Name: 循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 学习使用机器人微操作技术从混合细胞群中分离单个循环肿瘤细胞，结合活细胞免疫染色进行高纯度单细胞分析，评估其转移潜能和分子特征，为癌症转移研究提供精准方法。

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我们感谢所有为本研究捐献血液的患者，以及所有参与的临床医生和研究护士。我们感谢来自ALS Automated Lab Solutions GmbH的Jens Eberhardt、Uwe Birke和Katharina Uhlig博士提供的持续支持。我们感谢Aceto实验室所有成员给予的反馈和讨论。Aceto实验室的研究工作得到了欧洲研究理事会、欧洲联盟、瑞士国家科学基金会、瑞士癌症联盟、巴塞尔癌症联盟以及通过苏黎世联邦理工学院和巴塞尔大学获得的巴塞尔两州的支持。

所有涉及患者血液样本的操作均在获得参与者签署的知情同意书后进行。操作按照伦理与机构审查委员会（瑞士西北/中部伦理委员会[EKNZ]）批准的方案EKNZ BASEC 2016-00067和EK 321/10执行，并符合《赫尔辛基宣言》的要求。
所有涉及动物的实验操作均遵循机构及州级指导原则（已批准的小鼠实验方案编号 #2781，巴塞尔城市州动物卫生办公室）。
1. 患者样本制备
<ol>
	<li>开始前，确保使用无菌溶液和材料，以在整个操作过程中维持无菌状态。</li>
	<li>从乳腺癌患者体内抽取7.5 mL外周血，注入10 mL EDTA采血管中。</li>
	<li>将含有血液的采血管在室温（RT）下置于摇床中，以每分钟40次振荡（osc/min）的频率短暂孵育（不超过1小时）。</li>
	<li>采用选定的CTC分离方法富集单个CTC及CTC细胞簇21,22,23,25，并将CTC释放至1×DPBS溶液中。 
	注意：根据所选CTC富集技术的不同，样本中可能残留白细胞和红细胞&#160;。应调整释放压力，以保持CTC细胞簇的结构完整性。</li>
	<li>立即进入第3节的下一步操作。</li>
</ol>
2. 小鼠样本制备
<ol>
	<li>开始前，准备好一支带有25G针头的1 mL胰岛素注射器、过滤后的5 mM EDTA溶液以及2 mL EDTA抗凝采血管。</li>
	<li>确保使用无菌溶液和材料，以在整个操作过程中维持&#160;无菌状态。</li>
	<li>用5 mM EDTA溶液预冲洗注射器。</li>
	<li>向注射器中吸入100 μL的5 mM EDTA溶液，并排除气泡。</li>
	<li>通过吸入80% CO2 / 20% O2气体处死小鼠，随后立即进行下一步操作。 
	注意：除CO2吸入法外，也可采用异氟烷麻醉（3 vol%异氟烷与氧气（载气）以600 mL/min流速）后行颈椎脱臼，或注射过量的氯胺酮/赛拉嗪溶液。具体安乐死方法可能根据批准的小鼠实验方案而有所不同。</li>
	<li>通过观察呼吸活动消失、角膜反射缺失以及无外界刺激下的排尿现象，确认动物死亡。</li>
	<li>进行心脏穿刺时，将预先装有EDTA的注射器针头以30°角从胸骨方向小心插入胸腔，朝向心脏进针。 
	注意：对于经验不足的操作者，建议先打开胸腔，以便更清晰地观察心脏，再进行心脏穿刺。</li>
	<li>采集最多1 mL血液。在不松开活塞的情况下，将注射器从小鼠胸腔中拔出，安全卸下针头，打开2 mL EDTA抗凝采血管盖，直接将血液排入管中。盖紧管盖后轻轻倒置混匀10次。</li>
	<li>将含有血液的采血管置于室温下，在摇床（40次/分钟振荡）上短暂孵育（最长1小时）。 
	警告：针头必须丢弃于防刺穿的生物危害锐器盒中。 
	注意：可进行多次穿刺以增加总采血量。每次采血应使用单独的、预先装有EDTA的注射器，避免吸入前次采血针头中已凝固的血液。</li>
	<li>采用所选的循环肿瘤细胞（CTC）分离方法富集单个CTC及CTC细胞簇21,22,23,25，并将CTC释放至1x DPBS溶液中。 
	注意：根据所选CTC富集技术的不同，样本中可能仍残留白细胞和红细胞。调整释放压力，以保持CTC细胞簇的结构完整性。</li>
	<li>立即进入第3节的下一步操作。 
	注意：所有后续操作均需使用未经固定且新鲜分离的血液样本。</li>
</ol>
3. 循环肿瘤细胞活体免疫染色
<ol>
	<li>将CTC富集的细胞悬液在72 ×g 条件下离心4分钟。 
	注意：如果转子直径为100 mm，则72 ×g 相当于800 rpm。请根据所用转子的实际参数换算相对离心力。</li>
