Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen
31. März 2021
Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer gut charakterisierten Population menschlicher hämogener Endothelzellen. Diese Zellen können verwendet werden, um die molekulare Regulation und den endothelialen zu hämatopoetischen Übergang zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Kultivierung menschlicher embryonaler Stammzellen für vier Tage, um sie in primordiale Endothelzellen zu differenzieren.
Am fünften Tag saugen Sie das Medium über den Zellen ab. Anschließend waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter DMEM/F-12 pro Vertiefung. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Ersetzen Sie am sechsten und siebten Tag das Medium über den Zellen durch einen Milliliter frisch zubereitetes homogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Am achten Tag. Nach dem Ablösen und Waschen der Zellen teilen Sie sie gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 Mikroliter Zellen mit einer Dichte von 1 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter enthalten.
Fügen Sie den Röhrchen, die Zellen enthalten, gegebenenfalls Antikörper hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1000 mal G und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 600 Mikroliter eiskaltem Sortierpuffer.
Die Proben werden durch die Mesh-Filterkappe aus fünf Milliliter-FACS-Röhrchen gespannt und die Zellen lichtgeschützt auf Eis gelagert, um sie sofort zu sortieren. Um hämogene Endothelzellen durch FACS zu isolieren, wird zunächst die CD45-negative Zellpopulation gettert. Dann innerhalb der CD45-negativen Population, Gate die CD31-positiven Zellen.
Als nächstes innerhalb der CD31-positiven Population, Tor für die VE-Cadherin-negative Zellpopulation. Und dann innerhalb der VE-Cadherin-negativen Population, Tor für die c-Kit-positiven Zellen. Aus der c-Kit-positiven Population, Gate die CD34-positive Zellpopulation.
Und schließlich aus der CD34-positiven Zellpopulation identifizieren und sammeln Sie die KDR-positiven Zellen. Nach der Aussaat hämogener Endothelzellen in einem Methylcellulose-basierten Medium, das für das Wachstum von hämatopoetischen Vorläuferzellen formuliert ist, werden am achten Tag koloniebildende Einheit-erythroide Kolonien und explosionsbildende Einheit-erythroide Kolonien gezählt. Koloniebildende Einheit-Granulozyten-Makrophage und koloniebildende Einheit-Granulozyten, Erythroide, Makrophagen und Megakaryozyten.
Multipotente hämatopoetische Vorläuferkolonien werden am 14. Tag gezählt. Pro 1000 kologen Endothelzellen werden etwa 20 koloniebildende Einheiten erzeugt. Auch Zellen mit Endothelzellmorphologie sind in den Kulturen sichtbar.
Dies sind die hämogenen Endothelzellen, die auf Einzelzellebene hämatopoetische Vorläuferzellen mit mehreren Linien hervorbringen. Dieses Protokoll ist ein 2D-Serum- und Maus-Feeder-freies Kultursystem, das in etwa einer Woche menschliche hämogene Endothelzellen erzeugen kann.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer gut charakterisierten Population menschlicher hematogener endothelialer Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in etwa 1 Woche. Diese Zellen können verwendet werden, um die molekulare Regulation und den Übergang von Endothel zu hämatopoetischen Zellen zu untersuchen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zelldifferenzierung
- Stammzellenbiologie
- Hämatopoese
Hintergrund
- Humane pluripotente Stammzellen können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren.
- Hematogene endotheliale Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Blutbildung.
- Das Verständnis ihrer Differenzierung ist für die regenerative Medizin von entscheidender Bedeutung.
- Dieses Protokoll bietet einen optimierten Ansatz zur Erzeugung dieser Zellen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Differenzierung hematogener endothelialer Zellen zu etablieren.
- Die Forschung zum Übergang von Endothel zu hämatopoetischen Zellen zu erleichtern.
- Eine Ressource für die Untersuchung molekularer Mechanismen in der Hämatopoese bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung menschlicher embryonaler Stammzellen für vier Tage.
- Waschen der Zellen mit DMEM/F-12-Medium.
- Zugabe von hematogenem endothelialem Zelldifferenzierungsmedium.
- Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erzeugung hematogener endothelialer Zellen.
- Charakterisierung der differenzierten Zellpopulation.
- Einblicke in die molekulare Regulation der Hämatopoese.
- Potenzielle Anwendungen in der regenerativen Medizin und Krankheitsmodellierung.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet einen unkomplizierten Ansatz zur Erzeugung hematogener endothelialer Zellen.
- Es eröffnet Möglichkeiten für weitere Forschung in der Entwicklung von Blutzellen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methode aufbauen, um verschiedene hämatopoetische Störungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells addresses a critical bottleneck in modeling hematopoietic development and generating blood lineages ex vivo. This capability enables mechanistic de-risking of endothelial-to-hematopoietic transition and supports predictive confidence in early-stage cell therapy and regenerative medicine pipelines. The protocol's feeder-free, serum-free design enhances reproducibility and scalability for enterprise R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of molecular pathways governing endothelial-to-hematopoietic transition.
- Supports functional target validation for factors influencing blood lineage specification.
- Facilitates predictive de-risking of candidate targets in hematopoietic development.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, well-characterized cell population for downstream functional assays.
- Enables quantitative assessment of hematopoietic colony formation from defined progenitors.
- Supports reproducible screening of modulators affecting endothelial or hematopoietic fate.
Translational & Preclinical Research
- Establishes a platform for modeling disease-relevant hematopoietic defects in vitro.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation of blood cell generation strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of cell-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust generation and isolation of hemogenic endothelial cells for mechanistic studies and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on molecular regulation of blood lineage emergence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative colony-forming outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides flow cytometry-based gating and colony quantification for objective readouts.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical evaluation of hematopoietic potential.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, feeder-free system adaptable across stem cell lines and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in hematopoietic lineage modeling and target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell differentiation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for cell therapy and regenerative medicine programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of early-stage cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and differentiation protocols.
- Demands access to flow cytometry instrumentation for multi-parameter cell sorting.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and colony quantification.
- Adaptable to various human stem cell lines with protocol optimization.
- Dependent on validated antibody panels and methylcellulose-based functional assays.
