Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die phänotypischen Eigenschaften und das Transplantationspotenzial von klonalen hämatopoetischen Stammzell- oder HSC-Vorläufern während der Embryonalentwicklung von Mäusen zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der entwicklungsbedingten Hämatopoese über die einzigartigen Abstammungsbeiträge klonaler HSC-Vorläufer während der Embryonalentwicklung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass hämogene Vorläufer auf Einzelzellebene analysiert werden.

Dies ermöglicht die Identifizierung der einzigartigen phänotypischen Eigenschaften, die seltene HSC-Vorläufer auszeichnen. Beginnen Sie mit der Zugabe von Aorta-Gonaden-Mesonephros, AGM, Geweben, die zwischen 9,5 und 11,5 Tagen nach dem Koitum von Embryonen präpariert wurden, in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter PBS enthält, ergänzt mit 10% FBS auf Eis. Wenn sich das Gewebe am Boden des Röhrchens abgesetzt hat, aspirieren Sie den Überstand und geben Sie sofort einen Milliliter 0,25 % Kollagenase zu den Proben.

Nach 25 Minuten in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad stoppen Sie die Reaktion mit einem Milliliter PBS plus FBS und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um das Gewebe 20 bis 30 Mal zu zerreiben, bis eine Einzelzellsuspension erhalten wird. Verdünnen Sie dann die Zellen mit acht weiteren Millilitern PBS plus FBS und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Blockierungspuffer für fünf Minuten auf Eis.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter des Antikörper-Cocktails von Interesse hinzu. Nach einer 15- bis 20-minütigen Inkubation auf Eis waschen Sie die Zellen in acht Millilitern PBS plus FBS und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter frischem PBS plus FBS. Filtern Sie die Zellen durch ein 35-Mikrometer-Zellsieb in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie das Sieb mit weiteren drei Millilitern PBS plus FBS, um alle Zellen zu sammeln und die Zellen erneut zu zentrifugieren.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern PBS plus FBS und legen Sie die Zellen auf Eis. Um die Gates für die Sortierung im Einzelzell- und Index-Sortiermodus einzustellen, laden Sie ein kleines Aliquot von Zellen auf das Durchflusszytometer und stellen Sie die Erfassung auf die niedrigste Flussrate ein. Öffnen Sie ein Diagramm für vorwärts gerichtete Streufläche im Vergleich zu einer seitlichen Streufläche, und legen Sie ein Gate fest, um Zellen unterschiedlicher Größe einzuschließen.

Öffnen Sie ein Diagramm für die Vorwärts-Streufläche im Vergleich zur Vorwärts-Streubreite und ein Diagramm für die Seiten-Streufläche im Vergleich zur Seitenstreubreite, und legen Sie in jedem Diagramm ein Gate fest, um die Dubletten auszuschließen. Legen Sie ein Verteilungsdiagramm für Vorwärts-Streufläche im Vergleich zu DAPI fest, um die lebenden Zellen zu begrenzen. Erstellen Sie dann ein antivaskuläres endotheliales Cadherin- versus anti-endotheliales Protein-C-Rezeptor-Plot und schleusen Sie die vaskulären endothelialen Cadherin-positiven und hochendothelialen Protein-C-Rezeptor-exprimierenden Zellen an.

Um die Aorta-Gonaden-Mesonephros-Zellen zu indexieren, legen Sie eine 96-Well-Platte, die mit AGM-Endothelzellen in AGM-serumfreiem Medium plus Zytokinen vorkultiviert wurde, in den Plattenblock des Durchflusszytometers und laden Sie die experimentelle Probe. Beginnen Sie mit der Probenerfassung und vergewissern Sie sich, dass der Indexsortiermodus für eine einzelne Zelle ausgewählt ist, um eine einzelne Zelle in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu sortieren. Wenn eine Zelle in jede Vertiefung der Platte einsortiert wurde, legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für bis zu sieben Tage eingestellt ist.

Am Ende der Co-Kultur-Periode können hämatopoetische Kolonien unterschiedlicher Größe und Morphologie mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Um die Klone mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die hämatopoetischen Zellen von den Endothelschichten zu dissoziieren, ohne die Endothelzellen abzulösen. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter Zellen in einzelne Vertiefungen einer neuen 96-Well-V-Bodenplatte und geben Sie die ursprüngliche 96-Well-Platte mit den restlichen 100 Mikrolitern Zellen in den Gewebekultur-Inkubator zurück.