	<li>将沉淀物轻柔重悬于500 μL含1% BSA的1× DPBS溶液中，并加入2 μg/mL抗人EpCAM-AF488抗体和1 μg/mL抗人CD45-BV605抗体，或2 μg/mL抗小鼠CD45-BV605抗体。 
	注意：对于乳腺癌患者来源的CTCs，可在抗EpCAM和抗CD45的基础上额外加入抗人EGFR-FITC和抗人HER2-AF488抗体，以更有效地识别EpCAM表达水平较低的CTCs。</li>
	<li>室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>用1 mL含1% BSA的1× DPBS溶液洗涤CTC悬液，并在72 ×g 条件下离心4分钟。重复此洗涤步骤两次。</li>
	<li>将染色后的细胞重悬于2 mL含1% BSA的1× DPBS溶液中，然后将全部体积转移至6孔超低吸附培养板的1个孔中。</li>
	<li>将培养板置于4 °C避光孵育10–15分钟，以使CTCs及残留血细胞充分沉降。</li>
</ol>
4. 循环肿瘤细胞的显微操作与单细胞挑选
注意：开始之前，请注意显微操作仪需要最多45分钟完成全部设置。设置完成后，每枚循环肿瘤细胞（CTC）（或细胞簇）的识别与显微操作过程最多需要2分钟。
<ol>
	<li>确保在染色结束后2小时内完成CTC挑取操作。</li>
	<li>启动显微操作仪软件并打开显微操作仪。将显微操作仪连接至计算机，然后依次点击Connect按钮和Int device按钮，以初始化机械臂和显微镜载物台。</li>
	<li>每次操作设备后，应关闭保护柜，以便通过计算机控制设备运行。</li>
	<li>使用乙醇喷洒并擦拭柜内表面，清除灰尘和溅出物。洁净的环境可确保操作过程的无菌性。</li>
	<li>在机械臂上安装新的玻璃毛细管。单细胞挑取时使用20–30 μm毛细管，CTC细胞团簇挑取时建议使用30–50 μm毛细管。</li>
	<li>通过排液或抽吸系统油的方式去除管路中的所有气泡。 
	警告：玻璃毛细管尖锐且易碎，请小心操作。</li>
	<li>在灭菌罐1中加入70%乙醇，灭菌罐2中加入无菌无核酸酶的H2O，缓冲罐中加入无菌1× DPBS。 
	警告：请勿盖上罐体盖子，因为在后续步骤中毛细管需自由进入各罐。</li>
	<li>使用70%乙醇对毛细管进行两次灭菌处理。</li>
	<li>将灭菌罐1替换为灭菌罐2，并使用灭菌功能在H2O中至少清洗毛细管三次。</li>
	<li>使用显微操作仪软件启动新实验，并在自动选择模式和手动选择模式之间选择挑取实验类型。 
	注：根据操作的最终目标选择实验类型。手动模式允许在毛细管进入细胞悬液后操控机械臂，此步骤对于将CTC细胞团簇解离为单个细胞是必要的。实验过程中可更改挑取类型。</li>
	<li>配置台面托盘，明确灭菌罐（液体1）、缓冲罐（液体2）以及沉积托盘（目标1或2）的位置。目标1用于向孔板中沉积，目标2用于向PCR管或PCR板中沉积。</li>
	<li>将所选液体罐和沉积托盘的温度设置为4 °C。 
	注：挑取过程可能耗时较长，因此建议对液体罐和沉积托盘进行冷却。</li>
	<li>将含有释放后CTC溶液的超低吸附孔板置于显微操作仪柜内的显微镜下。移除孔板盖子并关闭柜门。在后续设置及挑取过程中，保持孔板处于室温。</li>
	<li>手动选择用于挑取的显微镜物镜（10–20×）以及所有必要通道（明场、FITC和TRITC通道）的曝光时间。</li>
	<li>从工具栏中选择show well navigator，以可视化并选择挑取孔板类型（6孔板）。 
	注：任何孔板或孔型格式仅可由制造商安装。</li>
	<li>在含有CTC溶液的孔中央进行挑取位置校准，但视野中心区域应无细胞。若在孔边缘进行校准，由于孔底表面不平整，可能导致校准错误。</li>
	<li>使用传感器以0.01 mm/步的速度和1%的速度，使毛细管轻轻接触孔板底部。</li>
	<li>将挑取位置设置为孔板底部上方0.05 mm处。 
	注：继续操作前，请确保打开并移除所有孔板和罐体的盖子。毛细管可能因触碰闭合或未移除的盖子而断裂。 
	警告：若毛细管接触盖子时断裂，周围环境或溶液中可能残留碎玻璃。</li>
	<li>选择细胞类型和挑取参数。挑取参数可在每次启动时进行设置和加载。单细胞挑取时选择手动模式。</li>
	<li>在挑取准备设置中：
	<ol>
		<li>将系统油与样本之间的气隙体积设置为1 μL</li>
		<li>将每次挑取前吸取缓冲液体积设置为0.5 μL。 
		注：缓冲液体积需根据最大总挑取体积进行调整。小体积不会影响挑取或沉积效率。</li>
		<li>将缓冲液抽吸速度设置为1–6%。</li>
		<li>设置缓冲液抽吸后的等待时间为1秒。 
