循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

该方案具有重要意义，因为它能够从混合细胞群体中检测并分离单个细胞，进而实现单细胞分辨率的下游分析。该技术的主要优势在于能够将循环肿瘤细胞（CTCs）从血细胞中单独分离出来，适用于多种需要高纯度样本的分析。首先启动显微操作仪软件，然后打开显微操作仪。

将显微操作仪连接至计算机，点击“连接并初始化设备”以在显微镜载物台上初始化机械臂。每次操作设备后，均需用乙醇清洁防护柜的内外表面，并关闭防护柜，以便通过计算机操控设备。在机械臂上安装一根新的20至30微米玻璃毛细管，并通过系统冲洗系统油，以清除管路中的任何气泡。

用70%乙醇填充灭菌罐一，用无菌无核酸酶水填充灭菌罐二，用无菌杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）填充缓冲液罐。用70%乙醇对毛细管进行两次灭菌，然后将灭菌罐一更换为灭菌罐二，使用灭菌功能以水冲洗毛细管至少三次。在显微操作软件中，新建一个实验，并从自动和手动选择模式中选择挑取实验的类型。

配置甲板托盘，指定灭菌罐、缓冲罐和沉积托盘的位置，并将所选沉积托盘中液体罐的温度设置为四摄氏度。将含有释放的CTC溶液的超低吸附板置于显微操作仪柜内显微镜下方。取下培养板盖，关闭操作柜。

将每孔含有20 µL CTC培养基的384孔板离心，确保培养基完全沉降至各孔底部，并将该孔板放入4 °C指定存放托盘的目标位置。手动选择用于挑取的显微镜物镜以及所有必要通道的曝光时间。选择“显示孔导航器”以查看并选定挑取用孔板的类型。

然后，在视野中心无细胞的CTC溶液所在孔的中央校准拾取位置。使用传感器轻轻将毛细管接触培养板底部，并将拾取位置设定在培养板底部上方0.05毫米处。每次小心地将机械臂降低10微米，以避免损坏毛细管。

选择细胞类型和拾取参数。对于单细胞拾取，请选择手动模式。使用操纵杆在孔内移动玻璃毛细管，并将毛细管置于距离孔边缘至少一毫米处的目标单个细胞上方。

然后手动添加颗粒，并选择“激活颗粒挑选”以开始挑选。当所有细胞都被选中后，离心培养板，使细胞沉淀至各孔底部。使用抗上皮细胞黏附分子抗体进行生物氨基染色，可清晰地区分CD45阳性事件，从而在悬浮液中准确识别癌细胞。

精确的CTC分离表现为仅吸取目标细胞，而不吸取周围的污染细胞。正如所预期的，与单个CTC相比，CTC细胞簇在体外培养56天内表现出更强的存活能力。值得注意的是，CTC细胞簇也具有更高的增殖速率，因此最终细胞数量更高，表明肿瘤细胞之间的直接接触会影响肿瘤细胞的存活率和增殖速率。

直接从乳腺癌患者体内分离的循环肿瘤细胞（CTCs）进行单细胞RNA测序，揭示了来源于单个CTC、CTC簇或CTC-白细胞簇的单细胞的t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图谱。请务必安装玻璃毛细管以去除显微操作仪流体系统中的气泡，并校准拾取位置，以确保高效地进行单细胞捕获。这些单细胞可被接种培养，或进一步用于下一代测序，从而实现体外分析，并在单细胞分辨率下对CTC进行表征，以研究转移过程。