Pelletieren Sie die Zellen in der V-Bodenplatte durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte in einer einzigen schnellen Bewegung umdrehen und schnippen. Resuspendieren Sie die Pellets in jeder Vertiefung mit 50 Mikrolitern Blockierungspuffer bei vier Grad Celsius. Geben Sie nach fünf Minuten den gewünschten Antikörpercocktail in jede Vertiefung für eine 20-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie am Ende der Inkubation jede Vertiefung mit 200 Mikrolitern PBS plus FBS und schnippen Sie die Platte am Ende der Zentrifugation, um den Überstand zu verwerfen. Resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern PBS plus FBS und analysieren Sie die Zellen gemäß den Standard-Durchflussanalyseprotokollen, um nach Kolonien zu suchen, die das Potenzial hämatopoetischer Stammzellen enthalten. Bei der Auswahl der Vertiefungen, die Zellen mit hämatopoetischem Stammzellphänotyp durch Flussanalyse enthalten, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die verbleibenden 100 Mikroliter Zellen aus der ursprünglichen Co-Kultur zu resuspendieren, und fügen Sie der vierten geretteten Knochenmarkzelle fünfmal 10 in 100 Mikrolitern PBS plus 2 % FBS in jede Vertiefung hinzu.

Nach dem adoptiven Transfer jedes Klons in einzelne letal bestrahlte kongene Empfängertiere sind in regelmäßigen Abständen nach der Transplantation periphere Blutproben von den transplantierten Tieren zu entnehmen. Um die Klone mit Langzeittransplantation zu identifizieren, analysieren Sie die Proben durch Durchflusszytometrie gemäß den Standardprotokollen der Durchflussanalyse. Die phänotypischen Eigenschaften jedes Klons können dann mit seinen Transplantationseigenschaften korreliert werden.

Prähämatopoetische Stammzellen können durch vaskuläre endotheliale Cadherin-Positivität und eine hohe Expression des endothelialen Protein-C-Rezeptors angereichert werden. Die Färbung mit anderen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern ermöglicht die retrospektive Analyse zusätzlicher phänotypischer Parameter, die für jede Zelle während der Indexsortierung erfasst werden können. Nach der Indexsortierung in Aorta-Gonaden-Mesonephros-Endothelzell-Cokulturen integrieren sich die einzelnen Klone in die Aorta-Gonaden-Mesonephros-Endothelzellschicht, bevor die Klone beginnen, sich zu verdichten und hämatopoetische Cluster zu bilden.

Nach fünf bis sieben Tagen Co-Kultur können Kolonien unterschiedlicher Größe und Morphologie nachgewiesen werden. Hier werden vier verschiedene Kolonien gezeigt, die nach Co-Kultur gewonnen wurden, wobei drei Kolonien unterschiedliche Anteile an phänotypischen hämatopoetischen Stammzellen zusammen mit anderen differenzierteren Zelltypen aufweisen und die vierte Kolonie keine Zellen mit hämatopoetischer Stammzellmarkerexpression aufweist. Der adoptive Transfer der Klonzellnachkommen ermöglicht die Beurteilung der langfristigen Multilinien-Transplantationsfähigkeit jedes Klons nach dem Beitrag des Spenders zu den myeloischen B- und T-Zellkompartimenten des peripheren Blutes des Empfängers im Laufe der Zeit.

Obwohl die meisten Kolonien, die Zellen mit einem hämatopoetischen Stammzellphänotyp enthielten, eine langfristige Transplantation erreichten, ist eine Transplantation notwendig, um eine funktionelle Transplantation mehrerer Linien zu bestätigen, da einige Klone die Transplantation im Laufe der Zeit verlieren. Das funktionelle hämatopoetische Stammzellpotenzial jedes Klons kann dann mit den ursprünglichen Indexsortierungsparametern des Klons korreliert werden, um seine genauen phänotypischen Eigenschaften zu identifizieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Sekundärkultur hämatopoetischer Nachkommen auf Stroma durchgeführt werden, die die B- und T-Zellentwicklung in vitro unterstützen, um zusätzliche Fragen zu den Lymphozytenpotenzialen einzelner hämogener Vorläufer zu beantworten.