		注：如有需要，可选择从目标孔而非缓冲液罐中吸取缓冲液。</li>
		<li>设置为重复使用玻璃毛细管和挑取间不进行灭菌。 
		注：如需要，可在挑取间手动进行灭菌。挑取间可在H2O中多次清洗，或先在乙醇中灭菌两次，再在H2O中多次清洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在挑取设置中：
	<ol>
		<li>调整挑取过程中的相机设置及显微镜下的曝光时间为7,500 μs。</li>
		<li>选择固定挑取高度。 
		注：也可选择工具传感器或自动对焦功能。然而，孔板的微小缺陷可能干扰传感器或自动对焦的灵敏度，导致毛细管撞击孔板。</li>
		<li>将毛细管进入源孔板的抽吸速度设置为7–15%。</li>
		<li>启用交互式挑取功能。</li>
		<li>将抽吸体积（μL）设置为0–0.05。</li>
		<li>将抽吸速度设置为5%。</li>
		<li>将抽吸后的等待时间（秒）设置为0–1。</li>
		<li>将每根毛细管挑取颗粒数设置为1。</li>
		<li>设置不在同一位置多次挑取和不进行刮擦功能。抽吸参数必须根据实验类型进行设置（例如，自动挑取模式可能需要更大的抽吸体积）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在沉积设置中： 
	注：沉积参数严格取决于所使用的沉积孔板或试管。
	<ol>
		<li>单细胞挑取时，将毛细管进入目标孔板的速度设置为25%。</li>
		<li>将排液速度设置为6%。</li>
		<li>将排液后的等待时间（秒）设置为0。</li>
		<li>将排入目标孔的气隙量设置为100%。</li>
		<li>设置沉积后不冲洗。 
		注：沉积后可进行灭菌以清洁毛细管。</li>
		<li>将每孔最大沉积颗粒数及分配颗粒的目标数均设置为1。</li>
		<li>在目标1的A1位（用于孔板）或目标2的A1位（用于试管）校准沉积高度。将无盖的试管或孔板用于校准，并使用传感器以0.01 mm/步的速度和1%的速度轻轻接触沉积孔。将沉积高度设置为孔板底部上方1 mm处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在设置中：
	<ol>
		<li>将挑取过程中的载物台速度设置为5–10%。 
		注：载物台快速移动可能导致悬液中细胞移动，因定位不准而影响多次细胞挑取。</li>
		<li>设置灭菌参数：冲洗体积为1 μL，冲洗循环3次，每次灭菌循环等待时间为2秒。</li>
		<li>关闭前应用所有更改。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用操纵杆在孔内移动玻璃毛细管，将其置于目标单细胞上方。选择距离孔边缘安全距离（1 mm）的挑取位置，以避免毛细管在孔边缘断裂。</li>
	<li>通过操纵杆按钮或菜单手动添加颗粒。</li>
	<li>选择挑取已激活颗粒以开始挑取。</li>
	<li>由于交互式挑取（手动模式），毛细管将在距孔板底部0.05 mm处、所选挑取位置正上方停止。顺时针缓慢旋转操纵杆旋钮，手动抽吸颗粒及其周围的DPBS溶液。手动模式下最大体积不固定，但注射器允许的最大体积为25 μL。</li>
	<li>逆时针缓慢旋转操纵杆旋钮，排出多余的DPBS溶液或不需要的颗粒。过度排液会导致注射器气隙释放，在溶液中形成气泡，影响观察。</li>
	<li>按下next继续进行沉积。</li>
	<li>观察毛细管进入沉积用PCR管或PCR板，释放液体后返回起始位置，毛细管为空。 
	注：若毛细管中仍有残留液体，应进行灭菌处理，然后在进行下一次挑取前重新检查设置、油位和油面高度。</li>
	<li>从第4节第26步开始进行下一次单细胞挑取。挑取过程中可能需要更换毛细管。安装新毛细管后，必须重新校准挑取位置。校准完成后，选择Apply calibrated changes in Z-height功能以更新沉积高度，使其与新毛细管的校准一致，从而跳过沉积高度校准步骤（第4.16节）。 
	注：第1–4节所述步骤适用于大多数CTC富集与分离方法。此处列出特定CTC分析的可选步骤。</li>
</ol>
5. 用于存活与增殖分析的单细胞挑选与接种
<ol>
	<li>确保使用无菌溶液和材料，以在整个操作过程中维持无菌状态。</li>
	<li>准备一个384孔板，用于培养经挑选的单个循环肿瘤细胞（CTC），每孔加入20 μL CTC培养基31。确保在操作后（例如，在384孔板中为10–20 μL）将CTC接种于少量培养基中。</li>
	<li>离心使溶液沉降至孔板底部。将384孔板放入目标位置1，并在4 °C下保存。</li>
