空的50毫升离心管。点击“启动”按钮，对螺旋微流控装置进行预处理，持续三分钟。在循环结束时，移除输入和输出管路。将重悬的血液样本加入输入端口，并将一个透明的15毫升锥形管放入输出端口。然后点击运行，选择程序三以启动31分钟的循环肿瘤细胞富集程序。循环结束后，将输出管转移至离心机，使用5毫升血清移液管移除上清液，仅保留最后2毫升。随后使用微量移液器移除上清液，仅保留最后100微升。进行免疫荧光染色时，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将富集后的样品稀释至每100微升0.2%抗结合溶液中含有1×10⁵个细胞的浓度。接着，用含有50微升抗结合溶液的棉签润湿样品室的边缘轮廓，将一张多聚赖氨酸包被的玻片放入样品室中。关闭样品室，用移液器吸取并吹打三次，使微量移液器吸头表面被结合溶液充分润湿，然后将样品在剩余的100微升上清液中重悬。将细胞悬液转移至样品室中，使用专用离心机以400转/分钟的速度在低加速度条件下离心4分钟。离心结束后，在沉积区域周围放置硅胶隔离器，将载玻片置于生物安全柜中干燥2分钟，随后加入100 µL 4%多聚甲醛，在室温下固定10分钟，接着每次用200 µL PBS洗涤2分钟，共洗涤3次，每次均在室温下进行。最后一次洗涤后，在室温下用封闭剂孵育30分钟以阻断非特异性结合，随后加入100 µL目标抗体溶液进行标记。将标记好的载玻片置于含有吸水纸的 100 × 15 毫米培养皿中，吸水纸上加入 2 毫升无菌水使其湿润，将培养皿盖好后于 4 °C 避光过夜。次日清晨，用 PBS 如所示方法清洗样本三次，然后加入 10 µL 适当的封片液，并用盖玻片封片。随后用透明指甲油密封盖玻片。为了对细胞离心涂片样本进行成像，将玻片装载到配备X Y电动载物台的直立荧光显微镜上，根据抗体标记所用的荧光染料选择20倍物镜及相应的荧光通道。打开汞灯，并将显微镜及相关软件设置为半自动拍摄模式。当汞灯预热完成后，在采集菜单中定义四个荧光通道，设定曝光时间，并确定需要扫描的图像区域（tiles）。单击图块，选择高级实验，并定义扫描区域。然后在屏幕上调整焦距，单击开始实验。实验结束后，导出每个通道的 TIF 文件，并为文件命名，具体应包含样品名称、重复次数、染料名称以及子图块数量。进行图像分析时，从布罗德研究所网站打开图像分析软件，点击文件、从文件加载流程、四通道CTC分析。将文件拖入文件列表，并更新元数据以按图像块对文件进行分组。然后点击分析图像，以打开与测量强度参数对应的电子表格文件。若未采用优化的去污染方案，在富集的 A549 细胞系组织培养中，仅 24 小时后即可观察到严重的细菌污染，导致真核细胞死亡及细胞形态学改变。相比之下，在实施清洁方案后，于组织培养 10 小时并更换培养基后，可在二维培养条件下、三维培养条件下以及患者样本中获得存活的 A549 细胞。通过液相免疫荧光染色检测或在多聚赖氨酸包被的载玻片上进行细胞离心涂片免疫荧光染色检测，可观察到两种检测方法在计数细胞核数量上的明显差异。如果不进行细胞离心步骤，由于非细胞离心制备的细胞轮廓模糊，很难将白细胞与肿瘤细胞区分开来。在此可观察到不同患者样本中的各种代表性结果，特别是白细胞的残留数量被确定为具有高度变异性，并依赖于全血样本。所获得的循环肿瘤细胞亚群也表现出较高的变异性。图像分析软件可识别细胞涂片上的每个细胞，并能够追踪细胞，必要时可手动确认结果。事实上，初步分析表明，人工计数与图像分析软件计数结果之间具有良好的一致性。自制的湿润培养皿装置对蛋白质-抗体杂交至关重要，因为该装置必须在整个孵育期间保持足够的湿度。

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癌症研究

免疫荧光对非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞的半自动PD-L1特征化及枚举

本视频介绍了循环肿瘤细胞（CTC）免疫荧光检测技术，该技术用于表征非小细胞肺癌患者样本中循环肿瘤细胞上的生物标志物。该检测可用于监测肿瘤及免疫反应的动态变化，这些变化可能反映患者对化疗、放疗以及潜在的免疫治疗的响应情况。...

循环肿瘤细胞免疫荧光检测：一种表征循环肿瘤细胞的技术

本视频演示了一种 原位 利用荧光多光谱成像技术分析肿瘤组织中不同亚群的浸润性T细胞。将肾细胞癌组织冷冻切片用抗体处理，标记表达特定抑制性受体并呈现免疫治疗耐受表型的CD8+ T细胞。通过多光谱显微镜观察标记后的切片，以鉴定不同的CD8+...

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为了以可靠且可重复的方式，扩大全球实验室评估肺癌患者是否适合接受帕博利珠单抗治疗的能力，我们开发了一种检测方法，该方法在广泛使用的免疫组织化学自动染色仪上采用22C3抗体浓缩液，适用于活检和细胞学标本。...

使用22C3抗PD-L1抗体浓缩液检测非小细胞肺癌患者的活检和细胞学样本

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

本文介绍了一种利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）包被的微滤膜有效捕获活体循环肿瘤细胞（CTC）并实现温度响应性释放的实验方案。该方法可从患者血液中捕获CTC，并随后释放具有活性的CTC，用于后续的芯片外培养、分析与表征。...

从血液中捕获并释放可存活的循环肿瘤细胞

学习利用微流控技术分离非小细胞肺癌患者循环肿瘤细胞并进行PD-L1免疫荧光检测的方法。该技术无需特定生物标志物即可实现高提取率，支持细胞培养、遗传学分析及转录组学研究，为肺癌患者的精准管理提供可靠工具。

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