循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

该协议特别相关，因为它允许从混合细胞池中检测和选择单个细胞，以便以单个细胞分辨率进行后续下游分析。这项技术的主要优点是有可能将单个循环肿瘤细胞（CTCs）从血细胞中分离，用于一系列需要高纯度的分析。首先启动微操纵器软件并打开微操纵器。

将微操纵器连接到计算机，然后单击"连接和初始化设备"，在显微镜阶段初始化机械臂。用乙醇清洁保护柜的外部和内部表面，并在机器每次操作后关闭保护柜，以便能够通过计算机操纵设备。在机械臂上安装新的 20 到 30 微米玻璃毛细管，并通过系统冲洗系统机油，以清除油管中的任何气泡。

用70%乙醇填充灭菌罐一，用无菌无核酸水填充灭菌罐2，用无菌Dulbecco的PBS填充缓冲罐。用70%乙醇对毛细管进行两次消毒，用消毒罐二次更换消毒罐，使用灭菌功能在水中清洗毛细管至少三次。在微操纵器软件中，开始新的实验，从自动和手动选择模式中选择采摘实验的类型。

配置甲板托盘以指定灭菌罐、缓冲罐和储液盘的位置，并设置所选沉积托盘中液体罐的温度为 4 摄氏度。将包含释放的 CTC 溶液的超低附件板置于微操纵器机柜内的显微镜下。从盘子上取下盖子并合上机柜。

每井将含有 20 微升 CTC 培养介质的 384 井板离心，以确保将介质隔离在每一个井的底部，并将该介质放入四摄氏度选定沉积托盘的目标位置。手动选择显微镜目标进行拣选，以及所有必要的通道的曝光时间。选择"显示井导航器"以可视化并选择拾取板的类型。

然后校准包含 CTC 溶液的井中间的拾取位置，而不在视野中心不带电池。使用传感器用毛细管轻轻触摸板的底部，将拾取位置设置为板底上方 0.05 毫米。小心地将机械臂一次降低 10 微米，以避免损坏毛细管。

选择单元格类型和领料参数。对于单单元拾取，选择手动模式。使用操纵杆在井内导航玻璃毛细管，将毛细管放在距离井边界至少一毫米的单个感兴趣电池的顶部。

然后手动添加粒子并选择"选取激活的粒子"以开始领料。当所有细胞被拾取后，将板离心，将每个井底部的细胞沉淀。具有抗上皮细胞粘附分子抗体的生物氨基染色允许癌细胞在悬浮液中的可视化，与CD45阳性事件有准确的区分。

精确的CTC隔离的特点是只吸入所需的目标，而不产生周围的污染物细胞。正如所怀疑的，CTC集群表明与单一CTC相比，存活率增加，在体外培养的56天内产生细胞菌落。值得注意的是，CTC组也表现出较高的增殖率，从而达到更高的最终细胞数，表明与其他肿瘤细胞的直接接触对肿瘤细胞的生存能力和增殖率都有影响。

从乳腺癌患者中直接分离出的CTC的单细胞RNA测序揭示了从单CTC、CTC簇或CTC白细胞簇衍生的单细胞的T-分布式随机邻域嵌入。请记住安装玻璃毛细管，以清除微操纵器流体系统中的气泡，并校准拾取位置，以确保高效的单单元拾取。单细胞可以播种或进一步处理下一代测序，使单细胞分辨率的外维分析和CTC表征，以调查转移过程。