	<li>按照第4节所述使用显微操作仪完成所有步骤，设置显微操作仪并开始新一轮的挑选。 
	注意：多次选择单个细胞将生成一个挑选列表。颗粒将按顺序逐一被挑选并沉积至连续的孔中（见第4.22.6节）。然而，交互模式（手动模式）会在吸取前立即停止毛细管，从而允许实验人员控制这一关键步骤，确保成功挑选。孔板的快速移动可能导致悬浮细胞移位，增加多细胞挑选的难度。</li>
	<li>完成沉积后，重复步骤4以开始下一轮挑选。</li>
	<li>挑选结束后，将孔板在72 ×g 条件下离心4分钟，以确保所挑选的细胞沉降至孔底。</li>
</ol>
6. 用于测序的CTC簇解聚与单细胞挑选
<ol>
	<li>确保使用无菌溶液和材料，以在整个操作过程中维持无菌状态。</li>
	<li>准备单个 PCR 管或 PCR 板，用于盛装破碎后的单个细胞，每管/孔加入总量为 2.5 μL 的细胞裂解液，其中包含 1 U/μL 的 RNA 抑制剂。</li>
	<li>短暂离心，使溶液完全沉降至管底。将盛放容器放入目标位置 2，并置于 4 °C 保存。</li>
	<li>使用显微操作仪执行第 4 节中描述的所有步骤，以设置显微操作仪。</li>
	<li>开始新一轮挑选。由于采用交互式挑选（手动模式），毛细管将停止在培养板底部上方 0.05 mm 处，并位于选定的 CTC 簇正上方。</li>
	<li>顺时针缓慢旋转操纵杆旋钮，手动吸取 CTC 簇及其周围的 DPBS 溶液。逆时针缓慢旋转操纵杆旋钮，释放已吸取的液体（包括 CTC 簇）。</li>
	<li>重复第 6 步中所述的 CTC 簇吸取与释放操作，直至构成簇的单个细胞完全分离。 
	注意：过度释放可能导致注射器内空气间隙释放，在溶液中形成气泡，从而影响视野清晰度。</li>
	<li>用肉眼追踪单个细胞的位置。通过操纵杆按钮或从菜单中手动选择，添加目标颗粒。 
	注意：多次选择单个细胞将生成一个挑选列表。颗粒将按顺序逐一被挑选并沉积至连续的 PCR 管/孔中（见第 4.22.6 节）。然而，交互模式（手动模式）会在吸取前使毛细管停止，从而允许实验人员控制这一关键步骤，确保成功挑选。</li>
	<li>选择 pick activated particles 以启动挑选过程。 
	注意：所加细胞裂解液的量足以使单个细胞完全裂解。但裂解产物长时间暴露于裂解剂中可能导致 DNA 或 mRNA 降解。因此，应立即进行下一步操作。</li>
	<li>立即封闭含有已挑选单细胞的管子，并转移至干冰中进行速冻。</li>
	<li>短暂离心管子，并检查管壁是否无液滴残留，以确保沉积的细胞充分裂解。</li>
	<li>从第 5 步开始重复操作，以进行下一轮挑选。 
	注意：显微镜载物台将按照第 4.23.1 节所述速度在已添加的颗粒之间移动。超低吸附板中的 CTC 悬液可能发生位移，导致因定位不准而出现错误挑选。</li>
</ol>
7. 用于小鼠注射的CTCs分离
<ol>
	<li>确保使用无菌溶液和材料，以在整个操作过程中维持无菌状态。</li>
	<li>准备一个含有 5 μL 无菌 1x DPBS 的 PCR 管。</li>
	<li>短暂离心，使溶液完全沉降至管底。将沉积容器放入目标孔 2 中，并置于 4 °C 保存。</li>
	<li>在 沉积 设置中，对步骤 4.22.6 进行如下修改：将 每孔最大沉积颗粒数 设为 1,000，将 用于分配颗粒的目标数量 设为 1。此步骤可确保所挑选的细胞被重复沉积至同一管中达 1,000 次。</li>
	<li>仅使用交互模式（手动模式）以精确控制挑选过程，并确保所收集的溶液不被其他细胞污染。 
	注意：若需要收集超过 1,000 个细胞，应增加 用于分配颗粒的目标数量，以避免在达到 1,000 个细胞后造成样本损失。</li>
	<li>继续执行第 4.26 节中的步骤以开始新一轮挑选。重复步骤 6 以进行多次挑选。每次挑选时需记录所收集的细胞数量，以便追踪可用于小鼠注射的细胞总数。</li>
	<li>挑选结束后，在 72 ×g 条件下离心 4 分钟（参见第 3.1 节），并吸除上清液。</li>
	<li>将收集的循环肿瘤细胞（CTCs）重悬于适合小鼠注射的缓冲液中。对于乳腺脂肪垫注射，将收集的 CTCs 以 1:1 的比例重悬于 1x DPBS 与重构的基底膜提取物中，并在注射前保持于 4 °C。对于静脉注射，则仅使用 DPBS 重悬收集的 CTCs。 
	注意：溶液的体积严格取决于将要注射的 CTCs 数量。建议每只小鼠乳腺脂肪垫或静脉注射的体积不超过 100 μL。计算体积时，务必考虑操作过程中的死体积以及注射器装载所需的额外体积。</li>
</ol>

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</ol>

N.A. 和 B.M.S. 被列为与循环肿瘤细胞及癌症治疗相关的专利申请中的发明人。N.A. 为对液体活检感兴趣的制药公司和保险公司提供有偿咨询服务。

对循环肿瘤细胞（CTCs）进行分子表征有望加深我们对转移过程的理解，并指导新型抗转移疗法的开发。本文详细描述了可用于CTC显微操作及后续分析的实验方案，包括基于单细胞的功能检测、基因表达分析以及用于评估转移潜能的体内移植实验20。
在本实验方案的诸多关键步骤中，对循环肿瘤细胞（CTC）富集产物进行显微操作旨在从相对异质的细胞悬液中获得单细胞分辨率，从而实现最高水平的纯度，并提升后续功能或分子分析的质量。例如，单个CTC的挑取已使我们及他人能够从分子层面以及转移起始能力评估的角度，研究CTC的异质性（如单个CTC、CTC细胞簇以及CTC-白细胞簇之间的差异）。尽管我们通常更倾向于采用允许实验人员手动分离CTC的细胞挑取方案（即根据各个目标细胞的特性提供更高灵活性），但目前已有自动化解决方案可用于辅助细胞挑取，并在受控良好的实验中加速CTC的分离过程。
在循环肿瘤细胞（CTC）分析背景下进行单细胞显微操作时，时间是一个极为关键的限制因素。由于本方案旨在对活细胞进行操...

远处器官转移的临床表现为癌症进展的最终阶段，导致超过90%的癌症相关死亡1。 从局部肿瘤发展为转移性疾病是一个多步骤过程，通常由循环肿瘤细胞（CTC）介导2,3,4。这些细胞从原发性肿瘤脱落进入血液循环，并被运输至远处器官，在那里可能穿出血管并形成转移病灶5,6。尽管实体瘤可释放相对大量的CTC，但大多数CTC注定会死亡，原因包括循环中的高剪切力、失巢凋亡介导的细胞死亡、免疫攻击，或适应异源微环境的能力有限7。因此，建立能够解析具有转移播种能力的CTC分子特征的工具至关重要。近期的临床前和临床研究表明，单个CTC及CTC簇的存在和数量与多种实体瘤患者的不良预后相关8,9,10,11,12,13,14。 CTC簇是指在循环过程中两个或更多相互黏附的CTC，其形成转移的能力较单个CTC更强3,15,16。簇内细胞通过桥粒和黏附连接维持强烈的细胞间黏附，这可能有助于抵抗失巢凋亡17,18。最近，我们观察到CTC的成簇现象与干性相关和增殖相关转录因子结合位点的低甲基化有关，从而增强了成功启动转移的能力19。CTC簇的解离会导致关键结合位点的重塑，进而抑制其转移潜能19。除了癌细胞簇外，CTC还可与白细胞（最常见为中性粒细胞）结合，以在循环中维持高水平的增殖，并增强其转移能力20。然而，CTC的生物学特性仅被部分阐明，仍有许多问题尚未解决，包括单个CTC和成簇CTC的潜在分子特征及其脆弱性。
近年来，已建立多种策略，利用循环肿瘤细胞（CTCs）的细胞表面表达模式及其物理特性进行分离。21,22,23,24,25抗原依赖性分离方法主要依赖于细胞表面上皮细胞黏附分子（EpCAM）的表达26目前最常用且唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的循环肿瘤细胞（CTC）计数平台是CellSearch系统，该系统基于两步法分离CTCs21第一步，通过离心去除血浆成分，同时利用与抗EpCAM抗体偶联的磁性纳米颗粒捕获循环肿瘤细胞（CTCs）。第二步，对富集CTCs的溶液进行染色，以识别表达细胞角蛋白（CK）且细胞核阳性（DAPI阳性）的细胞。8,18,19，而白细胞（WBCs）则通过泛白细胞标志物CD45进行识别。最后，捕获的细胞被置于集成的筛查平台上，循环肿瘤细胞（CTCs）通过表达EpCAM、CKs和DAPI且不表达CD45来鉴定。尽管该方法被公认为CTC计数的金标准，但由于CTC回收存在固有的技术限制，该技术在后续分子分析方面面临挑战。此外，鉴于其分离流程，CellSearch&#160;可能有利于富集EpCAM水平较高的循环肿瘤细胞（CTCs），相比之下，EpCAM表达水平较低的CTCs则可能被低估，例如由于肿瘤异质性所致27 或上皮标志物的下调28,29为克服这些局限性，抗原非依赖性的循环肿瘤细胞（CTCs）富集技术应运而生。例如，CTC-iChip 首先通过流体动力学方法将有核细胞（包括 CTCs 和白细胞）从其他血液成分中分离，随后利用免疫磁性技术去除抗体标记的白细胞，从而在溶液中实现未标记且具有活性的 CTCs 的纯化25此外，由于大多数循环肿瘤细胞（CTCs）的体积略大于红细胞（RBCs）或白细胞（WBCs），这推动了基于细胞大小的CTC富集技术的发展。23,30 （例如 Parsortix 系统（ANGLE）），该系统采用基于微流控的技术，其分离盒内含一个逐渐变窄的通道，最终通向一个终端间隙，间隙尺寸可为 10、8、6.5 或 4.5 µm（具体尺寸根据目标癌细胞的预期直径选择）。大多数血细胞可穿过该狭窄间隙，而循环肿瘤细胞（CTCs）由于体积较大（同时也因其变形能力较低）被截留，从而保留在分离盒中。通过反转流体方向，可释放被捕获的 CTCs，这些细胞仍处于活体状态，适用于后续分析。然而，无论采用何种 CTC 分离方案，典型的富集后操作仍会得到与少量红细胞（RBCs）和白细胞（WBCs）混合的 CTCs，这使得对单一或群体纯 CTCs 的分析具有挑战性。为解决这一问题，我们建立了一种工作流程，可在无血液细胞污染引入潜在偏差的情况下实现 CTCs 的操控。预先进行免疫染色（可选用不同抗体组合），可将 CTCs 与血细胞区分开，甚至可识别具有不同表面标志物表达谱的 CTC 亚群。这一高度可定制的流程还可进一步与特定的下游应用相结合。
本文介绍了一种工作流程，该流程从循环肿瘤细胞（CTC）富集产物（可通过任意选定的CTC富集技术获得）开始，结合多种方法，在单细胞分辨率水平上深入解析CTC的生物学特性。简而言之，我们的工作流程首先通过活细胞免疫染色识别单个CTC、CTC簇以及CTC-白细胞（WBC）簇，随后进行单细胞显微操作，并进一步开展体外（ex vivo）培养、单细胞测序以及体内（in vivo）转移实验等下游分析。

<table><tbody><tr><td>抗人 EpCAM-AF488</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST5198</td><td>克隆：VU1D9</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>无钙，无镁</td></tr><tr><td>6 孔超低吸附培养板</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td>304041</td><td>克隆：HI30</td></tr><tr><td>抗人 EGFR-FITC&amp;nbsp;</td><td>GeneTex</td><td>GTX11400</td><td>克隆：ICR10</td></tr><tr><td>抗人 HER2-AF488&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>324410</td><td>克隆：24D2</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45-BV605</td><td>Biolegend</td><td>103139</td><td>克隆：30-F11</td></tr><tr><td>BD Vacutainer K2EDTA</td><td>BD</td><td>366643</td><td>用于人血液采集</td></tr><tr><td>Cell Celector</td><td>ALS</td><td>CC1001</td><td>核心单元&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CellD 软件</td><td>ALS</td><td></td><td>版本 3.0</td></tr><tr><td>Cultrex PathClear 低生长因子 BME，2 型</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>1.3 mL K3EDTA 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>41.3395.005</td><td>用于小鼠血液采集</td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus</td><td>Quiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&amp;nbsp; In RNase 抑制剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2696</td><td>&amp;nbsp;1 U/&amp;micro;L&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

血源性转移是导致&#160;大多数癌症相关死亡与循环肿瘤细胞（CTCs）在远端部位成功形成新肿瘤有关。CTCs在患者血液中以单个细胞（单个CTCs）或多种细胞聚集物（CTC簇及CTC-白细胞簇）的形式存在，其中后者具有更强的转移能力。除计数外，对CTCs进行表型和分子分析对于解析其生物学特性并识别可靶向的脆弱环节至关重要。本文详细描述了一种包含CTC免疫染色与显微操作的工作流程， 离体 培养以评估&#160;单个细胞的增殖与存活能力，以及 体内 转移形成实验。此外，我们提供了一种将循环肿瘤细胞（CTC）簇解离为单个细胞并研究簇内异质性的实验方案。通过这些方法，例如，我们可精确量化单个CTC以及CTC簇内单个细胞的存活能力和增殖潜能，从而观察到簇内细胞在存活和增殖方面表现更优 离体 与单个CTC相比，CTC细胞团具有更强的特性。总体而言，我们的工作流程提供了一个在单细胞水平上解析CTC特征的平台，旨在识别与转移相关的通路，并更深入地理解CTC生物学。

本方案可实现循环肿瘤细胞（CTC）的单个分离，既可从单个CTC中分离，也可从CTC细胞簇中分离。来自患者或荷瘤小鼠的CTC可通过现有的CTC富集方法从全血中富集，随后使用针对癌症相关标志物（如EpCAM，绿色）和白细胞特异性标志物（如CD45，红色）的抗体进行染色（图1A）。染色后的CTC样本随后转移至显微操作工作站，对单个细胞进行挑选，将其沉积到PCR管或多孔板中，并进行后续分析，包括单细胞测序、体外培养或体内实验（图1B）。
该方法的可靠性取决于手动挑选细胞时对靶细胞的准确识别。使用抗EpCAM抗体对细胞悬液进行活细胞免疫染色，可使癌细胞可视化，从而与CD45阳性事件（最可能为白细胞）实现精确区分（图2A）。当CellCelector经...

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。

血液传播性转移是大多数癌症相关死亡的原因，其过程涉及循环肿瘤细胞（CTCs），这些细胞能够成功定植并形成新的病灶……

该方案具有重要意义，因为它能够从混合细胞群体中检测并分离单个细胞，进而实现单细胞分辨率的下游分析。该技术的主要优势在于能够将循环肿瘤细胞（CTCs）从血细胞中单独分离出来，适用于多种需要高纯度样本的分析。首先启动显微操作仪软件，然后打开显微操作仪。将显微操作仪连接至计算机，点击“连接并初始化设备”以在显微镜载物台上初始化机械臂。每次操作设备后，均需用乙醇清洁防护柜的内外表面，并关闭防护柜，以便通过计算机操控设备。在机械臂上安装一根新的20至30微米玻璃毛细管，并通过系统冲洗系统油，以清除管路中的任何气泡。用70%乙醇填充灭菌罐一，用无菌无核酸酶水填充灭菌罐二，用无菌杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）填充缓冲液罐。用70%乙醇对毛细管进行两次灭菌，然后将灭菌罐一更换为灭菌罐二，使用灭菌功能以水冲洗毛细管至少三次。在显微操作软件中，新建一个实验，并从自动和手动选择模式中选择挑取实验的类型。配置甲板托盘，指定灭菌罐、缓冲罐和沉积托盘的位置，并将所选沉积托盘中液体罐的温度设置为四摄氏度。将含有释放的CTC溶液的超低吸附板置于显微操作仪柜内显微镜下方。取下培养板盖，关闭操作柜。将每孔含有20 µL CTC培养基的384孔板离心，确保培养基完全沉降至各孔底部，并将该孔板放入4 °C指定存放托盘的目标位置。手动选择用于挑取的显微镜物镜以及所有必要通道的曝光时间。选择“显示孔导航器”以查看并选定挑取用孔板的类型。然后，在视野中心无细胞的CTC溶液所在孔的中央校准拾取位置。使用传感器轻轻将毛细管接触培养板底部，并将拾取位置设定在培养板底部上方0.05毫米处。每次小心地将机械臂降低10微米，以避免损坏毛细管。选择细胞类型和拾取参数。对于单细胞拾取，请选择手动模式。使用操纵杆在孔内移动玻璃毛细管，并将毛细管置于距离孔边缘至少一毫米处的目标单个细胞上方。然后手动添加颗粒，并选择“激活颗粒挑选”以开始挑选。当所有细胞都被选中后，离心培养板，使细胞沉淀至各孔底部。使用抗上皮细胞黏附分子抗体进行生物氨基染色，可清晰地区分CD45阳性事件，从而在悬浮液中准确识别癌细胞。精确的CTC分离表现为仅吸取目标细胞，而不吸取周围的污染细胞。正如所预期的，与单个CTC相比，CTC细胞簇在体外培养56天内表现出更强的存活能力。值得注意的是，CTC细胞簇也具有更高的增殖速率，因此最终细胞数量更高，表明肿瘤细胞之间的直接接触会影响肿瘤细胞的存活率和增殖速率。直接从乳腺癌患者体内分离的循环肿瘤细胞（CTCs）进行单细胞RNA测序，揭示了来源于单个CTC、CTC簇或CTC-白细胞簇的单细胞的t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图谱。请务必安装玻璃毛细管以去除显微操作仪流体系统中的气泡，并校准拾取位置，以确保高效地进行单细胞捕获。这些单细胞可被接种培养，或进一步用于下一代测序，从而实现体外分析，并在单细胞分辨率下对CTC进行表征，以研究转移过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

循环肿瘤细胞的微操作, 用于下游分子分析和转移电位评估

从癌症患者血液中分离循环肿瘤细胞，且不造成细胞损伤。通过使用E-选择素的双分子层表面以及针对上皮标志物的抗体，实现肿瘤细胞的分离。纳米管涂层可特异性促进癌细胞黏附，从而获得较高的捕获纯度。...

快速分离患者血液样本中具有活性的循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞（CTCs）已被证实对肿瘤转移具有重要作用。本文介绍了一种从同基因型小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。...

从小鼠癌症模型中分离与扩增循环肿瘤细胞

本论文描述了一种在肿瘤转移动物模型中定量肺部肿瘤细胞聚集的方法。...

肺肿瘤细胞募集实验

本方案描述了去硫代生物素、链霉亲和素和APTES系统的可定制化表面功能化方法，以分离特定的目标细胞类型。此外，本文还涵盖了该方法的应用、优化及验证过程。...

一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

本文介绍了一种利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）包被的微滤膜有效捕获活体循环肿瘤细胞（CTC）并实现温度响应性释放的实验方案。该方法可从患者血液中捕获CTC，并随后释放具有活性的CTC，用于后续的芯片外培养、分析与表征。...

从血液中捕获并释放可存活的循环肿瘤细胞

我们描述了通过将肿瘤细胞或类器官注射到小鼠盲肠中建立原位结直肠肿瘤模型，并从此模型中后续分离循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。...

结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

本方案旨在从含有非靶标背景细胞的混合物中分离并制备稀有靶细胞，用于单细胞水平的分子遗传学表征。所获得的DNA质量与未经处理的单细胞相当，适用于单细胞分析（包括基于筛查和靶向分析的应用）。...

靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游分析

这是一种用于筛选癌症转移抑制因子或驱动因子的有效方法。将携带表达文库的细胞注入鸡胚尿囊膜血管系统，以形成转移性克隆。对侵袭能力降低或增强的克隆进行分离、扩增，并重新注射以确认其表型，最后通过高通量测序进行分析。...

利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。...

循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

循环肿瘤细胞（CTCs）对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文介绍了一种高通量、一体化的CTC富集与单个CTC测序方案，在提高捕获效率和CTC纯度的同时，降低了污染风险和测序成本，从而推动了精准肿瘤学研究及临床应用的发展。...

基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

学习使用机器人微操作技术从混合细胞群中分离单个循环肿瘤细胞，结合活细胞免疫染色进行高纯度单细胞分析，评估其转移潜能和分子特征，为癌症转移研究提供精准方法。

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

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